olá seja muito bem vindo ao universo da biologia molecular a aula de hoje é um resumão sobre a aula de pcr essa aula que vocês estão vendo essa que vocês vão começar a assistir agora é um resumo de uns 40 quarenta e poucos minutos sobre a aula principal sobre pcr eu fiz uma aula uma aula introdutória pr está bem completa que tem por volta de uma hora e meia mais ou menos mora e 35 e essa aula que vocês vão começar este é um resumo sobre a sala principal se vocês quiserem assistir aula completa acessem
a playlist aulas completas e vocês procurem aula de pcs daqui é apenas um resumo tá bom agora se você está com preguiça está sem tempo já assistiu a outra aula só quer rever os conceitos principais essa aula aqui é indicada pra você antes a gente começar deixou de pedir algumas coisas por favor não se esqueçam de compartilhar esse vídeo caso vocês acredite que o conteúdo deles seja interessante pra algum colega de laboratório algum amigo também não se esqueçam de se inscrever no canal deixar um like e manda seus comentários pede uma aula pede um tema
que eu faço aula pra você e beleza fazendo essas quatro coisas que eu te pedir você vai ajudar o canal se desenvolver você vai alimentar o algoritmo do youtube o algoritmo do google ele vai entender que esse tipo de conteúdo relevante pra você para pessoas com um perfil parecido com o seu e assim por diante a gente vai fazer a comunidade crescer o conteúdo de qualidade vai continuar saindo e button todo mundo feliz beleza então dá uma olhadinha nessa lei que ela tá um show até já [Música] [Aplausos] [Música] vamos lá fazer a introdução então
aqui a pcr a pcr a pcr ela é a mãe de todas as técnicas de biologia molecular eu não conheço nenhum laboratório num mundo que não faça percebem sua rotina pelo menos de alguma maneira seja eva indiretamente alguma variação apesar de alguma maneira todo laboratório de biologia molecular pelo menos eu conheço fazem pensar em algum homem porque isso porque é certo ela resolveu dois grandes problemas que todos os pesquisadores todas as pessoas que trabalhavam com um biologia molecular mais especificamente manipulação de ácidos nucleicos tinha antes dos anos 80 antes de 1985 essas pessoas esses pesquisadores
existem basicamente dois problemas para se trabalhar com dna se no campo de modo geral mas afirmou cláudio de lima trabalha com dna o primeiro problema é o seguinte quantidade imagine que para você conseguir analisar uma molécula de dna é uma molécula foi uma moleca você precisa ter grandes quantidades é você possa ter grande quantidade dá aquela marca para que você consiga de algum modo tornará visível se identificar analisar detectado de uma maneira é o primeiro grande problema é a quantidade segundo problema especificidade como é possível analisar uma região específica do dna porque muitas vezes na
grande maioria das vezes os pesquisadores eles não querem analisar o genoma completo eles não querem analisar num fragmento gigantes de dna do genoma eles querem analisar um fragmento específico um gene específico alguma região ali e seja relacionada com sua pergunta experimental com o teste que ele queria fazer um importa então o segundo grande problema era da necessidade de analisar somente aquilo que eu quero analisar pois é que a pcr ela resolveu justamente esses dois problemas de mão na cabeça ela vai fazer um negócio que é relativamente semelhante ao que a célula já faz naturalmente com
a técnica da pcr é possível pegar um fragmento específico de dna e fazer muito muitas e muitas cópias daquele fragmento a célula quando ela vai se dividir ela faz algo semelhante né mas ela está em processo de vitória que ela tem que fazer ela tem que pegar o seu genoma o seu dna no lado de natalie replicá aquele fragmentos de dna e genoma para que as suas duas células filhas tenham as cópias desse genoma então ela faz isso na usa todo aquele maquinário presente dentro da cela pra conseguir fazer essa replicação a pcr vai fazer
algo semelhante vai replicar dna também só que ele vai fazer isso dentro de um ambiente artificial não vai fazer isso dentro de um tubo de ensaio já vou falar aí como é que só não acontece mas antes era só pra não esquecer aquilo por que a pcr isso é uma sigla que significa reação em cadeia da polimerase que vem do inglês bully race team o action da sigla veio português como ela no inglês que a pcr mas é por isso então a reação em cadeia da polimerase e como eu falei pra vocês então a pessoa
ela vai fazer algo semelhante o que a célula faz naturalmente replay pegar o seu dna replicar esse dna no processo de unidose para que suas células filhas nenhum cópias desse genoma a pessoa vai fazer somente não vai fazer isso de um genoma inteiro nós vamos fazer cópias é de um fragmento específico então dá uma olhada que imagina aqui que eu tenho um fragmento de dna seja ele um gênio na região genômica mesmo chama contato com nosso que estou mostrando aqui em azul e eu quero fazer cópias de um pedaço desse fragmento que eu estou mostrando
aqui em vermelho então quero fazer cópias de si é fragmento vermelho sei lá porque não importa porque ainda há uma aplicação uma coisa me interessa analisar esse fragmento vermelha que eu preciso fazer cópias desse fragmento vermelha e cópias e é justamente isso que eu faço eu faço centenas milhões milhões de cópias de um fragmento específico então resolvendo a crise dos problemas que eu falei pra vocês fazer cópias de fragmentos específicos ou seja aumentar a quantidade de dna não é de qualquer de dna só daquela região que eu quero analisar mas vamos lá eu quero falar
para vocês agora explicar para vocês como é que a pcr funciona então a gente falou da estrutura a agente falou aqui um pouco de estatística da probidade fragmente a melhorarem a outros alimentos e agora vou falar explicar como é que funciona percebe porque com essas duas já falei vocês conseguem entender como funciona a pcr depois a gente fala mais especificamente da no terceiro ponto lá quer os ingredientes beleza então é que funcione apcef bom a gente falou que vai fazer a replicação várias cópias de um fragmento específico então pra que isso aconteça a gente colocar
todos os ingredientes todos os componentes todos os consumíveis ou todos os reagentes necessários para que o dna seja replicado para que um fragmento específico de dna seja replicado seja copiado seja amplificado quando a gente está num contexto de pcr a palavra amplificação significa fazer cópias de aumentar de tamanho taton que um fragmento específico seja amplificar a gente vai colocar todos os ingredientes ali não só os ingredientes a gente vai piar a gente vai gerar condições ideais para que esses reagentes funcione para que eles trabalhem e a se replicar fragmentos específico de maneira específica essa reação
geralmente acontece em um tubo de 0 2 ml ou 0 5 ml de 200 a 500 micro ônibus de modo geral então vamos lá dar uma olhada aqui a primeira coisa que precisa colocar é o dna molde né é só colocar o daniel mode o dna o seu dna que contém o fragmento que você quer amplificar o n é o fragmento que você quer verificar pelo menos ali dentro tem o dna que você quer o fragmento que você quer ficar ainda pode ser um dna genômico ele pode ser um produto pode ser resultado de marcona
g1 hipótese pode ser um gênio não importa é alguma coisa um fragmento de dna que você colocou ali e você quer fazer cópias deste fragmento ou de uma parte dele e aí nós precisamos colocar uma enzima que a dna polimerase o nome dela já diz não a dna polimerase ela polimerizada dna então voltando à nossa loja da construção nem a casa que a gente quer construir os nucleotídeos sons de joguinhos mas a gente seja um pedreiro se a gente pode considerar a algum regente aqui pedreiro é a dna polimerase porque ela que vai pegar os
nucleotídeos que a gente coloca na reação eu não falei de ainda no sofá daqui a pouco ela que perde o título de coca na reação e utiliza esses núcleos para formar as novas fitas que estão sendo copiadas aí nós temos justamente os tijolos nucleotídeos adenina timina adenina citosina esses quatro núcleos ativos disponíveis ali nem solução na reação para a cadeia da polimerase utilize uma fita com o molde e faça cópias desse modo nós precisamos também dos trailers eu vou explicar para que servem os primeiros a sair na frente mas saiba desde já que se tem
um cara que da especificidade para a reação falei que a reação da pessoa ela resolve os problemas um deles é a especificidade quem é o responsável por resolver o problema da especificidade são os fracos e aí a gente também colocar ali 111 e valente geralmente utiliza magnésio pode ser manganês também às vezes podem até ser 11 novamente mas na grande maioria das vezes você vai utilizar e magnésio ele é o fator da dna polimerase e ela precisa dele do magnésio para funcionar então vamos lá como é que a função da reação você colocou tudo isso
aí dentro de um tubo você criou condições para que a reação ocorra ou seja criar condições significa a manutenção do ph então ali tem uma solução tampão que você mantém uma concentração de sal ou seja a pressão osmótica controlada também para que a reação como o terceiro componente é a temperatura que eu vou mostrar pra vocês o que a gente está olhando e dentro agora essa minha tela é o que acontece dentro do tubinho está olhando para dentro do tubo e até certo a gente pode dividir a persegue em três passos principais o primeiro passo
é isso que eu estou mostrando aqui pra vocês a chamado de de naturalização olha só esse fragmento de dna que ó esse é o meu fragmento alvo é esse fragmento eu quero copiar é ele que eu quero fazer várias cópias é ele que eu quero amplificar beleza e se fragmentar joaquim se você tiver trabalhando com dna genômico um gene não se esqueça que pra cá pra direita a instabilidade vão dizer 5 linha tem mais um monte de dna pra cá tem um monte de dna também de moto daniel ligado aqui olhada aqui só que isso
não interessa agora eu vou mostrar pra vocês só o fragmento eu quero unificar o resto não importa agora então eu 'tô' olhando para dentro do tubo e se tudo está com todos os ingredientes com todas as condições que eu falei pra vocês ea temperatura ambiente e 25 graus se eu pegar esse tubo e aumentar a temperatura dele para 95 graus o que acontece com essas pontes de hidrogênio e negão uma fita de dna na outra ela se rompem ela se dissociam elas de natura formando então duas fitas simples nossas duas fitas que antes estavam unidas
formando a molécula de dna 100% complementares né elas a 95 graus elas dissociam elas de natural formando duas fitas simples e esse foi o primeiro passo da pf você mantém essas condições aqui por alguns segundos e depois você vai mudar a temperatura de novo que a gente vai para o segundo passo o segundo passo é chamada de anelamento onde nós vamos baixar a temperatura de 95 graus para mais ou menos 60 e mais ou menos porque isso varia depois explico por quê faria mas vai ficar ali na casa dos sessenta e um modo geral e
é e é nessa temperatura que os primers entrou em ação e o que são os primeiros os prêmios são trague memsos fita simples de dna e tem por volta do que 20 núcleos e esses 20 nucleotídeos eles têm uma seqüência aleatória não eles têm uma sequência exatamente complementar a extremidade do fragmento alvo que eu quero simplificar então esse praia que eu estou mostrando aqui pra vocês ele tem essa sequência aqui porque ela é exatamente complementar a extremidade do meu fragmento ao portanto de um modo geral para se fazer pcr é necessário conhecer pelo menos a
seqüência de nucleotídeos do seu fragmento ao toque e automoção um primer que tem essa seqüência aqui cc jeater que é justamente complementar ao gdf se a lembrar eu falei pra vocês pra meter por volta de 20 nucleotídeos então a chance de se privar de 20 nucleotídeos encontrar complementaridade é uma chance mais de um trilhão ou seja se esse primeiro saque ele foi desenhado ele foi sintetizada ele foi criado pra selar essa extremidade aqui é muito improvável que ele vá se até lá qualquer outra região do genoma se é fã de um ano por exemplo o
genoma humano como eu falei pra vocês têm por volta de 3 bilhões de nucleotídeos ou 3 milhões de pares de bases e um primer de 20 nuclear tiveram apenas uma chance em mais de um trilhão para encontrar complementaridade a ele ou seja se a gente considerar o genoma humano então é muito improvável que um primer de 20 nucleotídeos ianelli a duas regiões diferentes do genoma humano estatisticamente falando apenas concederam apenas probabilidade acontece esse prêmio se ligar em duas regiões diferentes acontece mas não vem ao caso agora agora o que interessa é que vocês foquem isso
que é justamente pelo fato de o primeiro ter essa seqüência específica de nucleotídeos exatamente complementar esta unidade no fragmento ele só vai se ligar e pra gente fazer percebe que não basta fazer um primeiro específico a uma extremidade do meu fragmento tem que desenhar dois prêmios um programa que vai se ligar à essa extremidade do meu dna do fragmento alvo e um outro prêmio que vai se ligar na outra unidade no fragmento ao certo nós temos duas dois eventos de mobilização aumentando ainda mais a especificidade não é por isso que os primeiros são os caras
são os responsáveis por darem especificidade para a reação de pcr que é muito improvável que ele se alie em lugares que não foram feitos para agentes então nós vamos baixar a temperatura e para mais ou menos 60 graus e essa temperatura a temperatura ideal para que os primers se associem a região onde eles são complementares então a 60 graus aqui nós tivemos um processo de alinhamento dos casos voltando o primeiro passo 95° a coleta de dna dupla fitas o senhor por mano duas fitas simples segundo passo achamos a temperatura para a 60 graus mais ou
menos 30 graus a temperatura ideal para que os primeiros se assim as extremidades do meu fragmento aos e aí a gente vai para o terceiro e último passo que é chamado de extensão que é quando a dna polímera se ela vai começar a construir as novas fitas e quando o pedreiro vai começar a trabalhar é quando o pedreiro vai começar a colocar aí os tijolinhos só que de nápoli mirada ela não começa a trabalhar e atualmente já não se liga aqui algum metade do meu fragmento começa adicionando que o tio maneira aleatória que não ela
precisa dessa estrutura aqui ó ela precisa de uma estrutura de dna dupla fita pra começar pelo menos começar a funcionar os nucleotídeos então é por isso que a gente possa colocar os primeiros também porque somente através da é dessa estrutura de dna dupla fita mesmo que seja pequenininha de apenas 20 nucleotídeos aqui 20 pares de bases adenina primeiras ela consegue associar e adicionar os nucleotídeos que a gente é disponibilizou na reação e tem um outro negócio também a primeira parcela na hora de sono clotilde em qualquer direção não ela sempre adiciona nucleotídeo no sentido 5
linha para o 3 minutos você pegar a fita de dna molde aqui o o nosso primeiro single de maneira específica extremidade adene apolinário ela vai se associar essa estrutura de dna dupla fita e vai funcionar no coletivo no sentido 5 linha 3 mil que é isso aqui eu vou mostrar pra vocês já e ela faz isso e ela faz isso uma temperatura de 72 graus celsius na verdade ela trabalha em diferentes temperaturas mas 62 graus celsius ela funciona muito bem por várias razões depois eu falo para vocês então a gente não vai aumentar de 60
graus para 72 nessa situação essa temperatura com os prémios associados a dna polímera se liga aqui e ela vai pegar essas nucleotídeos que a gente disponibilizou a ação que estão livres sem solução e vai começar a construir uma fita exatamente complementar a fita que ela está usando com o molde então aqui ó hoje ligando conselho de concerto e com a secom g até até às cinco já estão andrea poli mirada vai usar essa fita com o molde e criar uma nova fita exatamente complementar a ela é isso aqui que ela faz e assim nós terminamos
um terceiro passo da pcr terceiro e último passo e olha só que interessante vamos lembrar que no começo dessa reação nós tínhamos um fragmento ao né o fragmento álbum aí a gente fez o primeiro passo é natural ou a indiferença no paços primeiras larvas fez o terceiro passo estendeu a anapolina e as crianças são as duas novas fitas e no final esse terceiro passo nós temos duas moléculas idênticas agora se a gente pegar essas duas moléculas que a gente acabou de fazer e começar tudo de novo começará no primeiro passo só que agora nós vamos
ter duas moléculas e não uma só se a gente fizer o primeiro passo de novo nós vamos de natural essa fita ao som de naturais a fita nós ganhando essa fita de natural essa fita o primeiro depois 60 graus vai se ligar na extremidade a essa extremidade a extremidade e esta unidade a primeira vez vai formar uma nova firma nova fita uma nova fita uma nova fita então no final a gente repetir agora com 2 com duas moléculas no final nós teremos quatro têm de pegar repetir de novo começando com quatro no final a gente
vai ter oito quem pedir de novo agora utilizando começando 18 e 18 16 depois 32 depois 64 128 assim por diante ou seja se a gente repetir se a gente fizer ciclos desses três passos 20 30 40 e 50 vezes a gente vai amplificar de maneira exponencial esses fragmentos a gente vai fazer cópias desses fragmentos aos né não é qualquer fragmento o alvo porque o primer sócio liga naquela região então depois d 30 40 50 secos a gente tem milhões ou milhões de mortos pega o lugar do qual é o fim da pcrm aqui ó
o fragmento de dna sintetizado em um dado o ciclo da pcr não está falando com a pessoa e tem três passos e três passos juntos a gente chama de circo então a cada vez que a gente comece um circo a gente aumenta a quantidade de dna olha só o fragmento de dna sintetizado em um dado ciclo da cef ele serve como um molde como substrato para a formação de novos fragmentos não se com o seguinte e é um fragmento tirando 2 2 044 gerando 8 8 16 de 2005 gente pegou ó se você entendeu isso
você entendeu que persegue você entendeu como que a pessoa é funciona agora aqui ó ficou fácil vamos ver agora mais uma vez aqui uma outra de uma um outro esquema para ficar mais fácil de entender primeiro ciclo da persegue na verdade antes de a gente começar a pensar e vamos supor que esse aqui seja o fragmento ao seu eu quero simplificar esse fragmento e eu comece a pcr com apenas ele só acontece na vida real porque você não vai começar com um fragmento vai começar com vários é bom quando você extrai o dna de marcela
de um tecido mais traem bola está em um monte é só começa já com um bom time mas aqui no meu exemplo está começando com uma só para a gente entender bem como é que funciona então a gente fez aqui apesr o primeiro ciclo da pcr a partir desse dna molde no final do primeiro ciclo nós vamos ter duas cópias desse fragmento se a gente repetir de novo os três passos da preserv fizer mais um ciclo portanto agora começando com duas a gente passa a ter quatro no final do segundo ciclo sem repetir agora começando
com o fato a gente passa a ter 81 dp de novo faz 16 depois de passar 32 e depois que repetir 30 40 50 vezes nós vamos ter milhões de cópias milhões bilhões de cópias então trilhões aqui porque se você fizer a matemática 'nesse a reação aconteceu de maneira exponencial ac 40 às vezes como a promoção do dá mais de 2 trilhões de cópias só que na realidade não chega tudo isso ou pode não chegar tudo isso o motivo que se você se você não sabe o motivo foi a seguinte o procura e no canal
a minha aula sobre pcr em tempo real procura aí a minha alma sobre pcr em tempo real lá na sessão de hoje os únicos tipos de análise é mais profissional no terço final da aula eu explico porquê que a reação ela não acontece de maneira exponencial até o final até o 40º circo mas até um determinado momento ela conta exatamente como estou mostrando aqui pra vocês vão lá com gerando us 244 16 impor diante beleza vão procurar ainda um ano muito bem quem é que faz essa ciclagem toda essa variação de temperatura que faz 15
152 que ficam a mexer nessa temperatura de novo tentar de 25 e começou a 95 depois 95 praça 60 depois para 72 depois de 95 novo 60 e 72 a 50 quem faz isso 40 vez é uma máquina que faz isso que faz a reciclagem da temperatura o que faz até mo se claro que é o termociclador isso é uma máquina que exatamente é responsável por fazer esse tipo de coisa que temos valor olha só pra você que já faz psr de curiosidade você nunca fez está aprendendo agora a pcr antigamente os termocicladores antigamente ele
era eles eram assim é que não temos calor automático automático no qual haviam três banhos maria um banho maria 95 outras 60 e outros 72 não à mostra ela ficava aqui por um determinado para o primeiro passo na de naturalização a um braço mecânico tirava a mostra aqui passava pra cá a 60 graus ficar um tempo aqui e daqui passava para casa em dois carros um tempo aqui aí voltava pra cá vieram bassuma que antigamente era manual são mesmo uma pessoa lá fazia esse processo é desenvolveram esse temos quadro super rústico fazia isso automaticamente alguém
desenvolveu baby blue negou esse protótipo que de termos declarou as amostras eram colocadas aqui em nesse bloco e até uma ciclagem acontecia de maneira automática mas hoje os telespectadores são super modernos outro mostrando alguns aqui algumas empresas grandes é bastante comercializados no brasil eu estou mostrando alguns aqui pro flex até o fim se o max me dá esse gênio de 100 w rádio o master site do ipem dof que fazem eles todos eles fazem isso e tem várias outras funcionalidades são super modernos e fazem muito muito mais do que isso mas hoje não vem ao
caso e vamos prá análise do produto a pf olha só olha aqui toda a gente fez até não antes né o que acontece depois da pcr o que precisa ser feito para que você consiga analisar o resultado da sua pcr porque antes da pcr olha aqui sua mostra antes da pessoa aqui o seu alvo ainda não foi amplificado você ainda não tem várias cópias dele além de estudos reagentes que você tem ali disponível é estão disponíveis para ração em grande quantidade tudo está pronto para funcionar como é que essa turbina a situação tá aqui ó
assunto mim é assim é assim que está a sua mostra antes da pf e depois a persegue seu pragmatismo amplificou já não tem mais nem a sendo gerado já não tem muitos dos seus agentes disponíveis para a reação e conectar seu tubinho também está sem o motor nada se você olhar olho nu é igualzinho não vai mudar nada isso quer dizer o quê que nós estamos analisando uma molécula profissionalizar a molécula você detectar e identificar é fazer qualquer coisa com ela não basta fazer várias cópias você precisa dar um jeito de enxergar entre aspas essa
molécula estar dentro do tubo e eu vou mostrar pra vocês uma das maneiras de fazer isso pode fazer isso de algumas maneiras eu vou mostrar a mais tradicional zona que é através da eletra foreci a eletroforese permite a migração e separação de partículas dna proteja o nosso caso aqui é dna porque é produto de pcr sob a influência de um campo elétrico aplicado a uma crise permeável um gel a agu entende nada calma vai entender você vai entender porque o explicado em jeito você nunca mais vai esquecer olha essa floresta aqui que belezinha a floresta
fechada com bastante água é difícil de passar por dentro dela agora imagine que existem três indivíduos que estão querendo atravessar a floresta aqui um deles com um piloto é o símbolo filhote ainda que o outro é o último porque que estão querendo correr nessa floresta porque atrás deles estão vindo a cenas as meninas estão vindo a toda velocidade eles precisam atravessar a floresta aqui cheia de árvore e chegar do outro lado que só assim chegamos do outro lado aqueles vão escapar das hienas e se você está pensando a essa floresta e no fundo não é
uma floresta da savana não é um ambiente que o timão o simba vivem você tá pensando isso é o seguinte a um like na o vídeo se inscreve no canal fecha ao a cirurgia então vamos lá o timão o pumba o simba eles possam atravessar nessa área da floresta fechada porque as linhas estão vindo atrás deles quem que vai passar mais rápido pelas águas um puma quer gordo que é grandão um timão que ela é vinho é menor ou simba que é mais da metade dos dois homens que vai passar mais rápido por esse monte
de abri muito provavelmente a gente pensar que os três correm na mesma velocidade muito provavelmente o timão na última hora leff ele é pequenininho e vai desviando no meio das árvores tranquilamente vai chegar lá do outro lado mais rápido em seguida vem um simba e depois o timão é o ideal pois o público é mais gordinho mais pesado vai demorar mais para atravessar a floresta se você entendeu isso você entendeu porque eletroforese eletroforese nós temos um pólo negativo nós temos um pólo positivo entre esses dois pólos nós temos uma malha é um gel ou gel
pode ser um gel aqui feito de uma de um sistema chamado agarose o folha online então já o zinho que tem malha então como se fossem as árvores e nós temos três moléculas três fragmentos de dna as três de tamanhos diferentes um fragmento grande fragmento intermediário foi muito pequena esses três fragmentos 63 vamos dizer são três por produtos de pcr eles são colocados próximo ao pólo negativo eu falar um negócio que eu falei pra vocês ainda molécula de dna e rna também lá tem carga negativa que mostrar já para vocês porque ela tem carga negativa
então a gente vai colocar esses fragmentos três fragmentos de dna juntos próximo ao pólo negativo ea gente vai gerar corrente elétrica a gente gera a corrente elétrica esses dna seis fragmentos de dna que tem carga negativa eles vão entender aí para o pólo positivo só que eles vão ter que para chegar no pólo positivo que tem que passar por essa malha que no gel e eles vão migrando migrando migrando em velocidades diferentes os fragmentos menores ou de peso molecular menor nos ligam mais rápido com mais facilidade entre a malha do gel e os maiores mais
devagar e olha que só pra vocês verem entender porque ganhar têm carga negativa então ó é a que nós temos é o mesmo esquema que eu mostrei pra vocês só que de renda molécula então que nós temos a base nitrogenada aqui nós temos a pentoses né de açúcar a marca de açúcar que o grupo fosse fato olha o grupo fosfato que ele tem um oxigênio com carga negativa e é por isso que o dna tem carga negativa pulo do gato da elektro florezinhas a velocidade de migração de um fragmento de dna pela malha do gel
seja ele de poliamida o gel de agarose no decorrer de uma eletroforese é determinada pelo seu tamanho ou seja pelo seu peso molecular em seu lugar de eletroforese tomar de novo quem são esses três fragmentos aqui ó aumento um fragmento 2 fragmento 3 são três produtos de pcr que estão dentro do seu tubo você fez a pcr sua pcr vou explicar porque nesse meu exemplo você gerou três fragmentos dos tamanhos diferentes você gerou indicou três alimentos diferentes estão os três aqui dentro desse tubo não vai fazer é pegar esse produto e seu produto da pcr
e colocar no gel aqui uma foto de um já a verdadeira difícil um pouco difícil mas achamos gel verdadeiro uma foto já verdadeiro do processo de criação desse gel de produção desses jogos e já cria pocinhos onde você vai colocar as suas amostras em cada buraco desse aqui onde vai uma mostra e esse pólo negativo positivo e eletricidade o campo elétrico é dado em uma estrutura como essa que o aparato de eletroforese só que nós temos um pólo outro pólo lembro qual é o seu preto postigo negativo mais as mãos porque seja negativo especial positivo
positivo negativo aqui dentro vai o seu gel e os seus ossos à mostra os movimentos e fox hoje na tomada de uma fonte gera energia elétrica ea mostra vai começar a migrar mas para enxergar de fato seu dna os seus fragmentos de dna você precisa de um agente corante de um agente intercalando de dna que imita florescência você pode que são esses agentes esses agentes são moléculas que quando o que tem afinidade é dna dupla fita esses agentes quando estão associados com nice associam ao dn a dupla fita eles passam a emitir florescência lesão muito
muito o nível de florescência que eles emitam quando eles estão a sua vez quando eles estão em solução sem a presença de miami sem medo uma flor essência baixinha quando eles se associem a marca de dna fita dupla espaço miti muito mais florescência e é essa fluorescência que você vai enxergar é ela que vai te dizer aonde está se está se está a pensar e funcionou e como funcionou é do seu fragmentos de dna então é o agente corante aqui o ou flor ó fruet existem vários desses intercalam antes o mais utilizado é o projeto
de ti g1 ela dobrou é detido é que ele é cancerígeno então tem que tomar muito cuidado para manipular esse sr a gente tem que ter uma área específica do laboratório e pedras específicas do laboratório não pode trabalhar mas nem pensar sem luva comprometo mas existem outros intercalando cita que funcionam também enquanto que não são cancerígenos como saiba por exemplo você pode utilizá-los também vai funcionar basicamente do mesmo jeito então essas mudanças vão se intercalar o seu dna ao seu produto de pcr e aí com uma luz específica você consegue enxergar florescência que eles dinheiro
então aqui nós temos os nossos pocinhos com a mostra o primeiro pocinhos temos led no marcador na mostra a nossa 7 já com a gente carregador e já com a gente entregar um lanche também que vai gerar florescência mas só uma curiosidade é que o agente k inter garante que vai fazer com que você enxergue seu dna ele pode ser colocado diretamente no dna da sua mostra e você pode banhar no gel com assim a gente entregar noite também tá mas o fato é que a pgr vai acontecer nessas condições com as condições que eu
não sei pra vocês é o seu dna junto com esse tanto um carreador aqueles com graas suas amostras estão aqui algum lugar a gente não consegue ver ainda apesar dela já está com o corante com a gente durante o compromisso de ti ti ou com o teclado de dna ele só não consegue ainda porque a gente não jogou a luz que deve ser jogada para que a presença seja gerada é isso que vai fazer seguindo então a eletroforese aconteceu com todas as condições que eu falei pra vocês gente vai pegar esse joãozinho aqui e é
em si dir ou passar luz por esse gel uma luz específica de comprimento de onda específicos que faça a flor essência do seu agente florescente o seu corpo antes de brilhar então se compromete por exemplo esses pontinhos mais clarinhas que estava nessa imagem são os fragmentos de dna que brilharam porque estavam intercalados com o compromisso de atingir ou com saibro tanto faz é a luz cada corante o cada flor o flu ele floresce a fluorescência dele é citada é é através ou por meio de diferentes comprimentos de luz então pode ser caso objetivo ultravioleta por
exemplo ou pode ser um led para outros flor ovos como saiba você consegue citar com led aes e esse lugar onde vocês se de luz sobre o seu gémeo é chamado de trânsito minador uma translação não vai passar a luz aqui por um jogo muitos dos três mineradores eles já vêm equipados com câmeras fotográficas você tirar foto do seu resultado é certa quando é esse o caso eles são chamados de foto documentador estão aqui eletroforese nosso caminho depois que aconteceu essa aqui é a foto real de uma eletroforese então é isso aqui acontece na vida
real depois que você faz uma neta florais e cora é os seus fragmentos de dna com a gente falante e com flor off coloca na transmigração tirar foto e é isso que você vai analisar se estão aqui no primeiro poço oled é nós temos as bandas cada negro assim desde que você está vendo achado de banda que nada mais é que fragmentos de dna de peso molecular diferente então aqui nós temos um tratamento de dna com maior peso molecular como eu sei que tem maior peso molecular que ele migrou - ao longo da época favorece
esse aqui pouco maior pois um pouco menor o peso 64 que eliminou um pouco mais de todos esses aqui que tem menor peso molecular é esse aqui o que correu mais ao longo de eletroforese e no caso do líder eu sei que esse fragmento de dna ou essa minha banda a eletroforese tem por exemplo mil pares de base esse outro aqui tem 900 para de barras e oitocentos e que tem 500 ac tem 300 286 lá importa eu sei eu conheço o peso molecular de cada uma das bandas do meu peso molecular ou do meu
éder porque o conto isso aqui vende dessa maneira comprar diferentes marcadores moleculares peso molecular diferentes leves e aqui as minhas amostras a minha mostra que ela gerou um fragmento de pcr solo da pcr essa outra que gerou 2 também essa que também gerou um sonho de outro peso molecular além disso o que deve fazer com a pcr para fazer várias coisas o pcp é muito versátil para hoje à noite parte que a identificação de genótipos exatamente o que eu acabei de explicar e atrás é um exemplo de genotipagem você pode detectar ou identificar o organismo
se você fizer um se você trabalhar com um conjunto de primers que amplifica especificamente um fragmento de um determinado organismo de um determinado patológico em nada mais você consegue detectar a presença dele no lugar por exemplo imagine que você tem uma comida sei lá um peixe e talvez esse peixe esteja contaminado com o patógeno x que você faz está no dna do peixe só que você utiliza primers que amplificam o genoma do patógeno o material genético do patógeno se o patógeno tiver presente o material genético dele vai estar presente em si material dele chinês que
tiver presente os primeiros vão modificar acre fragmento importante você consegue através da geração de banda geração de produtos de pcr identifica a presença de um pacote isso é problema nisso também se você tiver um organismo que você quer identificar uma carcaça por exemplo apreendida não sabe aquela carcaça de boi se à caça de um pouco ou seja um animal silvestre uma capivara por exemplo é que você vai saber a casa não dá pra saber e às vezes não dá pra saber quem possui um dna da cas e amplificá aquele material genético da carcaça com vários
prémios e simplificar um prêmio que é específico da espécie da capivara você descobre por exemplo a carne era de capivari não ligou é um efeito dominó que você pode usar o teste é de dna para a identificação de doenças hereditárias isso é muito utilizado para humanos animais também animais de estimação e animais de produção é plantas também forense a coisa que vão fazer a pcr diretamente no campo florence hoje ainda ela continua mesmo você consegue discriminar um indivíduo do outro amplificando regiões específicas de cada indivíduo que cada pessoa tem o seu dna ninguém mais no
mundo têm a mesma seqüência de dna que você que eu que seu irmão sua tia todo mundo cada um tem a sua o seu fragmento que é única e específica o seu e através da pc você consegue explicar algo que seja exclusivo seu mas sim quando bem simplificada isso mas a pcr talvez aí mais importante hoje em dia do que as aplicações diretas da pcr são a aplicação da pcr fluxo de trabalho de outras técnicas porque pra você fazer sequenciamento sanger sequenciamento nova geração z coronário fazer pcr em tempo real para fazer pr digital para
fazer mais por lei para fazer um monte técnica você precisa aparecer em algum momento do fluxo de trabalho dessas outras técnicas se utiliza percebe também na pcr ela não é só importante pelas aplicações diretas dela mas pelas modificações que ela sofreu também eu como a inserção da pcr no protocolo no fluxo de trabalho de outras técnicas [Música]
