Introdução à técnica de CRISPR

[Música] [Aplausos] [Música] [Aplausos] [Música] [Aplausos] [Música] [Aplausos] Olá sejam todos muito bem-vindos ao universo da biologia molecular eu sou Eduardo Castanha e você está na Masterclass introdução a técnica de crisper algumas imagens que eu vou mostrar aqui Nesta aula elas foram retiradas deste livro aqui introdução técnica de Cristo do pesquisador Tiago Campos Pereira brasileiro seus colaboradores ele organizou esse livro então como eu usei várias imagens desse livro eu já tô deixando aqui a referência principal tá para não ter ficar colocando todas as imagens ali referência quando for imagem de fora do Livro eu coloco a

referência mas como Tem bastante do livro eu tô colocando já aqui citando o meu colega Thiago Campos Pereira beleza vamos lá fala do cronograma aqui rapidão só para você uma ideia de como a gente vai seguir a nossa aula hoje aula vai ter por volta de duas horas de duração contando com pergunta e resposta não quero passar disso quero um conteúdo de uma hora e meia se não ficar Cansativo demais eu vou tentar ficar ali mas meia horinha para essa introdução Que eu tô fazendo né uns 15 minutos para você introdução que eu tô fazendo

mais uns 15 minutos no final para a gente tirar dúvida E aí vai dar uma hora e meia mais ou menos de conteúdo então nós estamos nesse momento do nosso boas-vindas falando aqui da dinâmica cronograma da aula depois a gente vai falar dos conceitos iniciais sobre não só sobre a técnica chrisper mas o sistema crispray porque o sistema é técnica são as coisas diferentes eu Falar da função biológica do sistema e vou falar com uma técnica ela foi aplicada ela é utilizada em laboratório vou mostrar para vocês alguns casos eu não vou nessa ordem aqui

não é mais ou menos tá eu vou eu troquei um pouco ordem mas eu vou falar de alguns casos é ordinários utilizando o Cristo e depois a gente vai lá falar da técnica mesmo da nuclease caso RNA guia o DNA alvo os tipos de clivagem as vias de reparo eu vou falar um pouquinho das variantes Vou falar das aplicações do chrisper Além da edição final dessa aula você vai ter o entendimento sobre Cristo as suas principais aplicações e portanto você vai ser um profissional mais Versátil você vai ter uma informação Extra aí na sua na

sua caixa de ferramenta munida dessa informação você vai poder dar o próximo passo que você quiser quer se aprofundar em Cristo quer fazer um curso que ela é um livro você quer fazer o quê quer aprender mais sobre biologia Molecular você vai ter você vai poder dar o próximo passo uma das dificuldades que a gente tá aprendendo algo é dar o primeiro passo a gente saber pô por onde eu começo eu vou começar por um livro de as é difícil é um vídeo mal feito no YouTube não fala então é difícil às vezes começar mas

depois que você tem a base você consegue vai ajudar o próximo passo consequentemente né Isso vai e vai cascateando coisas boas na sua vida profissional você vai estar mais Capacitado para ler publicação para fazer publicação de melhor qualidade vai ter maior chance consigo um emprego uma chance passar num concurso são coisas boas que você traz para sua vida profissional né mas é preparado para estudar mais preparado para entender o que você tá estudando para fazer aula Se você for fazer aula apresentar alguma coisa aí na faculdade onde você tiver trabalhando e entender novas tecnologias e

aí a gente pode Começar pega esse raciocínio aqui ó olha que interessante é o contexto para a gente entender a técnica de Cristo e a importância dela tal o tempo das antigas aqui talvez tenha me ouvido falar só que já essa frase nem tudo na vida é genético que até a plaquinha que tá ali Acho que não vai dar para enxergar que vai estar pequenininho Mas tem uma plaquinha que tá ali Nem tudo na vida da genético mais quase tudo que que essa frase aqui Olha só olha que interessante raciocínio Você já parou para pensar

que tudo absolutamente tudo que está relacionado à vida também está relacionado direto ou indiretamente com a molécula de DNA com o Genoma dos organismos porque das coisas mais simples que a gente faz até as coisas mais complexas que a gente faz que os organismos faz que a vida faz passe algum momento pela molécula de DNA passa em algum momento pelo Genoma do organismo de uma ação aparentemente Muito simples né que é sei lá levantar um braço Aqui nós temos ali o recrutamento das proteínas do músculo que interagem com outras moléculas é uma cascata de Vento

uma via metabólica que não sei o que no final das contas a gente levar isso lá para o fundo do poço a gente olhar o ponto de partida de qualquer coisa relacionada à Vida é Um momento que uma a polimerase presta atenção uma R napolimerase ela se associa ela consegue de alguma maneira Se associar a molécula de DNA de um organismo guarda o lucro de organismo ou fora do núcleo de um organismo se associar a molécula de DNA e a partir daí ela transcreve um RNA esse RNA tá transportando uma informação vai ter alguma função

ali não importa é uma informação que estava armazenado DNA porque o DNA isso o Genoma é isso é um um repositório de informação ela vai lá recruta aquela informação e utiliza isso de alguma maneira tudo que a gente faz Está fulminado a funelado neste momento que é o processo da expressão de um gene na hora que um gene um conjunto de higiene se eles são ativados são recrutados são expressos E aí vai dar o que quer que seja levantar um braço por exemplo aí você pode de coisas muito simples que a gente faz na biologia

molecular como por exemplo a gente destruir um gene que tá dentro de uma bactéria que faz permite que essa bactéria Ela mude de cor não cultivo um processo de clonagem por exemplo a técnica utilizada nos décadas já muito simples é um gênio que a gente vai lá e destrói de alguma maneira esse jeito higiene muda a um fenótipo da bactéria que serve para a gente selecionar bactéria lá no cultivo algo muito simples a gente pode extremo coisas extremamente complexas que a gente aparentemente não tem nada a ver com a genética não tem nada a ver

com ele não tem nada a ver com General mais Tempo eu sempre dou um exemplo de alguns exemplos de um carro por exemplo se de carro por mais absurdo que pareça inicialmente esse racional ele existe um componente genético numa pessoa bate um carro sei lá a pessoa bateu o carro porque ela estava distraída brigou com o namorado ela não tava bem naquele dia tava ansiosa Será que aquela pessoa ela é mais ansiosa por conta de um monte de coisa que ela passou ao longo da vida Dela desde a infância né até a fase adulta e

esse monte de coisa por ela já ter uma pré disposição genética lá atrás fez com que ela desenvolvesse uma ansiedade que combinou no final energia Ela bateu o carro e Ou seja pode parecer que isso era muito distante às vezes tá muito distante mesmo mas mesmo as coisas mais triviais do dia a dia tem um componente genético ali pode ser um componente minúsculo não é espaçoso pelo DNA passou pela expressão de um gene Em Algum momento até que nesse exemplo que eu tô dando casamento né Será que existe alguma relação entre pessoas que querem casar

em relação as pessoas que não querem casos existe um acompanhante genérico Provavelmente sim não com certeza sim talvez não seja um componente muito pequenininho envolvido um monte de coisa relacionado ao ambiente com aquela pessoa vive a cultura o que ela passou na infância tudo mas existe um componente genético Foi por causa disso e com esse entendimento mesmo que ele não seja o entendimento claro que as coisas funcionam assim lá atrás no começo do século Quando essas publicações vieram à tona né que foi quando sequenciamento de Genoma Humano foi o primeiro draft não o primeiro rascunho

é um dos primeiros rascunhos ele foi publicado é dois projetos Paralelos foram publicados mais ou menos na mesma época ali teve uma rebuliço você provavelmente é jovem não Vai lembrar disso as pessoas da minha idade vão lembrar teve um reboliço na mídia na comunidade científica as pessoas falavam de maluquices que viriam poderiam vir acontecer agora que nós temos a informação do genor humano o genomano foi sequenciado nós temos a sequência de letrinhas humana naquela época repórter falava isso cientista falava isso pessoas que leigas falavam isso agora a gente tem essa informação a gente tem o

livro da vida Daqui para gente ele foi transcrito nós temos a informação de letrinhas nós temos as letras do livro da vida que tem a capacidade de fazer tudo que eu acabei de falar né Nós temos a informação atali e a gente leu essa informação então o que que vai acontecer o que a gente pode fazer agora não é isso foi um reboliço mesmo tem aqui eu tinha os prints aqui do jornal Isso aqui foi do do New York Times se eu não me engano então Saiu todos os jornais no mundo inteiro e você Falava

que agora a gente vai selecionar bebê de cor de olho né Vamos selecionar a cor do olho do bebê vamos selecionar o sexo do bebê a gente vai poder fazer super saudável a gente falava um monte de coisa um monte de coisa relacionado a ao sequenciamento do Genoma Humano Só que tem um problema nesse racional o racional assim de certo modo ele faz sentido né mas ele tem um problema nisso né que que a gente pegou foi uma sequência de 3 bilhões de letras e Simplesmente colocou lá em ordem do jeito que ela tá dentro

do núcleo da nossa célula nosso de novo a gente colocar em ordem isso não significa a gente sabe ler o que tem ali muito do que tava ali não sabia ler já tinha entendido que tava ali mas era mais ou menos como pegar um livro com esse aqui ó você tem a sequência de letrinhas a sequência de letras aqui mas eu não sei o que que essas letras significam não sei o que essas essas como essas letras Formam palavras não dá para saber se eu olho para um livro desse você não tem você sabe que

tá nessa ordem a letra mas você não sabe o que tem ali e mesmo que se que você soubesse você para fazer algo para modificar o que você tem que saber o que está escrito ali modificar o que tá ali né pra você manipular isso de alguma maneira né então muito da das previsões que foram feitas naquela época naquela viagem de ficção científica não aconteceu obviamente um monte de gente Obviamente estava mais centrado sabia que isso não ia acontecer que será apenas o primeiro passo que vinha pela frente mas mas muita gente estava com essa

ideia de ficção científica que o mundo é mudar completamente porque a gente tinha a sequência do Genoma Humano né cara teve muita coisa boa que aconteceu a partir do sequenciamento de Genoma Humano ele foi ele terminou de ser sequenciado agora faz alguns meses aí o Final mesmo né os pesquisadores falaram agora a gente terminou faz pouquíssimo tempo faz alguns meses foi no começo do ano então desde o começo do século né até agora desde a década de 80 quando começou foi finalizado mesmo agora faz alguns meses aquilo foi o primeiro gráfico daquela publicação mas teve

um monte de coisa boa esse processo sequenciamento desenvolveu-se técnicas e tecnologias sequenciamento teve um custo muito reduzido permitiu sequenciar Genoma de vários organismos e esse negócio ele foi desenvolvendo como eu falei boa parte das previsões que falavam atrás não aconteceram alguns anos depois isso você corta aí para 2015 em 2016 mais ou menos não faz tanto tempo assim a gente começou a ver coisas desse tipo aqui os que tinham que causam a malária num ambiente controlado um macho um grupo de macho geneticamente modificados Foram geneticamente modificados gerado descendentes incapazes se proliferar ou seja esse mosquito

que é uma praga ele não conseguiu se desenvolver mais aquela população controlada não foi à frente o mosquito geneticamente modificado que por alguma razão gerou descendentes e ele não se proliferou aquela população acabou essa frutinha aqui ó parece uma Cerejinha de uma cereja e um e um tomatinho a Cerejinha Estados Unidos uma Planta difícil de domesticar ela cresce Toda torta né Ela não ela não é favorável agricultura Ela poderia ser para uma frutinha gostosa parece que é gostosa nutritivo Mas ela é difícil de cultivar de domesticar Então ela cresce Toda torta é uma árvore Baixinhos

frutos são pequenos Essas flores são tudo a ruim de reproduzir algo aconteceu modificar um geneticamente essa plantinha da noite por dia não tô falando um processo de melhoramento Genético que leva anos não tô falando de uma geração para outra modificou essa plantinha a plantinha que era Toda torta passou a ter uma característica mais parecida com tomate passou a ser retilínea aqui mais fácil cultivar maior aumentou o tamanho dos frutos aumentou aqui a as flores ela passou a noite por dia geneticamente modificado algo que mais favorável cultivo essa doença cardiopatite hipertrófica a doença que as pessoas

algumas pessoas podem ter Elas podem nascer com essa doença é um gênio que causa algum problema no coração tem uma hipertrofia aqui do músculo cardíaco que causa arritmia dor no peito é cansaço embriões humanos foram geneticamente modificados e permitiram que esses próprios ingressos Eles não vieram a ser fecundada implantados no útero em caráter experimental Mas eles eles vieram a testosterona modificados geneticamente modificado e eles eram Embriões doentes com essa doença né e passaram a não ser depois dessa modificação genética distrofia muscular outra doença genética terrível as pessoas com essa distrofia geralmente não passam dos 30

anos morre com 20 e Poucos Anos aí é um problema não é numa numa proteína chamada distrofina é um gênio que causa um gênio defeituoso gera uma proteína desse defeituosa distrofia que que fizeram usaram cães geneticamente modificados Também com essa doença eram cães modelos experimentais tipo rato né só que eles foram desenvolvidos para ter essa doença são cães com essa doença foram genéticamente modificadas e deixaram de ter a doença eles diminuíram os sintomas da doença né não deixar ser doente mas diminui os sintomas da doença e por último aqui um caso bem extraordinário que aconteceu

no começo do ano do ano passado para esse que um humano ele recebeu Um transplante De coração ele tava morrendo problema de coração ia morrer não ia ter um coração a tempo para ele na fila do transplante e ele recebeu o coração de um porco ele recebo um coração de um porco mas não era um pouco um porco qualquer era um porco geneticamente modificado que teve o seu coração gerado produzido para ser compatível com humano esse cara recebeu um coração de um porco enchendo o transplante primeira vez isso aconteceu e ele sobreviveu por várias vezes

depois Ele morreu mas ele sobreviveu meses com esse coração a ideia era deixar o coração ali ele quando parecesse um doador ele trocar por coração humano né então mesmo que ele tenha morrido o fato dele ter sobrevido meses com o coração de um porco Foi algo inacreditável certo beleza o que que mudou da época como eu falei lá do sequencial de genoma humano onde houver essas previsões e agora que nós temos aquelas previsões acontecendo de verdade O que que mudou daquela época para cá sistema Cris percas que acontece naturalmente bactéria foi trazido por um ambiente

de laboratório e começou a ser replicado em laboratório de maneira artificial obviamente para modificar geneticamente é o que nos interessa modificar sistema Cris percasse e entre outras coisas a técnica de crisper entre outras coisas tem a possibilidade de pegar aquelas informações que nós conhecemos Consequência de um humano e modificá-las editá-las é mudá-las do jeito que a gente precisa para resolver problemas como se eu mostrei lá atrás para você e tudo que aconteceu até agora é só o rascunho que vem é só nós estamos só engatinhando porque a técnica ela é muito nova você pensa em

termos de Tecnologia de biotecnologia isso aconteceu ontem e nós temos essas coisas todas já acontecendo na vida real não só em caráter de pesquisa eu mostrei Algumas coisas em de pesquisa outras não mas já na vida real produto sendo gerados baseados em crisper para fazer alguma coisa Alguma modificação criar qualquer coisa geneticamente aí alterar alguma coisa para resolver um problema nosso nós estamos apenas começando isso que eu mostrei até agora se você buscar outras coisas em diante você vai ver que tem um monte de coisa acontecendo é só rascunho do que vem pela frente nós

estamos dando o primeiro Passo agora estamos na primeira a primeira etapa desse processo que está para mudar aí o curso na história da humanidade sem sombra de dúvida assim como aconteceu sei lá com a PCR anos atrás que deu uma guinada na vida das pessoas laboratório na prática no mercado aplicados na pesquisa aqui nós vamos passar estamos passando por esse mesmo processo E você tem a sorte de estar vivo para acompanhar esse processo você tem mais sorte ainda de trabalhar Nessa área e poder trabalhar com isso se você quiser beleza organizamos esse racional primeiro vão

aqui falar um pouco sobre o evento falar do certificado porque agora já deve ter uma galera aí né já tem bastante gente simultanea assistindo vou dar informação sobre o certificado aqui para quem quiser ficar fique quem quiser sair sai quem beleza só para a gente ter aqui a organizado o nosso raciocínio Vamos lá sobre esse evento gravação vai ficar disponível até dia 15/08 às 20 horas já falei isso lá atrás então fica tranquilo você assistiu a gravação assistiu aula ao vivo Tanto faz você vai receber o certificado do mesmo jeito tá você fez que eu

tô falando vai receber o certificado não importa gravado ao vivo certificado como é que você como é que vai ser amanhã dia 9/8 às 6 horas da tarde eu vou enviar por e-mail para você eu vou enviar um e-mail Lembrando que o Curso tá com a matrículas matrículas abertas vou mandar ali na nesse meio também um link para você preencher um formulário nesse formulário você vai colocar simplesmente você vai colocar o seu nome completo que é como você quer que vai para o certificado e depois você vai colocar um código que eu vou te passar

no final da aula de hoje um código que eu criei aqui você vai colocar lá nesse nesse formulário aí você vai dar o Next você vai ser jogado Com uma página que vai te dar as instruções como você baixa o seu certificado automaticamente ele vai ser gerado é um sistema de for formulário coloca o código Lê as informações você tem que confirmar que você lança informações para você ficar mandando e-mail fazendo pergunta que tá lá vai dar o Next ele vai te jogar para uma página e ali ele vai te falar como você vai para

baixar o certificado certo Eu aconselho você se você fizer isso que eu tô te falando né logo que o e-mail chegar é provável é provável que a gente vai ter uma sobrecarga ali no sistema de geração certificado e o seu certificado leve alguns minutinhos para ficar pronto então eu aconselho você pra gente formulário coloca o código dá um next vê se o certificado ficou pronto se não ficou dá uma horinha vai tomar um café vai tomar uma água assistindo novela sei lá o quê dali uma hora você volta e pega O seu certificado tá faz

isso se acontecer de você preencher o formulário colocar o código e ainda assim o seu certificado não ficar pronto depois de uma espera uma hora não manda e-mail logo depois de você testar não depois de uma hora não chegou você manda um e-mail no suporte suporte a roubar o universo da bemol.com que é onde eu tô me comunicando por você e falar preenchi e não recebe certificado eu vou fazer eu vou ver o que aconteceu e mandar para Você tá bom beleza para quem tá aqui só pelo certificado já falei vou repetir Fica tranquilo você

tá que não quer assistir aula não tem problema para desliga que o YouTube vai fazer outra coisa amanhã você volta aqui vai lá no finalzinho da apresentação e pega o código se é isso que você quer para sua vida beleza faça isso eu não tenho como controlar o que você faz mas o que você não pode é tentar me enganar mandar e-mail tentando me enganar é Preenchi lá e não funcionou Não tenta me enganar e não fica atormentando o pessoal aqui no chat que tá tentando aprender beleza fora isso estamos bem alguma pergunta aí sobre

o certificado quanto toma um golinho de água a aula vai até que horas eu acho que essa aula aqui ó a gente começou a 7 ela vai até às 9 horas mais ou menos sete oito não é até às 9:00 no máximo quero passar disso não tá contando com a parte de perguntas no final não vai passar Disso não no máximo duas horas se não a gente fica muito longo certo beleza vamos lá vamos entender como é que funciona a o sistema Cris per Caps primeiro para depois a gente entender como é que funciona a

técnica de crise Tá vamos começar contando a história dessa bactéria bonitona tá ali vivendo feliz da vida seu Genoma aqui bonitão e aí ela sofreu Ataque de um bacteriófago parasito na lembrança celular injetou injetou seu material genético ele é assim que o maldito se propaga né um vírus vai lá insere seu material genético esse material genético ele vai utilizar a maquinaria da própria célula probactéria para produzir as proteínas no vírus os vírus vai ser replicar multiplicar a explorar essa célula e ele vai parasitar outras bactérias é isso é assim que o bactérias faz Ultra Resumidamente

aqui e é a bactéria provavelmente vai morrer na maioria dos casos ela morre mas em alguns casos não de vez em quando de tempos em tempos a bactéria ela pode sobreviver esse ataque e em algumas situações sobrevivendo essa Ataque Ela pode utilizar uma enzima ali nesse processo de combate a esse vírus cortar o Genoma desse vírus e falando um negócio meio esquisito pegar parte do Genoma do vírus do bacteriófilo incorporar no seu próprio Genoma ela tem que ser Amarelo ela pegou parte daquele gelo naquele parte do Genoma do bacteriófago incorporou no seu próprio Genoma e

ela incorporou esse fragmento do Genoma aqui do vírus e uma região muito específica do seu Genoma na região chamada crisper e você já vai entender o que que é na região chamada crispy se essa bactéria no futuro ou as suas descendentes né que tiverem esse material genético aqui vieram a separação por esse vírus mais uma vez Por esse bacteriófago ela pode lançar mão de um sistema chamado crisper caça no qual este material genético do vírus que está naquela região chamada crisper ele pode ser utilizado como molde para transcrição de um RNA ele vai um RNA

pequenininho fragmento pequenininho de RNA que vai se juntar vai se associar a um outro RNA e esses dois RNA juntos o RNA dos vírus e o outro fragmento de RNA que não importa agora eles vão se Complexar em enzima em uma nuclease chamada K9 aqui no caso 9 tá vai se associar a casa 9 essa casa nova que é uma nuclease é uma endonuclease uma nuclease é uma enzima que corta DNA uma endonuclease é uma enzima que corta tipo fita assim né Tem aquelas enzimas que cortam pela beiradas são as exonucleados elas vão degradando pela

beirada ainda nuclease ela corta igual tesoura no meio do DNA Então esse RNA que foi proveniente produzido proveniente desse Fragmento do Genoma do vírus Ele vai se associar essa enzima casca ativando essa nucleares que até então ela tava quietinha lá de boa ativando essa nuclease e esse RNA parte desse RN desse RNA aqui que está aqui na enzima agora complexada com a enzima vai buscar complementariedade aonde lá no Genoma do vírus o vírus que está parecendo a célula tá num processo de parasitar essa célula aqui esse fragmento né de RNA e que é Proveniente desse

fragmento DNA que foi proveniente do Genoma do próprio vírus quando ele encontrar complementariedade tipo um primer durante a PCR contra complementaridade aconteça é com g encontrou ali uma região complementar a enzima ela se associa o DNA dupla fita aqui do vírus e fragmento o Genoma do vírus e inativando eliminando o processo de multiplicação daqueles vírus então aqui nós estamos falando de um de um sistema rudimentar De como é que fala mesmo imunológico nessa Bactéria como um sistema imunológico rudimentar ela foi parasitada por um vírus algum momento lá atrás da vida dela ou gerações atrás por

conta disso ela armazenou ela incorporou parte do Genoma do vírus e Ela utiliza o Genoma do vírus para cortar para picotar para fragmentar impossível bacteriófago que vem a conta miná-la no parasita lá no futuro então um sistema rudimentar né Um sistema rudimentar de eu falei mesmo né é isso ainda eu acho que deu para entender é um sistema de proteção aí dessa dessa bactéria certo entenderam como é que funciona isso aqui é o sistema Cris percasse inicialmente para saber a gente vai elaborando muito agora muito mais bom o sistema crítico é crisper é uma sigla

é aquela região lá que eu mostrei Para vocês da bactéria né onde era armazena o fragmento do vírus é o sistema ele é um é uma sigla que tem um nome bem feio só que ela é muito informativo se você entende o nome você já entende muito o que tem ali pela frente né crisper significa clusterspace shots e eu vou explicar para você porque que isso é muito informativo mas antes eu preciso te explicar o que significa palindrónico talvez você não sabe saiba O que é um palíndromo palíndromo que as palavras palíndromos que são aquelas

palavras que a gente consegue ler tanto da esquerda para direita como da direita para esquerda então se você pegar essa palavra reviver ele aqui revi ver nesse sentido e no outro sentido também é você pegar revi ver continua sendo a mesma palavra você consegue ler ela Em ambos os sentidos até frases completas como a torre da derrota da derrota é uma palavra uma frase Para-rrômica no Genoma dos organismos existem vários palíndromos várias sequências Então você pega essa fita de DNA isso aqui é um palíndromo muito muito conhecido na genética né na biologia molecular é o

Jean a t t c a sua fita complementar vai ser o gaattc dá para ler Em ambos os sentidos então isso aqui que é um palíndromo tá você precisa saber isso para entender o que significa a sigla Cris Então vamos lá Cris nós somos Fragmentos pequenos o short né são fragmentos pequenininhos são pais pequenininhos que estão ali naquela região genómica lá da bactéria chamada crisper né são fragmentos pequenininhos só que esses fragmentos esses fragmentos pequenininhos Eles não estão ali sozinhos eles estão repetidos são vários fragmentos todos repetidos um atrás do outro esses fragmentos não tem

uma sequência qualquer eles têm uma sequência palha hidrômetro Então você Consegue ler tanto num sentido como no outro Além disso esses fragmentinhos palíndromos repetitivos eles estão interespassados regularmente eles estão interespassados regularmente por outros fragmentos que aqui no caso é o fragmento que veio lá da bactéria né num processo que a bactéria incorporou o Genoma do vírus é esse é esse fragmento que tá interespassando os fragmentos pequenos repetitivos em palíndromos e Esses fragmentos aqui essa região esse óculos ele não tá em qualquer lugar em Genoma eles estão todos agrupados ali no meio da região genômica da

bactéria Então é isso que significa né são fragmentos pequenos repetitivos consequência para hidráulicas que estão interespassados e uma região específica do Genoma isso aqui é a sigla crítica Então tá aqui ó os fragmentos que provenientes lá do vírus que foram do Geraldo vírus que Foram incorporar o Genoma da bactéria estão interespassando os fragmentos paralelos e pequenininhos E aí que tá o grande lance aqui é o grande lance do sistema crítico da bactéria a gente consegue assim como a gente já fez milhares de vezes na biologia molecular e pegar um sistema que acontece naturalmente lá na

natureza em algum lugar acontece naturalmente nos organismos e trazer para dentro do laboratório e utilizar nosso favor esse Sistema portanto que você acabou de ver ele pode ser replicado artificialmente E aí que o sistema Cris percasse ele é traduzido ele é transformado ele é criado desenvolvido para a técnica de crise para que a gente utiliza no laboratório e você pode replicar o que acontece na bactéria e uma célula humana por exemplo uma célula de um de um vegetal de uma planta você pode pegar colocar dentro de uma célula não importa Como agora né você pode

fazer isso por eletroporação você pode inserir esse sistema aqui dentro da célula por que mais você pode fazer isso aqui por vírus né Colocar fazer o vírus injetar essas informações aqui dentro você pode fazer isso por lipídios você pode Inserir a casca a nuclease casos junto com esse rnazinho que serviu que serve como guia na enzima de diferentes maneiras dentro de uma célula que nunca viu na vida um Sistema crítica e esse sistema crisper vai desempenhar sua função ali dentro ele vai funcionar como ele funcionaria numa bactéria E isso tem uma cacetada de aplicação para

gente Onde que tá o pulo do gato da gente trazer esse sistema Cris Para que acontece uma bactéria para dentro de uma célula humana célula animal mamífero vegetal um certo que onde que tá o pulo do gato tem que trazer essa técnica para o laboratório Olha só nós temos aqui a enzima com as 9A nucleares que vai cortar o DNA é dupla fita nós temos um RNA são dois RNA aqui depois vocês vão ver que ele vai não importa agora mas aqui são dois fragmentos de RNA que no laboratório a gente faz um fragmento só

unido mas são duas porções do fragmento de RNA este RNA que está aqui dentro ele foi desenvolvido especificamente para estar aqui dentro e encontrar complementariedade no Genoma dessa célula alvo aqui hora que ele encontra Complementariedade a casca nuclease vai lá e Corta aquele fragmento faz um corte dupla fita naquele DNA um corte do profito na molécula de DNA uma célula é algo extremamente agressivo e a célula vai fazer de tudo para reparar esse erro esse problema imediatamente só que a célula quando ela vai fazer esse reparo mecanismo de reparo de um corte dupla fita não

é reparo dos melhores né ela ela tenta mas ela não Faz negócio muito bom não faz negócio muito bem feito no processo de reparo que que ela pode fazer ela pode inserir um fragmento que não existia Ali era um fragmento que não tinha aquele pedaço era que ela foi reparar com ela seria um negócio que não tinha ali ou ela pode tirar um pedaço ficou faltando um pedaço tinha um fragmento Mas deixou de ter Pode ser que ela modifique a sequência de nucleotídeos daquele pedaço na hora que ela foi Fazer esse reparo E aí quando

isso acontece quando isso aqui acontece dentro de um gene uma região importante do gênero de um exxon por exemplo nós temos aqui por exemplo o silenciamento higiênico esse Gene ele pode deixar de ser funcional por conta desse reparo mal feito da da célula né era um gênio que tava funcional foi lá uma enzima cortou num momento que a sala foi para reparou minha boca e ele deixou de ser funcional então a gente por isso aqui já começa a Ficar útil para a gente quando a gente olha com uma situação como essa né então Imagine que

existe lá um gênero defeituoso um gene que tem sei lá um Sniper uma mutação alguma coisa ali que que não funciona muito bem a gente pega o sistema crisper caça a técnica crisp por modifica customiza ela para ir lá cortar bem naquela porção Onde tá o problema e a célula vai fazer o reparo reparo na minha boca causar mutação inserção direção modificação e aquele Jeito defeituoso Deixa de ser defeituoso por exemplo ou um gene que era funcional Deixa de ser funcional certo então são um exemplo de como a gente pode como o sistema crítico pode

ser utilizado mas tem ainda o pulo do Pulo do Gato uma outra via de reparo é exatamente bem essa coisa que eu falei para vocês tem o DNA alvo aqui dentro a casa com seu RNA que vai ganhar a casa até um ponto específico de corte só que junto com o sistema a gente coloca um DNA exógeno um Delineador dupla porque quando na presença de um DNA doador em certas fases de visão dessa célula aqui se há este corte do jeito que a gente mostrou e a célula vai reparar ela repara aquele corte ali e

se ela tem a disposição dela um fragmento um RNA Que ela possa utilizar como molde com extremidades homólogas as extremidades que foram cortadas ela usa aquilo como molde ela usa aquilo com o molde é um jeito na sala se proteger na divisão celular Quando ela tá assim se multiplicando se ela tá se dividindo né é um jeito dela dela se por um acaso tiver perda de um pedaço de uma quebra de um braço de um cromossomo por exemplo ela usa o outro cromossomo cromossomo homólogo como molde para reparar aquilo que ela perdeu Então se nesse

processo aqui de quebra ela tiver uma referência um fragmento com extremidades homólogas a região que foi quebrada ela pega incorpora esse esse DNA exógeno aqui para dentro dela Uai o negócio interessante lá atrás a gente não tinha informação nenhuma sobre o Genoma ainda desenvolveu técnica de sequenciamento você conheceu o Genoma Humano temos a sequência de letrinha completa nós não tínhamos até então uma ferramenta que pudesse ir lá né de uma ferramenta nessas condições já existia mas não nessas condições se chegar lá numa região específica do Genoma e modificar fazer um negócio como eu tô mostrando

aqui para vocês ou você vai lá Inativa uma coisa que não funciona ou um negócio que tá uma mutação um snip tal que tá causando um problema Ali você vai lá e corrige aquele problema para uma coisa que te interessa melhor uma coisa que resolva o seu problema quando tá mostrando aqui pra vocês e aqui com mira tudo que eu falei até agora para vocês né do na importância do sistema Cristo é a técnica de Cris para para a humanidade pra vida se tudo depende da vida se tudo que a gente faz como eu disse

levantar o Braço um casamento tudo certo pode estar relacionado à vida também está relacionado a DNA Genoma nós temos agora uma técnica que consegue mudar o Genoma consegue transformar a informação que tá no fenômeno do jeito que a gente quiser nós temos uma ferramenta que é capaz de mudar a vida é isso que nós temos nas nossas mãos né claro com algumas acessar os várias ressaltos mas de uma maneira grosseira simplificada é isso que nós Temos na nossas mãos Olha só por que que o sistema crisp é casa ele tá se rebuliço Porque que a

técnica de Cris pela é tão falada por que que todo mundo conhece por que que a gente ou falta de técnica de crise alguns motivos primeiro é específico a gente tem um uma enzima que se associam RNA e esse RNA vai transportar vai guiar essa enzima até uma região específica para fazer a clivagem para fazer edição fazer o corte que quer que a gente vai Fazer ali o fato ser específico é muito importante o genoma humano tem 3 bilhões nucleotídeos 3 bilhões lucrativos nós temos uma enzima um sistema capaz de achar dentro de 3 bilhões

um ponto específico um núcleotídeo específico se a gente quiser Se isso for necessário assim como lá na PCR um dos grandes diferenciais da desenvolvimento da técnica e PCR é o Primer que é super específico que amplifica só aquilo que nos interessa aqui no sistema crítica na Técnica de Cristo também nós temos a especificidade nosso favor outra característica ela é replicava um laboratório acontece na bactéria mas a gente consegue replicar com baixo custo um bom custo em laboratório eventualmente ou técnica de Cristo e virtualmente é compatível qualquer região genômica não é qualquer vocês vão ver que

tem um gargalo mas é quase qualquer região genômica então praticamente qualquer jeito defeituoso Ou regiões genómicas de interesse a gente consegue modificar usar o sistema crise por aí no processo e virtualmente qualquer tipo de célula também célula qualquer tipo de célula que de organismos qualquer organismo dá para fazer isso que eu acabei de falar ela foi Originalmente descoberta lá na bactéria né vem foi Faz tempo que foi descoberto lá na década de 80 né mas aos poucos ela veio combinando até desenvolver a técnica do jeito que ela Tá hoje mas é compatível com qualquer tipo

de célula quase qualquer tipo de célula certo entendeu esse processo até agora começamos a entender a importância de Cristo e vamos ver como é que esse negócio funciona para valer mesmo vamos lá Quais são os moléculas principais envolvidas na técnica de crisper né agora no laboratório que é o que interessa para a gente bactéria falamos que vai até mencionar as Bactérias aqui de novo né da onde veio a técnica mas aqui o principal é a técnica nós temos a nuclease Cassi 9 existem diferentes casos diferentes casos podem ser utilizadas utilizadas na técnica de crisper a

maior parte das vezes a caso utilizada é a K9 então a nuclease K9 significa chrisper associated é uma enzima que está lá no Locus de Cristo lá na bactéria ela faz parte do mesmo óculos né tem ali o chrisper que é o fragmentos pequenos Repetidos fala em hidrômetros e ali perto tem o gene que que codifica a casca também tá então k significa associente então nós temos lá nucleos e castas nesse sistema nós temos um RNA que serve como guia né não tem um RNA que se complexa com a casca e vai guiar a casa

até onde ela tem que fazer forte a maneira específica nós temos um RNA guia também que posso ser chamado de single guysg RNA ou G RNA e nós temos o DNA Alvo que vai ser equivale vamos falar um pouco sobre cada uma delas nuclease Cássio primeiro aqui uma proteína bacteriana do sistema do tipo 2 tem diferentes tipos de chrisper nós estamos falando do tipo 2 que a gente utiliza hoje é detalhe isso vocês viram que ela é capaz de cortar o DNA do placita a parte interna é uma endonuclear do corte duplo a cas ela

original a casa nova que muito até hoje ela utilizada bastante Utilizada ela foi ela foi purificada de um organismo chamado streptococcus pirogênese então talvez a casa nova você veja como um caso maior de casa ou SP casa 9 que é a casa mais a original é que deu origem o que tem um monte de variação hoje essa casa ela tem duas porções dois lobos aqui é um pouco de detalhe Tá mas só para você ter um cional aqui ela tem dois Logos duas porções uma porção de reconhecimento com Alfa onde ela vai reconhecer o alvo

para Fazer a climática e a parte onde ela faz a clivagem mesmo anuclease né com dois com dois domínios o catalítico e o de interação com fragmento alto Tá bom então a porção dela ali que reconhece o alfa uma outra porção que trava o sistema e a outra porção que corta o a dupla fita deixa eu ver aqui tá chegando mensagem só vamos ver se é o Bruno nós temos o RNA guia que eu não falei ainda para vocês né Então até agora eu tô falando lá do RNA só mencionei nessa RNA Olha só para

caso 9 ela executar sua função de endomicinado pela fita ela tem que estar associado a um RNA não RNA é dois RNA Originalmente na bactérias são dois RNA dois fragmentos de RNA porque ela sozinho não trabalha a casa nova sozinha não funciona se você pegar uma casa sozinha sem RNA e colocar ela perde um DNA ela não clico ela não vai fazer a clivagem ela para ser ativada Elas têm ela tem que estar associada ao RNA lá na Bactéria lá na bactéria isso aqui é um pouco importante né assim por conta da história do desenvolvimento

da técnica lá na bactéria são dois fragmentos de RNA que se associam que se complexam a a casca uma porção do de RNA chamada de RNA que é o RNA que veio lá do vírus né aquele vírus parasitou foi o seu DNA foi incorporado no Genoma esse DNA ele vai ser utilizado para transcrever um RNA e RNA vai se associar a casa é esse o crna é aquele é aquele RNA que proveniente do Vírus Mas tem uma outra porção que é uma porção mais genérica que é chamada de traque RNA o trans-activate que ela serve

para ativar a enzima casa lá na bactéria é assim né então nós temos aqui o chrisper que eu mostrei para vocês os fragmentos palindromos repetidos interesse passados os espaçadores aqui são os fragmentos provenientes do bacteriófago do vírus então aqui eles que vão ser utilizados lá para associar A casa por exemplo aqui nós temos no mesmo blocos um outro fragmento que que vai gerar o Tracker o trans é que veio que é ativa a casa e a casca tem o gênio da casa aqui então isso é tudo né Tem outras casas aqui utilizadas lá no primeiro

momento de parasitas da da da célula que não importa agora pra gente em algum momento aqui quando o bacteriófago ele para parcela de novo Vamos pegar esse fragmento aqui o verde acho que é o verde né ele vai ser Transcrito vai tá aqui no DNA ele vai ser transcrito formando um fragmento de RNA e esse DNA aqui nessa parte do Genoma vai transcrever também um outro fragmento RNA que vai se associar ao RNA do vírus né proveniente lá do vírus original que não importa muito agora mas esse fragmento aqui do vidro vai se concluir que

está com esse fragmento aqui desse outro aí né eles juntos conseguem ativar caso 9 ativar enzima para ela ser uma Enzima funcional uma endonuclease funcional e que vai ganhar essa nuclear até o seu ponto específico de atuação ela vai lá e encontra o alvo e pum e faz o corte duplo né Faz um corte no ar o alvo é o preto tá o alvo que foi encontrado pela caça é o preto aqui ele vai abrir o DNA Ele vai cortar aqui e vai cortar aqui fazendo uma fragmentação isso acontece na bactéria no laboratório a gente

tá adaptou um pouco isso que foi aí para quem conhece a história A Jennifer dolgena e Emmanuelle Chun PT que ganharam o prêmio Nobel o ano passado esse ano ganharam o prêmio Nobel agora aí faz pouco tempo foi entre outras coisas foi isso aqui que ela se desenvolveram né Elas desenvolveram elas combinaram esses dois RNA aqui um fragmento só de RNA que antes era RNA esse Tracker RNA aqui elas elas desenvolveram um RNA guia que é um fragmento só eles estão Unidos entre eles ali formando o SG RNA ou GNA é o Gene o RNA

guia Isso é uma molécula quimérica formado por esses dois fragmentos que a fusão do crna e o Tracker RNA então nós temos aqui nesse nesse RNA guia nós temos aquelas duas porções a sequência específicas de reconhecimento do alvo que vai guiar a casa até seu alvo para fazer a clivagem é um fragmento de 20 nucleotídeos mas existe uma porção Universal ali genérica de mais ou menos 80 nucleotídeos que isso é para ativar a caça né então aqui É o que acontece na bactéria é aquilo que acontece na técnica de crisper é a mesma coisa né

só que em vez de ser dois fragmentos de RNA aqui é um só estão juntos né essa parte aqui ó essa parte aqui debaixo depois da salsinha aqui é o é o chamado a parte genérica né do desse fragmento e essa parte aqui é aquela customizada aquela que você desenha no laboratório para você alcançar seu alvo para você encontrar aquilo que você quer clivar e Ela vai funcionar do mesmo jeito do mesmo jeito que acontece lá na bactéria vai funcionar vai fazer a clivagem aqui certo aqui tá mostrando um pouco melhor né é uma imagem

tem muita informação mas ela não é difícil de entender porque o rosa aqui atrás o vermelho rosa é a casca Aqui nós temos os dois RNA né a sequência Universal que é chamado escafold e a sequência guia que aquela que vai encontrar o seu alvo é isso aqui encontrou o DNA alvo que está em azul em Vermelho abriu o DNA e fez a clivagem aqui para fazer o corte e nós temos por último o DNA alvo o DNA alvo ele é importante nessa nessa história também porque a região Alvo do DNA então aqui o alvo

né nesse nosso esqueminha o DNA é um DNA dupla fita que é o que vai ser equivado tá sendo demonstrado aqui pela linha azul e pela linha vermelha aquele tá a dupla fita a dupla fita foi Desfeita no processo de clivagem de corte vocês vão ver já mas ele tá sendo mostrado aqui nessas duas linhas essa região clivada pela casa nova ela pôs possui dois elementos importantes a região alvo que também chamado de prótons Space seria aquela região que vai ser reconhecida pelo por essa porção do RNA guia aqui para quem enzima possa fazer o

corte lá região tem 20 20 nucleotídeos especificidade né parecido até o tamanho de um primer né primer que É super específico 20 núcleotídeos especificidade aí de complementaridade que da especificidade e tem uma outra região que anterior que a região do corte né próxima a uma das filhas que mais a extremidade de três linhas extremidade três linhas que é uma região chamada de Pan isso aqui é muito importante o pão é uma sigla para própria experiência já sente motivo a sequência Alves também chamada de próprio Space broto Space Existe um motivo aqui adjacente ao próton Space

acho que é chamado de pan que que é isso é uma sequência de alguns nucleotídeos de alunos nucleotídeos que é são esses três nucleotídeos aqui que nesse caso para essa casa eles ele é formado por um núcleo de qualquer atc ou G seguida de duas guaninas é neste momento aqui é quando a caça encontra o alvo é quando a casa encontra o seu alvo é através da região Pan que a casa ela trava o sistema porque na hora que ela Vai fazer o corte ela não tá ali solta frouxa para cortar aquela delineado pela fita

que ela encontrou ela tem que travar aquele sistema para que o RNA o DNA alvo ele consiga ser dissociado se associar a o RNA guia para ela poder fazer o corte o processo inicial ponto inicial de partida aqui na clivagem acontece aqui na Pan é aqui na Pan hora que a caça se associa essa região Pan aqui que ela trava o sistema Para depois poder fazer o corte né Cada cada caso cada tipo de gás ela vai ter um reconhecimento de uma pães específico uma sequência bem específica aqui nesse caso né que a Pam a

casca o Wild Type ou aquela spk que eu falei para vocês lá caso 9 mais utilizada original para ela fazer para ela poder fazer o corte ela encontrar o alvo desdobrar a fita e fazer o corte ela tem que encontrar próximo aqui a região de clivagem né Essa sequência necessariamente essa sequência de qualquer núcleotídeo seguida de duas guaninas é que tá um gargalo aqui que tá o gargalo da do sistema crisper para Cris funcionar para você ir lá numa região alvo fazer o corte essa região Alfa tem que ter nesse caso aqui né tem que

ter um nucleotídeo seguido de duas meninas que é uma repetição que acontece com frequência no Genoma acontece a mais ou menos uma vez a cada 8 nucleotídeos então É frequente Né Você pode virtualmente cortar qualquer região do Genoma né porque ela é bem frequente essa ou outras fãs mas o gargalo do crisper está neste momento nesse nessa parte maravilha então nós vamos aqui para o mecanismo básico de ação a gente sair dessa parte mais pesadona né ó só para vocês verem como é que funciona né O processo todo acho que melhor do que eu mostrar

eu leio isso aqui é mostrar esse vídeo olha só que legal eu não vou Passar o vídeo inteiro porque esse vídeo ele tá no YouTube Eu não sei se eu posso passar ele na verdade então eu vou aqui com cuidado para não tomar nenhum Strike mas nós temos aqui ó a casca nesse esquema nós temos a casca nós temos o RNA guia que está sendo mostrado aqui em vermelho amarelo o RNA guia que agora ficou só vermelho é esse RNA guia vai guiar a cas até um determinado alvo e ela vai encontrar seu alvo Então

tá aqui a hora que o RNA guia Guiou essa casca do determinado alvo ela vai encontrar a hora que ela encontra como é que ela faz o corte olha como é que ela faz o corte veja bem existe aqui ó eu tô passando tô mexendo ali ao lado direito da imagem tá vendo ali ó onde a enzima ela tá assim ela está se associando ao DNA alvo DNA alvo é o que está em azul tá vendo ali essa aqui é a região pam essa aqui é a sequência Pan do DNA Alfa que aqui que a

enzima ela vai travar o sistema para poder fazer o Que vem pela frente então aqui a primeira coisa que acontece depois do reconhecimento né é o travamento do sistema aqui pela região plana depois o RNA guia ele vai ser utilizado para desdobrar para desfazer a dupla fita do DNA alvo ele vai desfazendo a dupla fita do alvo e o alvo faz uma estrutura dupla fita com o próprio engenharia ele faz uma estrutura do placenta com o próprio RN aí então ele desfaz a dupla fita que tava dele ele se associa o RNA guia e aí

Quando essa configuração está estabelecida que que a enzima vem corta uma fita um dos seus filhos catalíticos e depois ela vem até que corta outra fita no seu outro sítio catalítico E aí fez a clivagem de uma maneira específica a uma outra imagem aqui ó vamos ver aqui se tem outra ó a enzima Cássia associando a sequência a Pan travando o sistema permitindo que o RNA guia se associe ao DNA dupla-fita que consequentemente vai permitir que a Fita seja clivada certo é assim que funciona a técnica de crise beleza falando sobre isso a gente pode

falar agora sobre o reparo do DNA porque é um grande lance aqui tá na hora não é o corte em si mas é a hora que a célula vai reparar o DNA E aí que a gente consegue fazer um monte de coisa né aqui que tá o segredo do negócio tudo certo aí Bruno tiver um pepino me avisa né está tudo certo São duas vias principais reparo a via net e havia HDR então a clivagem pela casa nova ela deve ser reparado pela célula eu falei para você que é urgente algo muito agressivo para célula

tem que reparar ela tem dois mecanismos dois duas viras principais reparo uma chamada junção de pontas não homólogas ou viannesh que é quando ela vai lá corta e ela vai junto simplesmente ela junta causando alguma mutação ali no processo de União ou reparo direcionado por Homologia Quando Ela utiliza um delineador com extremidades homólogas ao que vai ser reparado ela insere esse fragmento ali no processo quando a gente tá falando da vianérgica aquela junção de pontas nós temos aqui a quebra a célula vai recrutar um monte de enzima proteínas enzimas para fazer esse reparo vai ter

DNA polimerado você vai ter DNA ligada você vai recortar onde enzima e ela faz a ligação aquela ligação Meia Boca formando aqui uma inserção seleção Não é uma mutação que pode inativar esse Gene pode causar algum dano grave para célula aqui então isso aqui é chamado isso aqui tiver se isso aqui acontecer dentro de uma região específica importante de um gênero um exon de um gene principalmente os exons iniciais um gênio exo 1 Edson 2 isso pode pode ocorrer o nocaute de um gênio eu quando um gênero nocauteado ele deixa de funcionar normalmente a outra

via de reparo é a via de reparo Por homologia né que é HDR aqui no caso nós temos a quebra só que junto com a quebra nós temos um DNA doador no qual o qual os seus braços as suas extremidades elas são homólogas a extremidade do fragmento que foi privado criou aqui clicou aqui nós temos essa porção que é um móloga ao braço desse DNA doador essa outra porção é um módulo no braço desse delineador aqui no meio tem o que a gente quer inserir aquilo que a gente quer colocar dentro do Genoma aí em

cima A célula na hora de fazer esse reparo ela faz um monte de processamento aqui mas ela utiliza este fragmento como referência Então ela vem aqui assim como acontece o Primer mais ou menos como acontece um primer na PCR Ela utiliza isso aqui como referência e sintetiza uma nova fita aqui no processo de reparo utilizando esse esses dois fragmentos aqui como referência e se na referência que ela utilizou na reconstrução tiver algo que não existia antes ela não sabe Ela vai lá e coloca aquele negócio no meio do caminho criando aqui um fragmento que é

novo que não existia que é diferente esse processo ele ficou dentro de um gene pode ser chamado de nokinho né Não só num gênero mas quando você tem introdução de uma sequência nova no Genoma você foi lá utilizou esse sistema aqui inserir um fragmento novo ele pode ser chamado pode ser uma substituição alérgica você pode fazer esse processo aqui para trocar um único Cleotídeo por exemplo Às vezes o que interessa é um gênero às vezes é um fragmento do gênero às vezes é só um nucleotídeo às vezes é um nucleotídeo de causa problema no nucleotídeo

é o seu alvo dá para trocar um único lucro que eu te fazer esse processo É exatamente esse processo contando que aqui no meio tem um nucleotídeo que você queira adicionar certo então dá para fazer a substituição alênica e com isso com isso tudo que eu expliquei Christian pode ser Utilizado por um monte de coisa a gente está falando aqui basicamente né quando a gente fala de Cristo a gente pensa em edição de DNA porque é muito interessante tudo que eu falei até agora foi basicamente pensando em edição de DNA mas dá para fazer um

monte de coisa dá para marcar DNA dá para fazer regulação de expressão gênica dá para quem vai ganhar dá para fazer crise percorre também em vez de clicar DNA que vai reinar dá para uma piadinha dá para Fazer rastreamento de RNA vamos falar de cada um desses aqui ó a edição de DNA hoje praticamente já falei para vocês mas vão só organizar o raciocínio dentro da edição de DNA tem algumas coisas a gente consegue fazer aí na ativação higiênica que é um nocaute lá que eu acabei de explicar para vocês né Você pode nocautear um

higiene é fazendo o corte ele criar um ideal uma mutação aqui na ativa o gênero você insere um fragmento no meio que inativa aquele Gene da só que dá para elaborar um pouco mais Se você faz uma um Cris utilizando o sistema HDR que usa um DNA doador você pode colocar inserir neste processo no processo de edição do Genoma você vai lá no alvo aquele alvo que você quer que você quer editar de alguma maneira Mas você pode inserir ali junto por exemplo se a gente tiver falando de uma bactéria um gene que permite que

confere a resistência antibiótico essa bactéria aí que você faz Você cultiva essa bactéria editada no meio de cultivo chega desse antibiótico Porque se o sistema crisper funcionou essa bactéria recebeu um gene de resistência antibiótico e tão portanto ela é resistência resistente ao antibiótico tá lá ela sobrevive naquele e-mail se o sistema crisper não funcionou a bactéria não vai ter esse gênero ela não vai ser resistência resistente ao antibiótico e não vai proliferar né é um Controle né são as estratégias estratégias mais elaboradas afinal de contas Como é que você sabe se aquela célula geneticamente modificada

ela de fato geneticamente modificadas tem alguns controles como esse daqui pode associar uma proteína fluorescente você insere junto com o alvo que você colocou ali uma proteína que gera fluorescência é aquela cela que tem aquela proteína florescente quando estimulada quando excitada vai gerar a luz e você consegue Visualmente né ver mesmo com aquela fluorescência que aquele sistema crisper funcionou então o sistema ação elaborações do do processo de inovação de Gênesis aí de transgênese e substituição alérgica aquilo que eu falei para vocês você pode fazer no Aquim inserir um fragmentão de DNA e no meio é

uma simples substituição alerta de um único nucleotídeo ou poucos nucleotídeos dá para fazer demissão de gelo inteiro ele pode fazer por HDR por Exemplo corta o geneal aqui tal genial você faz o corte do genial que ela fez o corte aqui e você utiliza um DNA doador o qual as suas extremidades elas são homólogas suas extremidades são homólogas algene é o gênio tá aqui no meio então você vai ganharzão doador gigantesco uma das suas extremidade está numa ponta do gênio altas extremidade na outra ponta do gênero quando a célula fizer repara ela vai tirar o

dinheiro fora jogava o gene no lixo aí tem outras Opções aqui fazendo um corte fazendo dois cortes se você fizer dois cortes mesmo racional né dois cortes com com sistema nerd fez um corte fez um corte ela vai reparar aquela reparar perder isso daqui ou com o sistema HDR semelhante a esse só que são dois cortes em vez de um cortou aqui cortou aqui na hora que ela repara Ela utiliza esse delineador no lixo mudou-lhe o gene marca ação de DNA Auto negócio legal também e esse Negócio aqui legal olha só que quando a gente

fala dia da enzima casa com as novas Outras casas não sou fã de uma enzima já que tá sendo muito estudada já foi geneticamente modificada ela passou por Engenharia Genética então dá para fazer algumas modificações né a gente conhece bem a enzima então não dá para a gente pegar o sítios catalíticos daquela enzima inativar eles até a casa 9 que ela vai lá do DNA ativa o sítio catalítico da Enzima então você pode criar uma casa que ela cataliticamente inativa ela funciona ela se associa Opa ela se associa o RNA guia ela encontra um Alfa

mas ela não corta ela tem todas as funções ela só não vai lá e corta Então essa enzima ela faz tudo só que ela é incapaz de clivar o DNA dupla fita não é mesmo quando ela tá associada ao RNA guia devido essa característica ela tá denominada esse tipo de cas né que não tenha um sítio de clivagem é uma Chamada de K9 morta ou débito ou simplesmente de K9 certo a dicas nove é aquela enzima cataliticamente inativa ela é morta ela tem todas as funções ela só não faz o corte e olha que interessante

dá para fazer com isso dá para você fazer aqui nós estamos falando de marcação de DNA dá para você pegar é uma essa decas 9 associar essa decas 9 a um RNA guia que vai levá-la vai guiá-la até o alvo tem aquela porção do Genoma que é o seu alvo Ela vai chegar ali se alojar aqui na região mas não vai fazer o corte porque ela não cliva Só que essa enzima além de ser morta ela pode ter sido codificada isso aqui é ela pode ter sido criada produzida em laboratório de tal maneira e não

é difícil fazer que você faz fazer na verdade é associada a uma proteína que gera fluorescência Então você vai lá e associa essa casa além dela ser morta é que ela é inativa ela não faz o corte ela está associada a proteína que emite Fluorescência aí se você pega essa casca e vai lá encontra o seu alo vai lá ela é guiada pela RNA guia ela para na região que é um alvo dela fica ali paradinha não corta E você tem um agente fluorescente associado a ela para que você joga excita a fluorescência desse a

gente fluorescente aqui você cita a fluorescência desse a gente for a gente você consegue ver aonde a casa ela está alojada no DNA você consegue visualizar onde aquela casa está alojada dentro de Uma célula nós estamos falando de uma célula viva você foi lá na sala viva colocou uma casa morta o r na guia levou até o alvo dela essa alojou no alvo e ela tá associada a um florófago a gente fluorescente a hora que você joga a luz Você aceita que ela falou assim você consegue visualizar a presença a região geográfica a região da

célula onde a caça alojou isso aqui ó então aqui é um exemplo de você visualizar mesmo no microscópio olhando o microscópio não é Uma casa ligada ao seu alvo Então você é macro DNA desta maneira muito interessante a outra outro só que você não faz isso com uma só né tem que desenhar vários R navios todos um próximo dos outros cheio de dez ligados ali todas essas caspas a gente fluorescente para você conseguir visualizar assim regulação da expressão gênica Olha a outro racional interessante aqui também utiliza uma casa nova e morta uma dicas Nove né

um gênio quando ele vai ser expresso principalmente complexos temos aí na polimerais que vai ser associar uma região aqui do uma região específica do gênero para transcrever ali o RNA só que para ela fazer isso né expressa ela transcrever um RNA ela tem que estar associado um monte de mediadora que por fatores transcricionais o RNA o DNA alvo ele tem que estar 19 é lado ele tem que estar tem que estar exposto a essa rma Polimerase então é um processo que demanda várias moléculas Olha o que que dá para fazer dá para você pegar desenhar

uma casa nova e morta uma dica às 9 com RNA guia e esse RNA guia vai levar essa casa nova e morta até um sítio de transcrição ou próximo de transcrição de onde os fatores tradicionais se ligariam ali para ativar um gene para induzir a expressão num gene Só que essa casa 9 Mota ela tá ligada aqui Fatores transcricionais Então você leva você pega uma casa 9 coloca lá um RNA guia associada a ela que vai transportar fator transcricional até o City transcrição do Gene ativando o gene né eu tô mostrando aqui um exemplo mas

tem várias maneiras de fazer isso né aqui existem diferentes maneiras você levar vários fatores transcricionais todos ao mesmo tempo pum para aquela região específica do Gene para ativar induzir a expressão daquele gênero muito Doido isso aqui e o contrário dá para fazer também dá para você pegar uma casa 9 e você desenhar um RNA guia e ela vai sentar em cima do fato lá onde se ligaria o fator transcricional impedir a ligação do fator transcricional e você faz a repressão da expressão do dinheiro um gene que tava Expresso deixa de estar ou diminuir o seu

nível de expressão porque você tem uma casa nova e Gordão lá é impedindo dá para fazer o quê também dá para você pegar essa casa 9 Associar ela com outras moléculas que favorecem a metilação do do DNA ou seja inibido Na expressão do Gene ou o contrário acetilando a Stone acetilando a Estônia do DNA favorecendo a expressão então dá para regular a expressão do gênio também clivagem RNA quem passa mais rápido dá para você fazer clivagem também do jeito que você cliva vai lá e coordenado pela fita dá para clivar RNA também até porque moléculas

parecidos tem que fazer Algumas modificações você tem que criar uma região planta Talvez uma das abordagens seja fornecer a urna alvo uma região pam para que a enzima vá lá e faça o corte Isso aqui é uma das alternativa não é dá para clivar RNA outra coisa interessante também que é uma mapeamento de gene né porque tem um negócio assim você tem a sequência de letrinha lá do Genoma Humano Como que você sabe você sabe que ele é um gênio Ele identificou por biofarma acha que aquela porção ali é um gene que aquele Gene faz

não sei como é que você vai saber né é difícil saber inicialmente é difícil saber que região genómica ou que gênero em qualquer função dele no organismo uma das maneiras de fazer isso né que acontece é que quando tem a perda de heterozigolesidade Eu nem quero entrar em detalhes mas você tem uma célula que ela era de um jeito Anteriormente ela perde ela deixa de ser um heterozigoto ela passa uma homozigoto por algum motivo e ela muda a característica dela ela era de um jeito ela perde aterosidade dela e ela passa a ser de outro

jeito depois aí você vê qual qual porção do Genoma daquela daquela célula foi modificada nesse processo de perda de heterosidade e ver quais as características dela que que foram mudadas sei lá se uma célula passou por um processo perda de Heterozigolesidade e ela se ela passou tem mais dificuldade para metabolizar um determinada droga Possivelmente aquela região genômica ali ela tá associada a metabolização de drogas por exemplo certo só que isso você utilizar um sistema como esse aqui naturalmente é difícil porque são eventos raros não acontece com certa frequência ele fica te controlar só que com

o sistema crítico você vai indo lá com a sua tesourinha e fazendo o corte numa Região específica você induz a perda de heterosinosidade e você consegue fazer mapeamento de Gênesis dessa maneira então a outra função aí também nossa desligou tudo aqui né e o rastreamento de RNA você pode utilizar uma casa 9 moto que vai ser associar um RNA alto esse essa casa nova ela tá ligada um agente fluorescente você gera a luz consegue ver por caminho que uma RNA ele percorreu dentro da cela ele foi Expresso depois de Expresso foi Transcrito né Depois de

transcrito ele tava no núcleo do núcleo ele foi produzido e aí você consegue ver rastrear o RNA por esse sistema então dá para fazer várias coisas com o sistema crisper não é só edição isso aqui são os exemplos bem interessantes né acho que aqui para finalizar ó tá um bom tempo aí galera acho que a gente foi num bom tempo é a última parte aqui que é a parte da casa nova suas variantes naturais e Artificiais bom eu falei da clássica né aquelas 9 clássica SP com as 9 que a do vestreptococcus priogênese essa aqui

é muito utilizada nós temos as nicases também nós temos as casas 9 morta que eu falei para vocês nós temos nós temos diversas casas que foram desenvolvidas e descobertas depois da do conhecimento desenvolvimento da região Pan e as cascas 9 de alta precisão e aqui o sistema de inativação também é vamos Falar aqui da casa 9 clássica rapidão ó a casa 9 clássica que tá o artigo que nós temos entre outras coisas né um dos grandes avanços aí da técnica de Cris porque é o artigo da Jennifer Gold tá aqui um dos artigo que virou

um casco depois de quatro anos da sua publicação de tão importante que ele é né ele entra outras coisas utilizou a casa 9 mais pecados 9 que é a original é foi nela que a gente é nela a parte dela que a gente consegue conseguiu em Vez de trabalhar com esses dois RNA que é o que acontece no vírus trabalhar com aqueles dois os dois RMS Unidos né o RNA guia ou o single-galider-man o sgna as nicases elas são interessantes também são com as novas que foram geneticamente modificadas de tal maneira que Ela invés de

cortar a dupla fita Ela corta uma das fitas isso é legal pelo seguinte né Eu falei que o sistema crispra a técnica de crispra específica porque o RNA vai lá Encontra o seu alvo e faz a clivagem só que nem sempre ela 100% específica né Existem os eventos chamados eventos of target que é quando você desenha uma você desenho sistema crístico de um determinado alvo ela cria o alvo e clima outras coisas também são pode ser um problema então é os eventos software são problemas só que você pode lançar mão dessa estratégia utilizando essas casas

que são que fazem um único corte e não dois e você aumenta a especificidade do Sistema porque porque você desenha um sistema críspera aqui um esquema um sistema crítico utilizando um RH guia que vai para o mundo determinado Alfa numa determinada região e um outro sistema Cris por um outro RNA guia que uma outra região só que fisicamente próximas um das outras uma da outra esse sistema crispway corta essa fita esse sistema crisper corta essa outra fita a clivagem aqui só vai acontecer o reparo seja por HDR pela Via Nerd só vai Acontecer quando ambas

as cascas quando ambos os sistemas aqui é estiverem funcionais Então você aumenta a especificidade porque as duas juntas tem que estar funcionando para que aconteça o corte porque se você tem essa daqui cortando aqui né Essa grna1 aqui um sistema um cortando aqui e cortando ine especificamente um evento of target um outro lugar ele até pode cortar em outro lugar só como ele corta uma fita só ali não vai acontecer o sistema de reparo Não vai ter na ativação dele não vai ter nada e vai cortar se ela vai ler reparar e acabou não tem

problema só vai acontecer vai nós vamos acionar as vias né de HDR nesse caso aqui quando você utiliza os dois sistemas uma cortando uma fita e o outro cortando a outra feito também é um racional também parecido com a PCR a PCR para funcionar você tem que ter dois primers fisicamente próximo um do outro para poder fazer a amplificação então aqui um Racional semelhante também bem interessante as nicassi acaso 9 Mota que eu falei para vocês com esse sítios catalíticos falou bastante sobre elas e aí eu falei também né que o gargalo do sistema cryspera

era a região urbana que para funcionar para o sistema funcionar tem que ter aquela trinca de letrinhas lá uma um nucleotídeo seguido de duas guaninas aí você tá limitando um pouco se você tem uma região que é pobre em guanina na Região genômica que é pobre engolina ela é mais rica em ait Talvez ele seja difícil usar o sistema Cris né que acontece pode acontecer só que aconteceu primeiro nós temos enzimas geneticamente modificadas que aumentou a flexibilizou essa sequência Pan e nós temos casos provenientes de outros organismos que utilizam Outra Sequência então aqui modificação do

sítio de reconhecimento do pano geneticamente modificados a evolução direcionada E caso de outros Organismos Então a gente tem aqui não só a cascas 9 né que é a original mas nós temos outras várias casas disponíveis são variações modificações genéticas ou casa e outros organismos que tem que reconhece outras sequências fãs aumentando o leque a possibilidade de uso de chrisper para praticamente qualquer região genómica Olha isso aqui um sistema de alta precisão que interessante né É esse Sistema parecido com das mikazes que para funcionar nós temos uma casa que vai cortar de um lado e a

casa que vai cortar do outro né para funcionar aqui o racional é o mesmo só que aqui nós estamos utilizando uma de K9 uma casa nova morto não ela não vai queimar ela vai o RH vai levar lá até seu alvo e para funcionar nós temos que ter duas uma próxima da outra também porque essas casas aqui elas estão funcionadas com uma outra nuclear que faz o corte de Fita simples chamada fock 1 e essa foque um elas precisam essas essas enzimas que elas precisam de memenizar para fazer o corte Então esse sistema só funciona

quando essas duas casas estão próximas uma da outra para fazer o corte então um sistema muito específico também e o sistema de ativação direto só que é malucaço é muito legal também você pode desenhar aqui entre aspas tá meia-caz cada uma das metades associadas esses elementos esses elementos Olha que Loucura isso aqui esses elementos eles têm afinidade entre eles mas ele só tem afinidade entre eles na presença de Lúcio em um determinado comprimento de onda aqui nesse caso por exemplo é luz azul você vai lá coloca o sistema dentro de uma célula sistema crítica casa

dentro de uma célula ele tá Inativo porque você tem meia casa aqui em meia aqui só que quando você vai lá na célula e joga a luz azul esses dois elementos eles tendem a se dimerizar a se une e Quando ele se unem eles formam a casca inteira funcional E aí o RNA guia vai lá e corta o alto no momento que faz faz a ativação aqui né do sistema crítica então é um negócio legal porque você com luz o pesquisador com luz ele coloca o sistema lá e Ele ativa o sistema quando ele quiser

jogar ele vai lá e joga a luz da luz luz azul aqui nesse caso aí o sistema fica ativo vai lá e corta E se ele tirar a luz ela volta a ficar disfuncional não dá para controlar a Ação da casa e por último aqui só para vocês saberem né não tem sua casa 9 existem outras casas com a CPF 1 a 14A por exemplo de outros microrganismos né ele tem características diferentes tem algumas características aqui diferentes mas é uma uma casa que tem uma sequência rica em intimina né então se você tem uma região

que é rica intimina e Pobre engolindo você pode utilizar outras cascas também Certo meus queridos Então Olha só eu falei aqui corri para falar o máximo de informação boa para vocês para deixar o mais claro possível Afinal de contarem todos são uma técnica de crise mas não dá para a gente se aprofundar muito é o primeiro passinho aqui para você que não conhecer a crise para conhecer mais ou menos agora você tem a visão muito mais clara do que esse sistema é como ele funciona como a gente consegue utilizar na vida real Só que não

dá para gastar um tempo aqui Não sei que a gente faça um evento mais longo em algum outro momento e a gente pode até fazer isso se for o caso mas antes de eu passar o código para vocês eu vou pedir licença para apresentar para vocês esse curso que é o curso introdução à técnica de Cristo que está dentro do clube DNA que eu já vou explicar para você que fala sobre isso sistema ele vai te apresentar Esse sistema de uma maneira muito mais profunda né na teoria e na prática Então Esse é o curso

introdução a técnica de crise é um curso online como qualquer outros cursos até agora a gente tem aqui no universo do meu mal ele até órgão e tem um pá parte prática também porque essa é uma parte de desenho no software lá que eu vou ensinar a desenhar onde encontrar casca como Onde buscar as casas né fazer a clonagem aquela coisa toda então até a parte teórica e prática nesse curso é um curso com cerca de 8 horas de duração ele pode ter mais Depende de você porque ele tá dentro do clube a parte de

Cristo Ele tem 8 horas de duração Mas você pode fazer outras coisas lá dentro também se você quiser E aí aumentando a sua carga horária para bastante carga horária mas o curso de Cris você tem oito horas todos os níveis de informação quem não sabe nada vai aprender do zero que já sabe alguma coisa quem já faz pode aprimorar seu conhecimento Quem comprar o curso vai ter acesso imediato ele está 100% disponível dentro do clube já se comprando vai ter 100% de acesso a imediatamente ali como ele tá dentro do clube do DNA que eu

já vou te explicar o que ele é ele é um clube por assinatura é uma assinatura que assim como você faz assinatura no Netflix o clube DNA e é por assinatura ele tem duração de um ano se você quiser assinar por um antes assina por um ano se quiser renovar para o ano que vem se não quiser Não renova Mas ele tem acesso por um ano que é o período de assinatura Qual que é o cronograma do curso Então nós vamos falar aqui da Visão geral mais ou menos que a gente falou hoje né visão

geral sobre o sistema mecanismo básico de ação Vamos detalhar essa versatilidade da técnica que a crise perturbon Bosque a gente tá falando agora das aplicações falar das aplicações todas eu vou mostrar para vocês como vocês obtém uma caça em um experimento Quais são as Variações da casa como você obtém e quais são as variações do RNA guia ah como você obtém na prática vamos desenhar RH na prática utilizando três softwares de desenho de R vou falar dos controles experimentais para deixar o experimento mais controlado específico né a utilização da técnica deixando mais específico vou falar

um pouco das outras técnicas também como talen como os Ink Fingers que são de edição também e depois finalizar o curso alguma um Racional sobre as questões éticas éticas Como eu disse esse curso Ele está dentro do clube do DNA Então você compra no curso você tem acesso ao tudo que é relacionado ao clube que são bônus extraordinários que o negócio inacreditável que de coisas que você vai ter acesso Então você automaticamente comprando o curso de Cristo vai ter acesso a 100% do conteúdo do clube que que é o clube do DNA o clube do

DNA é uma escola de biologia molecular então Nós temos várias coisas ali dentro entre elas aulas semanais e você pode assistir um sistema um Netflix já tem sei lá se pegar todas as aulas do clube deve ter mais de 200 aulas já tem aula para caramba lá já muita muita aula mesmo muita coisa dá para você ter muito conteúdo e se você quiser para você aprender tudo que é de importante biologia molecular praticamente está lá dentro já pode assistir no computador pode assistir no celular ali diferente Do que acontece no YouTube né meu YouTube ele

tem um monte de conteúdo só que é desorganizado algumas as informações não são tão aprofundados aqui não é uma estrutura organizada uma plataforma fechada as aulas são organizadas por tema a gente vai ver daqui a pouco já tem o sistema de busca tipo Google se você quer aprender sei lá a pessoa primer você coloca primer lá e vai ver o que tem sobre primer no clube durante a aula ao vivo você é chat em Tempo real como a gente tá fazendo aqui só que no YouTube né E você isso é negócio legal você pode fazer

o download das aulas sabe vai viajar Vai pegar um ônibus não quer gastar o 4G 3G põe aí baixa e assiste as aulas né tem espaço para tirar dúvida durante as aulas ao vivo e certificado Claro que tem certificado é um curso é uma escola você assistiu aula recebe o certificado boa parte dessa certificação de emissão automática só para você ter uma ideia do Que eu tô falando não vou ficar mexendo muito aqui ó deixa eu eu esse aqui cadê ai tem que tirar aqui aqui está o clube isso aqui é a área de membros

do clube então nós temos ó cada parte essa aqui é um tem uma caixa tá de aula então nós temos a aula ao vivo dessa semana que é quem vai assistir aula vivo vai clicar aqui tem o curso de crisper tá aqui todas as aulas do curso de Cristo tem um curso gigantesco e esse curso aqui é um curso preferido do Clube É o curso de PCR em tempo real na teoria e na prática do Zero análise dados na teoria na prática é um curso especial em tempo real que fala tudo de PC em tempo

real eu falo tudo são seis módulos de teoria sobre PCR em tempo real e um módulo gigante que é um módulo 7 que eu faço na prática no laboratório extração de DNA extração de DNA faz controle de qualidade vai no drop Vai um monte de coisa faz PCR em tempo real vários equipamentos fazem um monte de aplicação E tem as aulas no computador também então ele tem hora que prático tem aqui informação básica biologia molecular técnica de biologia molecular tem as aplicações tem aulas de prática em software tem aulas não relacionados à biologia molecular que

é uma das coisas do clube a abrir expandir o conhecimento ela sobre finanças pessoais aqui sobre o mercado de trabalho e tem curso completo eu vou mostrar o curso completo daqui a pouco né além do curso de PCR em tempo Real e o de Cristo Ele tem outros cursos também é que eu não quero me alongar muito aqui para não ficar amassante e tem outras coisas nós temos ali dentro cursos completos e essas aulas tem a formação quem não sabe nada de biomol vai lá na formação básica em biologia molecular Ah eu quero sei lá

entender um pouco melhor sobre os mercados de atuação não sei o que eu vou fazer da minha vida se eu vou ser pesquisador se eu quero trabalhar Tem um curso completo sobre os mercados de atuação tem um guia geral para concursos Quem é essa aqui é do Bruno do Bruno do medicina padrão ele gravou para mim tem curso de obtenção de primer sonda tem curso fundamentos genética quem não sabe genética ah eu tô eu tenho dificuldade na parte básica gente tem um curso completo lá sobre genética tem esse curso de PCR em tempo real tem

um curso de análise de pressão gênica tem um curso completo de ngs é conhecimento De Nova Geração você viu tudo isso tem um monte de coisa ainda quer não sabe se quer você pode testar vai lá Testa o público por sete dias grátis acessa Tudo Que Você Quiser gostou fica não gostou vai embora sem problema nenhum não paga nada por isso pagamento extremamente seguro você pode pagar de várias maneiras cartão de crédito cartão boleto bancário você pode pagar de diferentes maneiras tem nota fiscal mas são missão de nota Fiscal e se você quiser Universidade Bemol

empresa formal emite nota tudo se você precisar pagar com taxa de bancada com reserva técnica você não tem problema você pode pagar porque a gente emitir nota fiscal e coloca o número do processo envia por e-mail né pede por e-mail lá preciso do número de processo da minha nota a gente coloca aí você pode é um curso afinal de contas é um curso normal né tá bom Um abração um beijo para vocês até a próxima aula Tchau tchau [Música] [Aplausos] [Música] [Aplausos] [Aplausos] [Música]