Introdução à PCR em Tempo Real

Olá seja muito bem vindo ao universo da biologia molecular olha só se você pretende fazer pensar em tempo real ou não entendi direito o que é o tal estudando vai fazer uma prova não importa se você precisa de informação sobre pcr em tempo real hoje eu vou trazer um conteúdo que é feito pra você nessa loja de hoje nós vamos falar sobre a pcr em tempo real os conceitos básicos Entre um pouquinho cansado então se você não tem direito como é que funciona a técnica se você não sabe o que fazer no seu experimento não

sabe sem esse tipo de técnica que você vai usar esse conteúdo é pra você deixa de pedir uma coisa antes a gente começa ao deixe de pedir um negócio se você assistir essa aula gostado conteúdo não esqueça por favor de se inscrever no canal e de dar um link por dois motivos primeiro porque se você Fizer isso você alimenta o algoritmo do youtube e youtube vai entender que esse conteúdo ele é relevante pra você e pessoas com o seu perfil com o seu mundo perfil parecido com o seu segundo objetivo aqui é compartilhar informações informações

sobre técnicas relativamente complexas é colocar tudo isso de uma maneira organizada para que todo mundo possa usufruir ou seja é construir uma comunidade de troca de informação sobre genética biologia molecular técnicas de Biologia molecular dependendo da i do que você do que os nossos colegas é que quiserem sul taques em aprender beleza então olha quanto roda vinheta não se esquece de escrever e dom aquino vídeo até já [Música] curto bem então vamos começar a aula de hoje e hoje como eu disse para vocês nós vamos falar de pcr em tempo real vamos começar com os

conceitos básicos e se vocês assim precisar a gente evoluir Para conseguir mais avançados depois essa aqui eu vou dividi-la em quatro partes a primeira parte são os conceitos iniciais então explicar como funciona a técnica ou falar um pouco de pcr porque a base da pcr em tempo real talvez um pouco de pcr então fala de pcr falar dos conceitos iniciais da pcr em tempo real depois nós vamos falar do sistema de detecção hoje especificamente a falar de dois que são os dois mais utilizados no Brasil que eu saiba ele o takuma mas se você aí

utiliza outros sistemas de detecção que quer saber sobre outros sistemas de detecção que você já ouviu falar manda mensagem pra mim que eu gravei um vídeo pra você depois de ver falar dos tipos de análise os dois tipos basicamente a gente pode fazer e mais a verdade mas as duas principais competições em tempo real as análises Qualitativas essas análises quantitativas então vamos lá muito bem se você está assistindo à sala de pcr em tempo real eu estou assumindo que você já tem conhecimento básico sobre pcr a gente vai falar de pcr aqui pra eu comentei

pra você mas se você precisa de um pra entender exatamente sala você precisa de um conhecimento é no mínimo intermediário sobre o pcf beleza tá se você não entende nada tudo bem você vai conseguir Pegar a informação geral mas eu te aconselho dar uma estudada em pc rs às aulas depois eu assumo que você conheça entender sobre a estrutura de dna eu assumo que você conheça um pouco sobre os tipos porque eu vou mencionar slips ao longo dessa aula e que você entenda um pouco sobre eletroforese que também vou mencionar rapidinho que eletroforese aproveitar e

se esse slide slide anterior é falando sobre os temas que eu converso com vocês nesse canal me Manda e se você acha que precisa de alguns dos temas que eu mencionei anteriormente ou se você quer como precisa de algum tema específico manda nos comentários que eu faço aula pra você e beleza estou começando com o pcr em tempo real não dá pra falar de pcr em tempo real sem falar da pcr antes e a pcr a pcr é a mãe de todas as técnicas eu acho que não existe eu não conheço pelo menos 11 laboratórios

num mundo de Biologia molecular que não faça pcr pelo menos a um livre direto e indiretamente alguma reação de pcr porquê porque a técnica de pcr ela tão importante porque todo mundo que faz biologia molecular faz percebe que já fez saber se alguma vez na vida por dois motivos principalmente se as pessoas que fazem o que faziam manipulação de ácidos nucleicos antes da década de 80 antes de 1985 mas tinham dois grandes problemas O primeiro problema era a quantidade de dna porque para conseguir analisar uma molécula é uma molécula para você conseguir analisar aquela molécula

era necessário extrair obter grandes quantidades dessa molécula esse é o problema o problema conseguir adquirir a quantidade é suficiente para você poder analisar moléculas segundo é a especificidade porque é muito raro quando um pesquisador uma pessoa precisa analisar o genoma como um todo de um Organismo no geral de uma maneira geral os pesquisadores as pessoas elas personalizar fragmentos específicos genes específicos ou regiões dinâmicas específicas ou fragmentos seqüências específicas de dna e não um genoma inteiro então como selecionada entre o genoma gigantesco como são os mamíferos por exemplo de um ano como selecionar um fragmento alvo

específico que é o alvo de análise A pcr ela resolveu exatamente os problemas a quantidade ea limitação da quantidade e em específico à especificidade então vamos lá a técnica da pcr a técnica da pcr é uma técnica que de certo modo ela imita o que a célula faz naturalmente é no processo de ptose quando ela vai se dividir durante a mitose ela precisa replicar o dna dela para que as células filhas tenham as cópias do seu genoma original beleza e Beleza então a pessoa que faz algo semelhante que a gente vai fazer isso sempre é

replicar o dna também só que a gente vai replicar o dna primeiro dentro de um tubo de ensaio ambiente artificial segundo fazer várias cópias não jogou inteiro mais de um fragmento específico então é isso que a pessoa que faz ela vai pegar fazer várias e várias cópias a partir de uma amostra de um dna template ou um dna molde de fragmentos Específicos entronizar de vocês estão vendo um dna azul que é o dna o dna do organismo que eu estou analisando em vermelhinho nós temos é o fragmento que vai ser copiado então o pgr tem

a capacidade de fazer milhares milhões bilhões de cópias de um fragmento específico no caso é o fragmento vermelho como é possível então como que a gente consegue dentro de um tubo dentro de um ambiente artificial eo artificial criar condições para que a Molécula se replique então olha só a gente possa colocar o tubo todos os ingredientes todos os reagentes necessários para que a dengue a molécula seja copiado além disso em criar o ambiente ideal de replicação do dna isso envolve temperatura pressão osmótica é solução tampão entre outras coisas mas aqui agora a gente vai focar

principalmente nos ingredientes na temperatura Então o primeiro ingrediente dna molde e precisa colocar na reação dna que vai ser utilizado com o molde ou como um template para que aconteça a replicação do fragmento ao segunda coisa a linha polimerase existe uma enzima que polimerizada vem aqui produz que sintetiza dna como dessa enzima dna polimerase dna polimerase ela utiliza os nucleotídeos livre sem solução para construir novas moléculas de dna então a dele a primeira responsável por Criar fazer as cópias da molécula do template alvo do fragmento alvo mas como eu disse ela precisa da estrutura da

unidade das unidades para construir as novas moléculas é então ela precisa de tratar disse estar disponível na reação os quatro núcleos a tcg para que as novas moléculas sejam produzidas sintetizadas pela dna polimerase além disso a gente precisa dos primers ou iniciadores os primers são pequenos fragmentos de dna fita simples Exatamente específicos no geral não é exatamente específicos as extremidades específicos e complementares às extremidades n há algo que eu quero simplificar ou do fragmento alvo que eu quero fazer cópias de aproveitar fazer um parêntese aqui quando eu falo amplificar dentro do ambiente de pcr o

pcr em tempo real eu estou falando em fazer número de cópias aumentar o número de cópias está e não classificaram significa aumentar de Tamanho então purificar fazer cópias então os primos eles são os responsáveis por dar a especificidade da reação de pcr o fado aqui pra daqui a pouco como que a pessoa é resolver o problema da quantidade mas quem resolve o problema da especificidade quem são os responsáveis por selecionar um fragmento alvo específico dentro de um genoma gigantesco são os primeiros a gente vai entender isso daqui a pouco depois nós precisamos de um com

o fator da dna Polimerase no caso é um hub valente geralmente utiliza o cloreto de magnésio é o magnésio mas no formato de cloreto de magnésio a gente vai misturar todos esses ingredientes dentro de um tubo e gerar as condições de temperatura para que a pcr ocorra porque não basta juntar todos esses ingredientes num tubinho e que a pessoa que vai acontecer a gente possa gerar as condições ea temperatura é o que vai fazer A pcr acontecer curiosidade aqui o termo lhes quando ele fez a a pcr pela primeira vez ele tentou fazer passar pela

primeira vez e foi justamente isso que eu falei eles vão todos os ingredientes num tubo e esperou achou que a que o dna se replicar sozinho pra quem conhece a história de carlos em uma história uma parte interessante que quase ninguém fala eu vou lá a pessoa ela é dividida em três passos a quem tá falando só de Pensar e convencional por enquanto sr dividida basicamente em três passos o primeiro passo é a de naturalização olha só que vocês vão ver no meu slide é um fragmento de dna que é o meu fragmento ao time

azul geralmente vê o dna mas pela espiralado aqui tá vendo o dn o dn a linearização porque para ficar mais fácil para a gente conseguir entender melhor como a pcr funciona e com outra observação é que eu estou mostrando só o fragmento algo que vai Ser amplificado geralmente quando se começam a pcr a gente tem outros dna além de outros fragmentos que não sou alvo é geralmente não sempre mas muitas vezes se começa com dna gênio daniel foi sair de uma célula de um tecido uma bactéria por exemplo e aí vai fazer a pcr a

partir desse dna genômico aqui estou mostrando só o fragmento ao que vai ser simplificado mas imagine aí vocês que dentro desse tubo nós temos uma Quantidade imensa de monte dna e não só o que eu quero amplificar e geralmente também geralmente não sempre a gente não começa a pcr com um fragmento não vai extrair uma molécula de dna onde não de uma bactéria de um tecido entrar um monte trabalho comum de células no processo de extração mas é que eu estou mostrando uma só e ao longo das aulas vão mostrar uma só pra ficar uma

didática obviamente então beleza começamos a perceber no paço onde Colocou todos os ingredientes dentro do tubinho o tubinho a gente vai aumentar a temperatura dele para 94 95 graus celsius e quando a gente faz isso o que acontece com a estrutura dupla fita de dna ela se desfaz ela se diz o sia a molécula de natura formando duas fitas simples então nós temos aí as pontes de hidrogênio que são as ligações que juntam as duas fitas de dna em alta temperatura se desfaz ea molécula vira duas fitas simples então o primeiro Passo de maturação fita

duas fitas simples a 95 94 graus celsius mais ou menos depois a gente vai baixar baixar essa temperatura para uma temperatura que varia esse passo é o que mais varia mas recebe perto de 60 graus não achamos a temperatura para 60 graus a essa temperatura os primers que nós desenhamos nós sintetizamos artificialmente eles vão encontrar complementariedade as extremidades do Meu dna alvo do fragmento algo que eu quero classificar então a 60 graus os prémios vão se anelar de maneira específica a extremidade do fragmento que eu quero unificar um fazer um parêntese aqui nos primas guardar

a informação então a gente estava afundada de naturalização 95 graus e aqui a 60 graus mais ou menos o nivelamento dos primers tem algumas informações importantes aqui gostaria falar pra vocês A primeira coisa é é uma pessoa um pesquisa no geral pra quando ele vai fazer uma pcr de um fragmento específico ele precisa saber e precisa conhecer pelo menos a sequência de bases das extremidades do fragmento que amplificar porquê porque só assim ele vai conseguir desenhar os primers interesses aos prêmios que vai utilizar e gerar especificidade que ele precisa na pf é sempre assim não

tem variação tem Casos de casa mas no geral é necessário saber sequência pelo menos das extremidades do fragmento que a gente quer amplificar o pcf essa primeira coisa a segunda coisa como é que os primers geram especificidade porque que eles têm a capacidade de se analisar especificamente as extremidades meu fragmento alvo olha só é é uma questão de probabilidade a questão estatística dá uma olhadinha e no na fita de cima olhar fita de cima na Parte na extremidade dela nós temos ali no meu molde uma água mina imaginem que o seu primeiro na verdade não

pra mim é uma onu que eu tiro livre e aí você tenha uma se torna como nucleotídeo livro qual que é a probabilidade dessa citocina livre se associar a uma agonia em uma molécula de dna qualquer molécula de dna esquece nosso template por enquanto mas citosina como que uma situação na qual é a probabilidade de uma se torna se angela A uma menina em uma posição específica de uma molécula qualquer de daniel nós temos uma chance em 4 uma chance em 4 porque porque nós temos quatro nucleotídeos a liga com t se liga com g

então se você tiver uma se torna livre ela tem uma chance em quatro de encontrar uma agonia disponível ali para se associar para pode encontrar uma adenina ela pode encontrar matt mina ela pode encontrar uma outra citosina e Nenhum desses casos ela vai se ligar mais eventualmente ela vai se associar ao encontrar uma agonia e se ela consegue fazer a ligação não consegue sensibilizar então a ter uma chance em 4 agora imagine então que nós temos duas situações nas juntas duas c/c qual que a chance desse cc encontrar um g o dna qualquer essa chance

ela cai para 1 para 16 é menos provável que duas citocinas encontre duas meninas pela sigla então Sente aumentar é mais uma base mais um que eu tive nesse nosso isso nosso primo fictício então passa a ser c c g são três agora diminui ainda mais a chance de encontrar complementaridade de uma fita de dna os primers que a gente sintetiza de um modo geral eles têm por volta de 20 nucleotídeos por volta de 20 núcleos chineses significa que a chance daqueles 20 nucleotídeos encontrarem outros 20 núcleos complementares exatamente Complementares a ele é em torno

de 1 em mais de um trilhão ou seja a probabilidade é muito remota se você não desenhar um primer que seja específico para uma região específica estatisticamente falando no caso do gênero humano e outros vários nomes é muito improvável que um primo de 20 núcleos e levasse anelar a uma região do genoma certo acontece acontece de um primer que você desenho você mandou sintetizar para aquela região específica Se ligar em outra região acontece mas não vem ao caso agora o que importa é que você precisa entender nesse momento é que por conta do tamanho do

primeiro da seqüência específica que ele tem ele que gera especificidade disse avelar a um fragmento ao a extremidade um fragmento alto e aí nós temos dois eventos de hibridização processo de nivelamento dos primers nós temos o primer esse que estou mostrando aqui pra vocês A gente pode chamar de forte e nós temos esse outro primeiro aqui que não está na outra extremidade que a gente pode chamar de reversa ou vice-versa aqui agora não importa tá mas o que importa é que são dois eventos de mobilização seja as chances de selar em regiões aleatório é muito

pequena então eles vão se revelar muito provavelmente nas suas regiões específicas e aí você vai conseguir ficar então vamos voltar primeiro passo de naturais são 95 graus Celsius a dupla fita dupla de dna se do seu formando duas fitas simples segundo passo os primeiros 20 a baixa temperatura para 60 mais ou menos 55 60 dependendo da estrutura do prime é eles vão se associar especificamente as extremidades do fragmento que eu quero ampliar ca e aí a gente vai para o terceiro passo o terceiro passo ele pode acontecer uma temperatura um pouco mais alta uns dizer

aqui a 72 graus celsius Mais ou menos pode ser um pouco menos caso da pcr em tempo real geralmente trabalha com uma temperatura menor mas tudo bem vamos trabalhar 72 graus que é o padrão usam da pf estão os prêmios estão associadas às extremidades quando a gente isso acontece a dna polímeras que a gente incluí-la na reação ela tem a capacidade de identificar essa estrutura dupla fita formada pela junção do seu dna e do seu primo então essa estrutura em dupla fita Que foi gerada a partir do zoneamento dos primers ela tem a capacidade de

encontrar essa estrutura e ela se associa a esta estrutura ea dna polimerase ela consegue adicionando nucleotídeos ela consegue utilizar essa estrutura para começar adicionar os nucleotídeos que vão formar as fitas novas as fitas que serão geradas no processo da pcr não dá uma olhada levantando nossa na fita de cima Nós temos ali o primeiro ligado né e depois há a depois do primeiro a primeira base que nós temos no nosso alvo é uma é uma goiana então a dna polimerase ela vai ter a capacidade de pegar um dos nucleotídeos livre sem solução que a gente

também adiciona a pcr ea sociais nucleotídeo livre a agonia no caso vai ser uma situação digna então a dna polimerase ela vai ali naquela agonia e adicionar umas 12 na Aba seguinte também uma agonia ela vai funcionar numa outra zona depois uma tina adicional à adelina depois vai ser um g t t g e assim por diante também há polimerase vai formando a nova fita de maneira complementar olha aí o que acontece na minha polimerase utilizou esta estrutura dupla fita da delegação do primer com o seu dna alvo do seu fragmento alvo e polemizou as

duas novas fitas então aí nós terminamos o terceiro e Último passo da pcr e nós temos duas fitas idênticas geradas através desses três pastas certo agora olha que interessante a gente começou o primeiro passo nós tínhamos uma fita um fragmento alvo no final do segundo passo nós temos dois fragmentos alvo agora vamos fazer o seguinte vamos começar esses três passos de novo repetir só agora a gente vai repetir com essas duas moléculas existem duas agora Pra começar a gente repetir fiz esses três passos de novo que vai acontecer cada uma dessas moléculas vai gerar mais

duas moléculas estão no final do segundo passo na final do 2º ciclo nós teremos quatro moléculas onde começou com duas moléculas e passamos a ter quatro a gente repetir de novo agora com 4 no final deste terceiro círculo nós passaremos a ter oito repetir de novo a gente vai ter 16 3234 assim por diante Então a pessoa tem a capacidade de usar uma molécula que foi gerado no ciclo anterior como molde para gerar mais um eco do ciclo seguinte e aí a gente resolve o segundo problema que era o problema de quantidade como vez slide

aqui na frente o que vai ficar bem mais fácil entender começamos a pcr vamos supor que tivesse um fragmento como eu falei para você isso não acontece na vida real mas aqui didaticamente para ficar fácil de Começou com um fragmento aí fizemos os três ciclos a pcr os três passos da pcr e terminamos o final do primeiro ciclo com dois bonecos se a gente começar de novo agora com duas moléculas a gente vai finalizar o segundo ciclo com quatro essas quatro vão gerar 8 essas oito vão gerar 16 16 32 32 64 e assim por

diante até que o final da pcr nós teremos milhões bilhões de cópias geradas não é tão bons anfitriões de uma maneira didática se a gente fosse essa a Pensar que fosse acontecer por 40 ciclos como eu disse no meu exemplo e nada mais acontecesse não ser replicação de dna nós teríamos aí por volta de 3 trilhões isso na teoria na página do jeito que acontece com a gente no final das contas o que importa é que vamos ter várias e várias e várias e várias cópias de um mesmo fragmento então quantas vezes se faz quantos

quando a gente repete esse ciclo esses três passos a pcr depende do objetivo de perseguir a pcr De pcr em tempo real próprios e em tempo real mas aí varia em torno de 30 55 depende do que você quer fazer tá bom mas essa é a pessoa então ó resolvemos os problemas de quantidade e de especificidade da onde acontece a pcr é quem é que fica trocando essa variação de temperatura quem eleva a temperatura para 95 que a baixa para 60 quilômetros para 72 depois 95 no né e faz isso 40 50 vezes existe uma

máquina que faz disso Existe um equipamento que é o termociclador até o senador faz esse processo exatamente esse processo é de maneira automática bom a pcr ela tem uma infinidade de aplicações já falei pra vocês aqui que é uma técnica extremamente versátil gente consegue fazer vários tipos de análises com ela e mais do que isso a pessoa ela sabe como é é como um passo individual e muitas outras aplicações como sequenciamento seqüenciamento de nova Geração macroeconã na gem várias outras análise faz à pcr em algum momento a pcr em tempo real mesmo avaliação da pf

a gente consegue fazer com a pcr genotipagem à noite para estuprar várias coisas inclusive fazer a identificação humana é detecção de patógenos você detectar a presença do do genoma de um patógeno uma determinada a mostra dá para trabalhar fazer clonagem dá para fazer seqüenciamento sangue seqüenciamento de uma geração ea monte De coisa apesar de todas essas vantagens apesar dessas de diferentes aplicações ainda assim quando a gente compara principalmente a pc é com a pcr em tempo real ela apresenta algumas limitações a primeira licitação que visa destacar aqui a sensibilidade ea resolução e aí não é

bem por conta da tcr o problema a pcr em tempo real quando comparada à pc convencional ela é bem mais sensível e tem uma resolução bem maior mas não é Por conta da pcr em si é como se analisa o produto esse é o problema é como se analisa por outra pessoa é que geralmente vai pegar aquele produto que lhe fragmento que foi amplificado ele vai fazer uma letra foresee por exemplo vai para analisar esse fragmento eletroforese nós temos sim uma limitação de sensibilidade resolução e sensibilidade significa o seguinte se você tiver uma quantidade muito

pequena do seu alvo Antes da psr você vai gerar menos cópias desse álbum no final da pcr e talvez dependendo da quantidade que você tinha anteriormente no começo a ver sair talvez você não consiga girar um sinal forte o suficiente lá no eletroforese para você detectar ou talvez seja um sinal forte mas não suficiente para você conseguir fazer sua análise por exemplo ou se você quiser comparar uma banda de uma mostra eletroforese como a outra mostra talvez essa diferença de essa Diferença de pixels de intensidade gerada ali na eletroforese você não conseguia fazer sua análise

e assim por diante beleza os resultados eles também não são quantitativos exatamente pelo mesmo problema porque a gente não gera números fazendo uma pessoa a gente gera um produto que vai ser analisado geralmente um gel de agarose vai ser sequenciado etc você não consegue quantificar o máximo que dá para fazer é uma semi Qualificação que significa quantificar os pixels de uma foto de um gel de agarose mas hoje em dia não se precisa fazer isso mas porque tem a pensar em tempo real que resolver os problemas em processamento após a reação você faz uma pr

e aí que você faça aquela com aquele negócio pra fazer nada se você não consegue olhar o tubo e analisar qualquer coisa então você precisa processar aquela mostra que Justamente por exemplo fazer um eletro foresee ou fazer o seqüenciamento fazer alguma coisa com ela não tem esse problema também que você precisa processar mostra depois da reação e aí o processo muitas vezes ele é bem normal geralmente existem master mix que os master micção são soluções com todos os ingredientes já em quantidades otimizados para você utilizar só pcr única coisa que você adiciona extra é o

primeiro que é exclusivo da sua reação Na sua situação e o seu dna alvo mas mesmo tendo os master mix muitas vezes é necessário otimizar a quantidade de reagentes quantidade de praia então o processo é bem mais manual do que pode ser apreciada em tempo real então vamos falar agora sobre a pcr em tempo real e olha só a pcr em tempo real para sua sorte é a mesma coisa percebem se você entendeu que a pf se você já sabe o que a pf já entendeu que a pensar em tempo real basicamente porque A a

mecânica é a mesma o que a gente vai fazer ali várias cópias de um fragmento específico a gente vai colocar um tubo todos os ingredientes para se fazer cópias de um fragmento específico com uma diferença além de todos os ingredientes que eu falei pra vocês que a gente vai colocar no tubo também o ingrediente extra que é um agente florescente é justamente o agente florescente que nos permite fazer o monitoramento da reação de pcr em Tempo real então é justamente a geração de sinal florescente e diferente entende diferente intensidade que faz com que a gente

consiga fazer um monitoramento da reação em tempo real apesar do nome apesar do nome da pessoa e pcr em tempo real nunca a análise dessa reação elas são feitas em tempo real você utiliza a capacidade do da geração de dados em tempo real Mas analisem se ela não vai ser feito em tempo real você vai fazer a reação vai processar esses dados depois digitalmente é diferente da pcr você vai pro são digitalmente vai analisar o computador para daí sim receber os resultados finais e aí como que ea gente consegue então gerar números é diferente da

pcr convencional como que a com a pcr em tempo real a gente consegue gerado números porque que nós estamos fazendo com uma pcr em tempo real nada mais é do Que pegar uma informação biológica que a gente não consegue ler entender e traduzir na verdade essa informação biológica em uma informação digital quem faz essa transformação essa tradução na verdade é o agente florescente porque a gente consegue captar fluorescência e transformar a intensidade fluorescência em números ea partir daí a gente consegue quantificar em analisar a amostra vamos entender que de uma maneira mais é Mais didática

e aqui está o pulo do gato era se vocês quiserem entender como funciona a pcr em tempo real aqui está o pulo do gato vejam só o nível de florescência la em um tubinho na minha reação ao longo da pcr o nível de fluorescência ela aumenta maneira proporcional ao aumento do número de cópias do álbum a reação durante a pcr nós temos um alvo que vai ser amplificado nós vamos fazer várias cópias de um alvo É isso que vai fazer e o pulo do gato é que conforme vai aumentando esse número de cópias ao longo

dos ciclos da pcr vai aumentando de maneira proporcional à intensidade do agente florescente que a gente colocou lá na reação também estão com nível de florescência ela tem que ser proporcional à quantidade de dna que está sendo gerado em cada ciclo da pcr farmatotal pcr em tempo real é isso que vocês vão saber a partir daí a gente tá fácil vamos lá pcr em tempo real a mesma Coisa pf então a gente tá no começo da pcr em tempo real o nosso fragmento alvo é quem tem pouca quantidade na região fez cópias ainda assim tentou

continuar nós temos pouca quantidade também dá porque de florescência de maneira proporcional aí a gente faz o primeiro ciclo ea gente gera duas moléculas a partir daquela uma um site gera duas moléculas aumentar um pouquinho o que tem que acontecer com o Sinal florescente aumentar um pouquinho também de maneira proporcional depois mais pra frente a gente passou para quatro moléculas que acontece no florescente ele aumenta de tal maneira que seja referente à quantidade de quatro moléculas a sua reação e assim por diante no final da reação de pcr o que nós temos aquela quantidade imensa

de agente de de moléculas de dna do nosso fragmento alvo e uma quantidade Proporcional dessa flor essência que foi gerado beleza é isso então nós aumentamos gradativamente a quantidade do nosso alvo na reação e consequentemente paralelamente a gente aumentou a quantidade de fluorescência nós aumentamos o nível de intensidade da fluorescência na reação e aí por isso a gente consegue fazer a análise em tempo real muito bem só que para fazer isso você precisa de uma máquina que consiga ler a Fluorescência você precisa de equipamentos que consigam era florescência não basta ter o termociclador convencional porque

ele não lê fluorescência você precisa de uma máquina específica pra isso eu estou mostrando aqui duas máquinas dois equipamentos um é w rádio outro da thermo fisher esses dois equipamentos e eu estou mostrando os dois porque são os dois maiores players do mercado Aqui no brasil na américa latina em vários lugares do mundo estão mostrando os dois mas existem outros vários mercados disponíveis pra você fazer esse tipo de reação uma coisa interessante sobre esses equipamentos é o seguinte que não basta também ele é florescente é um equipamento relativamente complexo está a gente pode dividir algum

alguns componentes é que são primordiais uma máquina de pensar em tempo real O primeiro componente sem dúvida é um tributo a dor porque a variação de temperatura vai acontecer além do termociclador a gente precisa de um detector de florescência não vai ser gerada florescência na mostra então a máquina ela tem que ter um detector florescente alguma maneira ela tem que ter detectado uma floresta que fosse foi gerada e tem um terceiro componente ainda porque a fluorescência na gerada assim simplesmente ela precisa e ser Excitada uma flor essência quando ela é aliada ela ainda assim precisa

ser excitada pra permitir sua luz e pra que essa fluorescência seja excitado a gente precisa de uma gente que sente a vocês no geral é uma lâmpada pode ser uma lâmpada branca pode ser um laser então a gente pode dividir aí os equipamentos e pessoal em tempo real em três componentes muito importantes estão o termociclador é um detector de Florescência foi gerado ali e uma um comprimento de uso específico uma fonte de luz específica que vá necessitar florescência gerada em tubo e beleza mas esse é uma é uma conversa para uma outra aula tá bom

que importa é você saber nesses três componentes básicos em muito bem então falamos ainda os conceitos iniciais sobre a pcr em tempo real vamos passar para os agentes florescentes quem são esses indivíduos esses agentes florescentes que a gente Adicionou lá na nossa reação quem são eles e como eles têm a capacidade de gerar fluorescência de maneira proporcional dna está sendo gerado ao longo da pf eu falei pra vocês lá no começo da aula a gente vai falar de dois principais são os dois mais utilizados no mundo o primeiro é o site e o outro é

o tac mas existem outros disponíveis no mercado aqui no brasil existem outros também Só que são menos utilizados geralmente eles têm algumas aplicações são mais limitados do tipo de aplicação que se pode utilizar é então se vocês quiserem saber se os outros me avisa eu faço um vídeo um vídeo mais curto só falando desses outros agentes florescentes beleza dá um toque que eu faço é mais um fato desses dois aqui que são os dois mais utilizados o primeiro deles é o cyber banho saber green Ele é uma molécula um agente intercalam ante de dna fita

dupla é uma molécula que tem afinidade ao dn a adene a fita dupla o cyber green ele é específico porque é específico porque ele é um agente intercalam ante de dna a fita dupla não falei qual nesta dupla qualquer benéfica dupla pode ser o seu dna pode ser o seu alvo pode ser um contaminante pode ser um primer mas ele pode se ligar lhe e gerar florescência Ele específico ele no jornal é bem mais barato e você precisa fazer um negócio depois da reação de pcr em tempo real para confirmar que os resultados que você

está obtendo ali é confiável que é uma curva de dissociação que eu vou explicar com calma daqui p'ra lá na frente mas eu tô falando isso já pelo seguinte porque se você pode adicionar um tempo extra um passo a mais ao longo da sua pcr em tempo real é lá no finalzinho da temporada depois que Acabou toda reação se faz essa curva de associação você vai precisar de um tempo a mais para fazer a análise a maioria dos laboratórios quem trabalha com pesquisa e se passa mais indiferente porque tempo não é um grande problema mas

laboratórios que é que tem uma demanda muito grande a mostra que fazem várias amostras por dia geralmente laboratórios clínicos laboratórios que fazem testes aí vendem testes esses Caras realmente eles demandam um tempo e aí 11 uma reação a mais ao final da sua reação ela pode prejudicar no longo prazo tatão ação comentário e saber que ele é comercializado por várias companhias ação do ataque um sistema completamente diferente é um óleo nucleotídeo muito parecido com o primeiro só que eles são específicos para o dna alvo ele é feito por daniel calvo assim como prêmio ele é

feito para pra ser Velado ao seu alvo ao longo da reação o assunto ataque mama ela pode ter diferentes cores ela pode emitir florescências de diferentes comprimentos de luz ou seja são florescências de frescor isso permite que a gente consiga fazer multiplex vão falar disso lá na frente também é mais caro modo geral a é bem mais cara e é comercializado pela thermo fisher scientific tem algumas empresas que têm essa técnica licenciada mas de Um modo geral quem comercializa é até uma ficha vamos entender como funciona o cyber primeira mais simples mais fácil entender a

molécula mais é uma tecnologia mas sim as duas são fáceis mas o saibro é mais fácil ainda eu disse para vocês que o cyber é uma molécula que tem afinidade a molécula dupla feito de dna então é com a itália em solução bonitinha emitir uma flor essência bem Baixinha quase nada de florescência ela tem solução entanto quando essa molécula que tem solução ela encontra um dna dupla fita ela pode se ligar ela se liga se tivesse condições ideais ela vai se negava a associação blocos de dna dupla fita nesse processo de associação na muda de

conformação geralmente e no processo de conformação a emitir fluorescência olha só aqui no nosso tubinho tá acontecendo a pcr vai começar nós temos o saiba que a gente colocou Hoje colocou o dna que vai servir como molde para a gente antes de acontecer a reação nós temos ali os cyber sem solução e uma florescente bem baixinha mas olha que ele encontra esse dna dupla fita ele se associa ele se liga muda de confirmação e passa a emitir uma flor essência bem mais alta então é simples assim é assim que o cérebro funciona então é fácil

de entender que conforme a pc vai acontecendo Nós vamos aumentar a quantidade do nosso alvo lá dentro conseqüentemente nós vamos aumentar a quantidade de cyber associado à molécula de dna conseqüentemente nós temos um momento de fluorescência certo então olha aí o pulo do gato que falei pra vocês lembra a quantidade de fluorescência que está sendo gerado ao longo da reação ela é proporcional à quantidade de dna que está sendo formado ao ciclo ao longo dos Ciclos da pcr e é isso que estou mostrando nestes light fechou simples assim só que o saber é o danadinho

o saiba eu falei para vocês ele se liga à d fita dupla a qualquer de nafta dupla ele ele pode se ligar ao seu alvo é o que você quer mas se você tiver uma reação e conseqüências sem querer sem querer você tanque ficando um outro fragmento que não é sócio alvo então você tampa e ficando o seu alvo é o que Você quer mas por algum problema um primer mal desenhado alguma outra situação você tem que ficar dando um outro alvo que não é o seu também o site vai se ligar só no seu

não brinca ele vai se ligar no seu ele vai se ligar no outro também e ele vai emitir florescência pros dois você consegue diferenciar que floresceu está sendo gerada lá nos aquele tubinho se a fluorescência do seu alvo se a do Contaminante não consegue então se você tiver uma geração de florescência inespecífica na sua reação de pcr quando você utiliza um cyber você muito provavelmente vai utilizar esses dados você vai ter que repetir resolver o problema é fazer com que saibam se gere florescência só para o seu alvo e aí sim você fazer análise do

santos vamos dar uma olhada nisso aqui então ao cyber bonitão olha cls liga berlim a dupla fita mas é qualquer ea dupla fita se Você tiver um contaminante como eu acabei de falar você tem ali o seu alvo que a laranja azul é que você quer gerar florescências que você quer amplificar e gerar fluorescência mas por alguma razão você tem um contaminante também está sendo amplificada ao longo da pcr que você não gostaria que ele estivesse mas ele está e os cyber danadinho vai se ligar ele também e vai emitir florescência ele também dá para

separar o que é Florescente do contaminante do seu alvo não dá pra perder os dados aqui muito provavelmente e se você tiver um primer se ligando um primeiro porque é o primeiro se ele for mal desenhado se você tiver com ele em concentração errado na sua reação e não devem afetar 5 certo e isso quer dizer que ele pode se ligar a outro primeiro um ford por exemplo se associando a um primer se formando uma estrutura dupla fita ou ford se Associando ao próprio ford john ford ou reverse se dobrando se associando a ele mesmo

problema no ranking quando essas três situações acontece você tem a formação de dna dupla fita se você tem a formação treinada pela fita você tem que saber se ligando se você tem sabe se ligando você tem geração de florescência se você está gerando florescente de maneira específica você provavelmente vai ter que repetir o Experimento otimizar esses prêmios aí resolveu que está acontecendo e optar de problema e refazer a reação mas existe uma maneira de a gente saber se é se está acontecendo alguma dessas situações a florescências que está sendo gerada ali é só do mal

mesmo você tem como ter uma idéia existe uma reação que você faz depois da pcr que eu comentei lá atrás que a curva de dissociação e essa reação e é esse procedimento ele pode te dar indicativos De que você tem uma flor essência específica sendo gerada lá dentro vamos ver como isso acontece como acontece a curva de dissociação então aqui nós terminamos a pcr e terminou aos 40 círculos bonitão tem um monte de dna que foi formado um monte de florescência que foi gerada é bom nós estamos na situação que estou mostrando obviamente uma molécula

mas imagino que o tubo tá cheio de moléculas de dna que você fez cópias se você mantém esse tubo em temperatura Ambiente está a 25 graus como exemplo tem um monte de cyber um monte de dna associado a outro né formando dupla fita de montes aib ligada a eles emitindo muito florescência agora eu sou nem taça temperatura um pouquinho lá que você vai aumentar para 70 graus mais ou menos o que acontece essa molécula de dna ela começa ela pode começar a se dissociar essa estrutura dupla fita ela começa a se desprender porque quando a

gente faz a dissociação Quando a molécula de natura on da natura de uma vez só não rompe a molécula toda tem algumas regiões que são mais fracas em algumas regiões que são mais fortes as regiões mais fracas elas demandam menos energia para dissociar então quando você começa a aumentar a temperatura relativamente olha que acontece um pedacinho daquele seu alvo ele se diz o sia e saiba que estava se ligado ali naquela estrutura dupla fita ele se desliga na linha dupla fica mais Ele não tem afinidade a fita simples ele se desliga então você tem uma

queda proporcional à quantidade de dna que foi associado então diminuiu a aumentou a temperatura é alguns pedaços e ovos se dissociaram saiba estava ligado a ele se desligou então caiu um pouco da florescência aumentou a temperatura caiu florescência você aumentar um pouco mais pelas regiões que são intermediárias tem força intermediária elas começam a se Dissociar também o sabe que estavam ali se dissociam aí homem tão pouco mais temperatura caiu fluorescência se você aumentar um pouco mais se vai distorcer a molécula inteiro então se você aumentar a temperatura gradativamente você vai diz oceano a molécula gradativamente

e os sábios vão se desligando gradativamente estão a um nível de fluorescência vai diminuindo gradativamente conforme parcialmente a temperatura se a gente jogar essa Informação isso que acabei de mostrar pra vocês um gráfico esse gráfico nós temos ali a flor essência em relação à temperatura a temperatura mais baixa temperatura mais alta olha o que a gente vai ver a gente vai ver uma queda do nível de fluorescência conforme a gente aumenta a temperatura é isso aqui agora vou dar um dado interessante pra vocês hein olha essa linha e eu coloquei está vendo Ali que eu

vou mostrar pra vocês é exatamente a metade do caminho naquele momento ali na 78° ainda um exemplo isso varia de amostra para a mostra fragmentos para fragmento mas no meu exemplo aconteceu a 78 graus que é exatamente a metade do caminho do processo de dissociação da molécula nós temos neste caso todas as nossas moléculas dissociados pela metade ou seja 78 graus metade da minha mulher que está dissociada metade ainda está Associado e se essa metade do caminho é chamada de temperatura de melt então de novo a temperatura the melting é aquela temperatura no processo da

curva da associação onde metade as moléculas a estão já estão associadas e metade das moléculas ainda estão associadas em estrutura dupla fita é essa curva da associação tem um negócio interessantíssimo que a gente consegue fazer a curva da associação que é o seguinte tudo fragmento ele vai ter esse Mesmo perfil de dissociação que estão mostrando pra você toda molécula vai dissociar dessa mesma maneira ou seja em outras palavras toda molécula tudo fragmento ele vai ter uma tpm uma temperatura de melt a 78 graus não moléculas de tamanhos diferentes têm uma tema específica moléculas de estrutura

e pied diferentes têm temas específicas então quando a gente olha pra te m quando a gente olha para a pm a gente Consegue predizer se uma molécula maior que a outra a gente consegue predizer um pouco sobre a estrutura dessa molécula a então já tem um insight que se você tiver uma um contaminante na sua reação se você tiver um contaminante na sua reação do seu contaminante por diferente do seu fragmento alvo ele vai ter um perfil de dissociação diferente do seu alvo e se ele tiver um perfil de sua situação diferente ele vai ter

uma tpm diferente então se você olhar prtm do Seu alvo e se você olhar prtm que está aparecendo ele não deveria pode ser um indício que você tem um contaminante mas também é difícil olhar nessa tema e sabe exatamente onde a metade dessa curva dessa descida e dá mais um gráfico verdadeira que está fazendo um desenho gráfico de verdade fica mais difícil ainda olhar exatamente onde a metade dessa caída dessa dessa curva só que se a gente levar os dados desse gráfico usados da fluorescência a gente Tem isso aqui ó e aquele pico que você

está vendo ali no outro gráfico no gráfico é justamente a pm é justamente a metade dos fragmentos de associados é a mesma informação só que mostrar de outra maneira aí ficou fácil a gente tem o atm dando um clico bonitão assim ó a gente consegue ver exatamente aonde está onde metade das moléculas estão dissociados onde estão associadas ou seja a gente consegue ter uma noção do perfil de Dissociação decisão dessa molécula vamos trabalhar vamos entender um pouco melhor isso a ao pulo do gato lugar para você entender uma curva de dissociação vamos lá a temperatura

the melting de um fragmento de dna depende do seu tamanho ou seja a quantidade de base que ele tem e da sua proporção entre goiânia e citosina c adenina e timina então o perfil de dissociação de um fragmento de dna ou seja a pm ela é dependente do tamanho daquele fragmento ponto maior Que ora tm quanto menor melhor o tm e também na quantidade de bonnie do zina em relação à dna timina porque você precisa de mais ou menos energia para dissociar uma molécula de uma fita de dna de 40 pares de base agora você

precisa de mais ou menos energia para dissociar molécula de mil para debates você vai precisar de muito mais energia ou seja precisa de muito mais temperatura para dissociar uma molécula grandona de mil pares de base Em relação à marca de 40 por exemplo então até o tamanho influencia no perfil da associação você precisa de mais temperatura para dissociar moléculas maiores têm um perfil da associação vamos lá com a grande é diferente do perfil da associação de uma molécula pequena e outras palavras a atm uma molécula grande é diferente da pm que uma molécula pequena mais

uma coisa a quantidade de gone citosina em relação à denit mina porque Porque a ligação entre citosina e guanina secom g gg com cf feita através de uma ponte de uma ponte de hidrogênio tripla três pontos do gênio e de adelina continue a timina adenina dupla a recoma ligação dupla depende do gênio então você precisa de mais energia para dissociar uma é a ligação tripla uma ligação dupla da província dawood hidrogênio precisa de mais energia para associar ligação tripa ou seja moléculas que tem maior quantidade ligação tripla De ponte hidrogênio em outras palavras moléculas com

maior quantidade de ec em relação a aet precisam de mais temperatura são de mais energia para dissociar certo então moléculas com maior quantidade de leis e tem uma temperatura de mel tima tm maior que moléculas que têm menor quantidade já sei que tem maior quantidade de até beleza taí o pulo do gato da temperatura de malte isso esses light que está falando exatamente eu acabei de Falar com o tamanho ele vai influenciar na temperatura de mel tinha um perfil da associação moléculas maiores precisam de mais temperatura mais energia para dissociar que moléculas menores quanto mais

de ser uma molécula em um fragmento maior energia necessária para dissociar aquela mônaco olha só uma outra informação interessante que muitas pessoas confundem imagine que você tenha purificando você Fez a reação do pr depois humana com uma curva da associação do mesmo álbum mesmo alvos mesmo alvo só que em dois turnos diferentes você colocou o tubo em um lugar o tubo 2 em outro lugar só que nesses dois tubos você colocou mesmo fragmento esse fragmento significa mesmo tamanho mas a quantidade de leis e só que no tubo você colocou uma grande quantidade de dna uma

grande quantidade disse alvino o tubo 2 se você colocar uma Pequena quantidade inicial o que acontece com a pm o que acontece com o perfil the melting de moléculas idênticas só que em concentrações diferentes uma reação em ouro em duas reacções à tn o perfil da associação não muda a o perfil de dissociação ou seja atm ela não é dependente da concentração que você tem do seu alvo na reação ela é dependente de novo do tamanho da companhia gci mas não da concentração beleza depois vou mostrar um gráfico com Concentrações diferentes para você ver que

acontece teme igual à temperatura de mel em igual período de negociação igual só muda a intensidade da flor essência mas atm não muda de acordo com a concentração de um alvo de inúmeros de primer se você tem um número de primeira na sua reação ele é pequenino é uma estrutura de dna dupla fita pequenininhas nessa modalidade 20 pares de base do máximo que você vai fazer um dinheiro então ele vai ter Ele vai demandar menos energia para associar ou seja o perfil da associação de um dinheiro de primeiro seja a pm um diâmetro de praia

é completamente diferente ou pode segunda não é diferente de um fragmento algo que você amplificou certo então ó mais uma dica para saber se você tem dinheiro de primer olha com uma dissociação que você tem um perfil de dissociação para o dinheiro e um perfil da associação para o seu alvo O ntc o ntc que é o novo template control ou branco você fez uma reação à que não tem dna se colocar todos os ingredientes da pcr - o dna colocou água no lugar de nenê do dna ele vai te m não né não tem

dna ali dentro não posso te m então se você ou branco tiver tm se ele tiver amplificando se tiver um perfil da associação tem tem boi na linha tem coisa errada tem que descobrir o que está acontecendo pode ser um Contaminante mas pode ser o dinheiro de praia porque o dinheiro de primer ele tem de acontecer com mais facilidade com mais freqüência em uma reação que não tem template que não tem dna porque quando não tem dna você diminui a competição de ligação entre o dna e oprime e eles tendem a se ligar entre eles

mas você consegue corrigir sua justa na concentração de praia beleza Então fique esperto se tiver dinheiro deprime é gerando fluorescência lá no seu branco tem como corrigir a concentração dois picos diferente lá na na atm do espírito diferente dois perfis de associação durante a pcr em tempo real durante a curva da associação alguma coisa errada tem que ter um pico só tiver dois picos provavelmente um contaminante o dinheiro de praia isso é o que você quer é isso que você quer você quer uma curva de dissociação Um atm um pico sobram então geralmente é esse

o perfil claro que na vida real você vai ter algumas pequenas variações que estão mostrando pra vocês mas aqui de modo geral é isso que acontece lembro que eu falei pra vocês eu perguntei pra vocês se você trabalhar com o mesmo alvo em dois clubes diferentes em dois conceitos são diferentes o que acontece com a curva da associação deles lembra que a associação atm perfil da associação ele é Independente da concentração de seus alvos e os alvos foram iguais ele independente da concentração do alvo tem que ter a mesma teve o mesmo perfil da associação

tá é isso que eu mostrei pra vocês a amostra laranja que estava no tubo eu tinha muito bem ele a amostra assunto era o tubo dois tinha pouco dna mas é o mesmo dna é o mesmo alvo no atm tem igual mesmo pico na mesma altura a 78 graus não tenham que a temperatura está fazendo 80 Graus mas é a mesma região não têm elas não nenhuma das duas nenhum dos dois picos deslocado para a direita para a esquerda estão em cima do outro quando você tem um ntc um branco com o pm olha lá

a mostra que a gente alvo é a nossa amostra linha laranja olha a tmn tc de nada e diversão a linha reta devia ter nenhum pico no mtc amplificou ele tem cara de dinheiro de primer porquê porque é um tema menor que a atm Do meu alvo possivelmente o dinheiro de primeiro é um contaminante bem pequenininha e aí ó na o ntc você faz tudo separado por isso que ele está separado mas é nesse outro gráfico você está vendo dois picos na mesma mostra no mesmo tubos está vendo dois pizza e tem cara de medo

de praia também um pico referente à aos aos prêmios o pico pequeno eo grande da sua mostra está então nesses dois últimos casos de Baixo você precisa corrigir o que está errado provavelmente esse foi o dinheiro de primer ajustar a concentração do primer se juntando à concentração do time não funcionar você vai ter que refazer esse pra mim vai ter que desenhar o plano eventualmente corrigir a concentração de sal na sua reação mas aí já é demais é geralmente se utilizar master mix vai chegar nesse ponto provavelmente é Corrigir pra mim mesmo ou concentração dos

engenhos beleza terminamos então a parte de cyber bullying e vamos ver como é que funciona a sonda ataque no sonda ataca de novo nosso dna razão a bonita ó primeiro ciclo da pcr ele foi associado depois que dissocia que acontece os primers illinois é de maneira específica na pcr em tempo real contra ataque mas isso não muda e você adiciona um outro óleo nucleotide primers são exemplos de óleos Nucleotídeos fragmentos pequenos de dna você vai adicionar um terceiro logo que eu te direi que é uma sonda uma prova uma sonda que vai se ligar também

de maneira específica ao seu fragmento alvo ou seja a sonda assim como o primeiro foi desenhada para o seu alvo você desenhou você customizou você comprou esse negócio que é para o seu álbum você conhece a sequência de seu alvo e você compra um negócio que é específico para ele Diferente do saibro que é buscar tão que se liga ao dna dupla fita beleza cota o hashtag é saber buscar tão hashtag sair desse cartão é aqui o tac ou então está ligado no meio da da sua molécula de dna e ele é muito parecido com

o primeiro mas não é igual ao paraná vamos ver o que ele tem de diferente o que acontece com esse cara então olha só é um óleo nucleotídeo também que varia de tamanho depende da Situação daqui não pode ser um pouco maior que o primeiro pode ser melhor que o primeiro depende da sua situação associado a uma extremidade mais especificamente as extremidades 5 linha e se você não sabe que uma extremidade 5 linha é procura a estrutura do dna se você quiser que eu fale sobre o futuro dele na minha vida que eu faço uma

aula sobre isso mas mais especificamente social da estrutura 5 linha nós temos uma molécula é essa molécula Que é o agente fluorescente é essa molécula que a esse caso é chamada de harry potter que a molécula que vai gerar fluorescência que a gente vai detectar ao longo da pcr é ela que vai falar que o seu fragmento alta significado ou seja ela que vai gerar fluorescência de maneira proporcional ao seu alvo sendo amplificada narração bom então a lhe ensinar 5 linha é está na sua essência então ela tem um papel parecido com o do saibro

Na outra extremidade nós temos uma outra molécula que é chamada de corrente essas duas moléculas quando elas estão geograficamente próximas uma da outra acontece uma troca de energia entre elas uma troca de energia responde fluorescente quando elas estão próximas uma da outra acontece a troca de energia é como se a presença da molécula quente inibe se a fluorescência da molécula harry potter ou seja quando essa molécula com o tac Manco nosso ataque está a estruturada do jeito que está está integrada do jeito que eu mostrei pra vocês e essa troca de energia ea flor essência

do repórter não vai para o meio ela é absorvida não é isso que acontece mas vamos tentar aqui ela é absorvida em cascos pela molécula quente ilesa então vamos ver como ela gera florescência longo da pcr então tá aí ó a pessoa vai começar a acontecer Nós tivemos a dissociação né a the natural são os primeiros ligados de maneira específica as ondas também se ligou de maneira específica uma curiosidade que a sonda sempre elegantes dos prêmios está ela se liga primeiro depois os países então a sonda ligada a ele de maneira específica a dna polimerase

vai começar adicionar nos pilotis a nota em que a sonda premiação do ataque mas já tá ligada só um dos seus fragmentos né Ela precisa se ligar as duas fitas seu dna a liga só uma delas está igual a uma então a primeira filha de cima ela não tinha o taxímetro amplificou normalmente sem sem problema agora na outra fita eu tirei a fita azul para não confundir a gente então a fifa está associada ao suzana está fora da jogada e não vão olhar para ela agora só pra ficar fácil de entender a dna polimerase ela

vem questionando os nucleotídeos maneira complementar ela Encontrou um intruso no caminho dela essa dna polimerase utilizada com o som do ataque ela tenha capacidade é uma propriedade que outras enzimas de napoli mas também tem de pegar uma estrutura 5 linha livre na frente dela é justamente tal repórter ali e ela quebre esse negócio quando ela quebra ela separa essa estrutura essa sonda ela quebra som do hipótese vai ficar longe geograficamente distante de uma molécula quente Aquela troca de energia que estava acontecendo anteriormente ela deixa de acontecer e a fluorescência que estava sendo absorvida pelo corinthians

não está mais que o repórter passa a emitir inflorescência para o meio então notem que essa fluorescência ela somente foi gerada quando uma molécula de dna foi formada portanto o pulo do gato continua a geração de fluorescência ela é proporcional à quantidade de dna foi Gerado e diferente do que acontece com cyber uma vez essa fluorescência sendo gerada ela não volta ela não é porque é absorvida mais não perde ela tem ambiente ela foi gerada para sempre não tem curva da associação aqui não tem culpa da associação então ainda coisa fita vai continuar sendo formada

ea gente vai passar para o próximo ciclo da pcr esse processo vai se repetir repetir repetir que as flores estão sendo geradas conforme os Fragmentos não serão amplificados uma comparação zink rápido entre os dois pra você pensar o que você quer para sua vida saiba é uma molécula - específica na área específica porque ela tem afinidade é desenhar dupla fita o tac mas não o tac uma molécula que foi feita para o seu alvo assim como o primeiro ela foi desenhada para o seu alvo ela está ali é com especialidade bem acima do saiba sensibilidade

Sensibilidade dos dois ela até parecida a sotaque uma tende a ser um pouquinho mais sensível do que o saibro é o site sensibilidade então assim capacidade de detectar eventos radusa então o tac mantende a ter maior sensibilidade não sempre isso na regra mas tem de ter uma sensibilidade um pouquinho maior multiplex que o multiplex multiplex vão se fazer duas reações de pcr dentro de um único turbo duas ou mais então você pode pegar dois fragmentos Alvos completamente diferente é criar dois ensaios para ele quando eu falo em ensaio que é conjunto de primer ou conjunto

de primeira sonda então que há dois ensaios totalmente diferente para eles e amplifica los em uma única reação em uma mesma reação se vai formar dois produtos de pcr ao longo de uma peç efe tá é dá pra fazer isso com cyber dá pra você amplificadores fragmentos diferente com cyber não dá porque eu saiba vai emitir uma flor essência de um Comprimento de onda especificamente para qualquer um dos fragmentos seja ele um fragmento 1 ou fragmento 2 agora o tac mas não você pode criar dois ensaios não pode ficar dois fragmentos diferentes em uma mesma

reação contanto que a sonda tackman de um dos seus fragmentos álbuns têm uma cor azul por exemplo ea sonda ataque do seu outro fragmento ao tema sonda uma luz vermelha uma luz verde sei lá emitem uma luz de cor diferente que os dois têm cores Diferentes porque o equipamento ele consegue distinguir diferentes comprimentos de onda então se você trabalhar com alvo emitindo florescência azul e outro motivo florescência verde o equipamento consegue captar é diferença diferenciais dos cumprimentos de onde você consegue amplificadores fragmentos diferentes em uma mesma reação para quem isso é interessante geralmente é pra

quem faz a análise rotina quem faz teste de rotina que faz Reação de pcr em tempo real rotina realmente é um mercado complicado né o que o mercado privado que faz vários testes por dia que é esse cara consegue otimizar o uso de reagentes e fica mais barato no final das contas ele rodará cimpor que demanda um certo tempo otimizar uma reação multiplex você vai otimizar uma reação multiplex você está fazendo um experimento por exemplo vai fazer uma única vez não tem necessidade realmente não tem necessidade Tá demais preço o preço sai bem mais barato

que tá com essa grande vantagem do saiba ensaios prontos existem empresas que vendem sair pronto pra saiba existe existe alguns ensaios pontos sabe aí é os conjuntos de praia né mas tá aqui mantém muito mais então você consegue uma empresa comprar é só trabalhar com genish por exemplo precisa desenhar seus primos se você não quiser desenhar você pode encontrar quem tenha Desenhado e comprado essa pessoa dessa empresa o tac não tem também todo saber quanto tac não só que o tacna tem muito ensaio pronto já disponível e se você pensou em se trabalha com os

com um humano camundongo 'zebra' fish e assim por diante a necessidade de curva da associação o saiba você precisa a um acordo de associação é o que dá respaldo é o que garante que você não tá girando Fluorescência específico trabalha com saiba então tem que fazer então você vai adicionar uns 40 minutos a mais na sua reação é só a curva da associação demora um pouco como eu falei antes às vezes tem gente que demanda tempo tem gente que não demanda tempos aqui não precisa fazer curva da associação necessidade de otimização sempre é bom otimizar

seus ensaios a não ser que você com que o ensaio seja de primeira sonda que já têm Todas as condições previamente organizadas pela empresas empresa otimizou aí você pode utilizar que o seu time sai bons em fazer um teste verificar se está funcionando bem mas você às vezes pode não utilizar vamos falar agora dos tipos de análises vamos caminhar para a parte final da nossa aula a gente vai falar de dois tipos de análise aqui análises quantitativas as análises qualitativas antes de falar de qualquer uma dessas análises eu Preciso mostrar um negócio pra vocês que

eu ainda não mostrei onde já viu que várias vezes ao longo dessa aula é que ao longo da pcr lá no primeiro ciclo a gente começasse com uma cópia do dna tudo acontece mas se nosso exemplo acontece a gente começasse com uma copa nosso dna no primeiro ciclo teria uma só no segundo 2 o terceiro 448 1632 na final bilhões trilhões de mortos se colocasse essa informação gráfica então aliava falando de pcr em tempo real A intensidade de florescência ou seja número de cópias proporcional lembra então tanto faz aí florescência número de cópia em relação

ao número de ciclos da pcr o que nós veríamos o que nós veríamos se acontecer exatamente o que eu estou mostrando na tabela algo como isso daqui certo muito bem só que isso não acontece na vida real na vida real acontece isso aqui ó existe um momento onde a reação Ela realmente duplica a quantidade do seu alvo a cada ciclo ou seja ela tem uma amplificação que acontece de maneira exponencial isso acontece nos primeiros ciclos da pcr conforme observa envelhecendo vai chegando para os dois ciclos finais a partir do trigésimo ciclo a eficiência da pcr

ela muda ela diminui ela deixa de duplicar a cada 5 isso acontece por alguns motivos o primeiro motivo de apolinário é uma Enzima vai perder eficiência ao longo da pcr sendo motivo você tem vários ingredientes ali que estão sem consumir consumidos nettheim primeiro tem nucleotídeo eles vão sendo com menos consumidos mas o motivo principal para que para que isso aconteça é que conforme a pc acontece toda vez exatamente todas as vezes que um nucleotídeo incorporado à nova molécula está sendo formada a liberação de onda mais e pirofosfato o acúmulo desses Subprodutos da pgr diz balancear

a dinâmica da reação diminuir ea garrafa de basilan a dinâmica da relação e ela para de funcionar até deficientes ou seja as condições para que a pcr ocorra dentro da 5º buela deixa de ser favorável à beleza é por isso que acontece isso aí que vocês estão vendo isso é muito importante entender porque nós vamos falar de dois tipos de análise ao longo da aac gente consegue fazer com o pcr em Tempo real um análise que a gente vai considerar essa fase exponencial da reação e uma análise que a gente vai considerar a fase de

platô a que a fase comercial que é de 14 aqui ó olhar com calma daqui olha esse gráfico mostrando pra vocês até agora eu tinha mostrado uma amostrinha só né que era a mostra laranja agora estão mostrando três amostras são três amostras cada uma a amplificando sendo aplicada em um tubo diferente então a Mostra laranja em um tubo amostra do tubo ea mostra primeiro um outro tube essas três à mostra e ou qualquer outra pessoa é que funcione bem ela vai ter aquela fase inicial que é exponencial onde uma molécula gera duas duas eram 44

gera 18 18 16 e assim por diante então na fase policial essa duplicação está acontecendo a cada ciclo certo eles mas existe aquela fase onde a pcr perde eficiência um de basicamente não têm a qualificação mais ou a amplificação é Muito pequena taxa quase não têm a formação de novas moléculas a essa fase as fases chamada de platoon e agora vocês entendendo isso a gente pode falar das análises qualitativas primeiro a análise qualitativa aquela ali que a gente vai fazer na fase de platô da pcr em tempo real que não é muito diferente do tipo

de análise que faz com o pc convencional porque porque apenas me interessa o produto final dessa reação ou seja se o meu alvo ele foi Amplificado ou se não foi amplificado como lhe foi amplificado quanto tinha do meu alvo que aconteceu ao longo da reação pouco me interessa eu quero saber se teve geração de fluorescência pronto teve geração fluorescência beleza não teve relações florescentes beleza também que aconteceu antes ou depois não me interessa eu quero saber o produto final então a gente vai analisar a fase empatou portanto não é diferente uma pessoa é convencional Certo

que você faz a pessoa é convencional quando você termina ela é que você vai analisar vai fazer um eletro floresta por exemplo aqui é muito diferente só que a gente tá olhando pra florescência e não pela foresee então quais são os exemplos de aplicações de análises qualitativas você pode fazer detecção de patógenos e quer saber se o patógeno presente ou não se você quer fazer o tipo a em desnível identificação de espécies organismos e Detectar mutação uma olhada rápida aqui para cada um desses a cada uma dessas aplicações detecção de patógenos você tem um porquê

bonito em um ano não importa se tem um indivíduo que suspeita que o indivíduo possa inclusive um alimento é que aquele indivíduo ali ele está contaminado com determinado na tocha que você faz você vai coletar amostra desse organismo pode ser no caso mukuli do do nariz um pouquinho vai conectar ao mundo do navio Porquinho se esse for que estiver contaminado com o patógeno que você desconfia você vai extrair o dna de quem nesse muco você vai extrair o dna do porquinho e do patógeno se o patógeno está presente naquele naquele muco você vai extrair o

dna dele não necessariamente dna tá no caso do patógeno porta fonte de renda também de porta falando o fla então do material genético então acreditavam de material genético se você Tem um pouquinho contaminado com determinado patógeno você coletar o muco do porco vai cortar o material genético de um pouco eo material genético do patógeno aí você vai fazer uma pcr em tempo real essa pessoa em tempo real você vai amplificar somente o fragmento do material genético do seu pacote então você utiliza um conjunto de primer um conjunto de primeira sonda que é específico para o

genoma do patógeno Então quando amplificar simplificar é só do patógeno que vai acontecendo lá no final que a gente vai ter dois tipos de resultado se o pouco estava contaminado tinha o patógeno se tinha o patógeno tinha o material genético dele se tinha material genético dele o primeiro single se o premiê se ligou gerou florescência para a emissão da nf e proibição de se ligar no geral fluorescência se um pouco não estava contaminado ele não tinha um patógeno portanto não tinha material Genético do patógeno portanto prima não se ligou há nada que não existia e

não gerou fluorescência então é um sistema de presença ausência isso pode ser feito para patógenos nos porquinhos em aves suínos em humanos mesmo se utiliza este método e em identificar contaminantes em alimentos também outro exemplo aqui identificação de espécies imagine você falar no mercado na época de páscoa comprou um bacalhau bonito quente garante que aquele Bacalhau bacalhau está vendo a peça nenhum pedaço de carne como você sabe que aquilo bacalhau mesmo a hora de saber se aquilo fosse pode extrair o dna daquele bacalhau usar um conjunto de primeira sonda a um conjunto de primeira para

amplificar o genoma de bacalhau só batalhar um convite pra mim é específico de alguma região genômica do bacalhau só bacalhau daquela região genômica ou seja só o dna de batalhão amplifica com Aqueles primers e você vai fazer a pensar em tempo real portanto se você comprou bacalhau extrair o dna de bacalhau com o primaz amplificar geral de bacalhau e vai gerar fluorescência se você comprou outro peixe enganado para extrair o dna desse outro peixe com o pai e oprime não vai amplificar o dna desse outro trecho ele é feito bacalhau não vai gerar florescência então

você consegue detectar a espécie se identificar espécies assim também eu dei Um exemplo do bacalhau mas o sistema de detecção de detecção para os vírus do aedes aegypti mpusica dengue excluiu seguem essa idéia é também você coloca uma amostra de um paciente que você consegue identificar qual é o vírus que aquele paciente estava contaminado se era dengue zicas cunha febre amarela é que vem do aedes aegypti são vírus relativamente parecidos você consegue detectar votação também em células cancerosas você consegue é Identificar se aquela célula que você está analisando teve uma mutação nesse caso você utiliza

primers que vão simplificar especificamente aquela região multada porque existem mutações que elas acontecem com regularidade nessas votações regiões hotspots onde acontece a votação finalmente a votação acontece naquela região então você consegue é criar primers criar ensaios para amplificar essas regiões específicas genotipagem snip aqui está Em uma aplicação muito utilizada talvez a segunda mas a mais utilizada por pcr em tempo real com genotipagem snip com o tac você consegue fazer a genotipagem snip é de uma maneira bem interessante imaginar que eu não sei eu não sei se o milho ele é que pode ou não eu

não sei mas eu coloquei o exemplo do milho imagina que ele seja ele pode tá eu não sei imagine que você quer fazer a genotipagem de uma semente de milho e Você vai usar sondas tackman que necessariamente desse tac ou pelo menos com esse modelo e leves e tackman para funcionar dá pra fazer com os ensaios também dá pra fazer mas aqui no exemplo que eu disse para vocês ouçam agitado e olha só funciona parecido com os outros métodos que eu não sei pra vocês só que aqui você tem uma região onde está o seu

snip álbum imagine uma região genômica ali onde está o seu jipe álbum você vai Desenhar primers que frank essa região e você vai desenhar no caso de onde pode duas ondas duas ondas uma sonda que se liga ao genótipo x a olha o x o alelo um ótimo exemplo o chama de alerta 1 e uma outra sonda que se liga a um alelo 2 na sonda que se diga olha um especificamente exclusivamente no aluno você coloca um repórter eu coloquei num exemplo um importe azul a sonda que se diga exclusivamente especificamente não ela 2 você

coloca Uma sonda amarela e aí você faz a pcr dessas sementes se por um acaso a fluorescência que foi gerada depois da sua pcr é azul só azul você tem um onze goto para o ala nun se você tem uma flor essência somente amarela sendo gerada após a sua pcr você tem um onze goto para o alelo 2 se você gerou as duas florescências de uma mesma mostra você tem um hétero zigoto beleza agora vamos falar das análises Quantitativas a última parte da aula fica comigo que essa parte que ó é a parte que as

pessoas têm mais dificuldade só que eu vou te explicar de um jeito que você nunca mais vai esquecer vamos lá quando você faz uma análise quantitativa é o oposto da da qualitativo em termos de que fazem da pcr você está analisando na análise quantitativa te interessa analisar a fase exponencial da reação de pf então Olha só me interessa saber quanto eu tinha do meu alvo antes de amplifica da amplificação acontecer interessa saber quanto tinha do meu alvo antes de amplificação acontecer quando você quer quantifica alguma coisa você não vai querer curte ficar lá depois a

pf por exemplo está fazendo uma análise expressão de genes você não quer saber o quanto o gene estava esperto depois a pcr você quer saber quanto estava expressa na situação que você está Analisando que está experimentando certo análise quantitativa você vai fazer esse tipo de coisa você vai lá saber você vai calcular quanto você tinha do seu álbum antes se é isso que você quer saber quando sentindo selva onde aconteceu a pf ele é isso que vai fazer alguns exemplos de aplicações quantitativas então analisa expressão gênica de longe essa aplicação mais utilizada a pcr em

tempo real você consegue também fazer a Quantificação de carga viral saber por exemplo se enquanto que um paciente tem de um determinado vírus é no seu no seu sangue o seu plasma ea quantificação de microfone aqui não é diferente o que é diferente da da qualificação de expressão gênica olha só pra você conseguia entender como se faz uma análise quantitativa em tempo real você tem que entender isso que eu falar agora imagine essa situação malu caça Que eu criei aqui pra vocês é uma corrida 100% sem noção é uma corrida onde cada corredor ele larga

de um lugar diferente tem alguns corredores que pilar mais perto da linha de chegada outros que largam mais distante da linha de chegada começa por aí é maluquice depois todo o corredor ele corre exatamente a mesma velocidade não existe um corredor que é mais rápido mais lento que o outro todos com a mesma Velocidade ea linha de chegada é uma linha de chegada convencional a mesma linha de chegada para todo mundo beleza então olha lá a primeira coisa cada corredor larga de um lugar diferente os mais perto outros mais distantes a linha de chegada todo

mundo corre na mesma velocidade existe uma linha de chegada igual pra todo mundo pode fazer algumas perguntas quem chega primeiro quem chega primeiro nessa corrida 2 da icar se todo mundo corre na mesma Velocidade e alguns saem na frente sair mais perto da linha de chegada chega primeiro quem largou mais próximo da linha de chegada certo quem é que chega por último quem pagou mais longe da linha de chegada agora imagine você se instalar sentadinho na arquibancada para assistir essa corrida só está lotada das o estádio não dá pra enxergar nada dá pra enxergar cores

da penteada nada a única coisa que você consegue enxergar é a Linha de chegada mas nada você consegue chegar só a linha de chegada olhando só para a linha de chegada eu te pergunto dá pra saber quem largou antes quem largou mais próximo da linha de chegada em lago mais longe da linha de chegada e só consegue ver o corredor passa melhor passou um passo do espaço trespassou 4 você consegue saber quem é que largou mais próximo da linha de chegada que largou mais longe Consegue-se todo mundo corre na mesma velocidade quem passar antes ali

na sua frente é quem largou mais perto da linha de chegada quem passar por último e não largou mais longe agora imagine que por uma na casa e alguma situação aconteceu e você tem um dos corredores um dos atletas é mais rápido que o outro você só tá olhando a linha de chegada se um dos atletas foi mais rápido que o outro é o primeiro chegando segundo Terceiro chegando quarto chegando quem chega você consegue falar quem que largou mais perto da linha de chegada aqui logo mais longe da linha de chegada provavelmente não não sabe

na verdade porque o cara que é mais rápido ele pode ter ultrapassado o crack é mais lento né então não dá para saber mas esquece essa última situação a pcr em tempo real para análises quantitativas você tem que entender essas três primeiras perguntas que é difícil nós vamos usar essa quarta Pergunta também mas daqui a pouco entendo essas três primeiras partes a primeira não está sentado a linha de chegada todo mundo corre na mesma velocidade quem passar a primeira linha de chegada aqui em alagoas quem passar pelo g1 relatou depois segurei e aí o nosso

gráfico que a gente já viu algumas vezes nossas três amostras bonitonas vamos fazer uma associação uma analogia agora com essa corrida maluca em relação à pcr em tempo real para fazer análises Quantitativas então a corrida é legal a reação de pcr em tempo real que pcr mesma coisa que pcr em tempo real então a corrida é a nossa presença em tempo real os corredores são as amostras a linha de chegada é um limiar de fluorescência que você pesquisador vai estabelecer é aleatoriamente contanto que seja dentro da fase policial da reação então você vai Escolher uma

quantidade florescência analisar você vai estabelecer um em a de florescência analisar e essa esse limiar de florescência vai chamar de thrash já vai entender para quê serve esse negócio a ordem de chegada é um negócio que a gente chama de ciclo treschow de um ciclo de qualificação ou ctt ou sequer que é justamente isso daqui ó vão lá nosso exemplo você está sentado na linha De chegada da linha de chegada é o trecho que você estabeleceu você só consegue analisar o que acontece com as amostras quando elas passam ou quando elas atingem esse nível de

fluorescência ou seja você está sentado na arquibancada enxerga mais nada ou seja você está vendo somente a fluorescência o nível de fluorescência que te interessa o que aconteceu na reação antes do trecho onde não te interessa neste momento e o que Aconteceu acima do trecho de não te interessa que neste momento só te interessa saber quando as amostras passarão pelos trechos só te interessa saber quando o atleta passou pela linha de chega de olha no meu exemplo nós temos a mostra laranja a mostra laranja amostra laranja ela precisou de 14 ciclos de pcr ela precisou

de 14 ciclos de pcr para atingir aquele limiar de florescência que você estabeleceu a amostra azul ela Precisou de 17 ea mostra vermelha precisou de 20 ciclos de pcr para atingir esse limiar de fluorescência que você estabeleceu beleza que está falando com isso quem está falando com isso quem que precisou de menos ciclos de pcr para atingir um nível x de florescência amostra laranja estão seguras informação a gente vai falar sobre ela daqui a pouco o lugar de largada o lugar de largada ou seja quem largou mais perto da linha de chegada ou quem largou

mais Longe da linha de chegada na verdade é a quantidade inicial do meu alvo é aquilo que eu quero quantificar no final das contas é o meu objetivo é o que eu quero qualificar então olha só de novo os corredores que largaram mais mas a linha de chegada chegaram lançando a linha de chegada dos corredores que largaram mais longe da linha de chegada chegando depois a linha de chegada as amostras as amostras que tinham maior Quantidade inicial do meu alvo com maior quantidade de do meu alvo antes da 3r elas precisam de menos ciclos de

pcr para atingir aquele nível de florescência que você estabeleceu imagine que está analisando ali você vai fazer a seguinte pergunta eu quero analisar eu quero saber quantos ciclos de pcr a minhas amigas amostras precisão as minhas amostras precisam para atingir esse nível de florescência aqui vamos chamar sua essência senha não é isso que Acontece número não existe tá mas aqui eu quero saber com as amostras atingissem um nível de florescência eu quero saber quantos ciclos de pcr elas precisarão para atingir um nível sem de florescência não está olhando a ió que a amostra laranja para

atingir um nível sem de florescência ela precisou de 14 ciclos de pcr amostra azul precisou de 17 ciclo de pcr que você consegue concluir por com isso o corredor chegou essa linha de chegada a laranja ou azul A laranja se a aranha chegou antes da linha de chegada ou seja se a laranja precisou de menos seguros de pcr para atingir esse nível de florescência que você estabeleceu a gente sabe que ela tinha maior quantidade inicial do meu alvo do seu alvo antes da pcr acontecer se ela precisou de menos ciclos de pcr ela chegou mais

rápido na linha de chegada quer dizer que ela tinha maior quantidade inicial do alvo Antes da pcr ou seja a água mais próximo da linha de chegada já a mostra vermelha ela precisou de 20 ciclos de pcr para chegar à linha de chegada na china atingiu o nível de fluorescência que você estabeleceu portanto ela tinha menor quantidade inicial do seu alvo antes da reação de pcr agora uma pergunta pra vocês uma pergunta aqui ou mais do que importa se isso tudo que eu falei até agora isso aqui é só uma Questão para jogar para um

próximo vídeo com a próxima aula que já começa a complicar um pouco lembra que eu perguntei pra vocês gente o corredor que corre corre mais rápido que o outro a gente consegue ainda fazer essas estimativas a gente consegue falar quem lagoas que largou depois agora imagine que você tem uma mostra uma reação de pcr que ela é mais eficiente e uma outra reação de pcr imagine que uma mostra uma reação para Uma mostra x ela está acontecendo com 100% de eficiência ou seja realmente duplicando a cada ciclo mas existe uma outra mostra que não está

duplicando a cada ciclo por um motivo sei lá um primeiro não está funcionando direito a uma coisa que você fez errado na hora de montar reação alguma coisa aconteceu e ela não tem a mesma eficiência você consegue comprar uma outra você consegue usar uma como referência em relação à outra Não sei talvez não então vamos jogar só joguei uma informação pra gente conversar em uma próxima aula que a eficiência de uma reação de pcr em tempo real é fundamental para que a gente consiga fazer uma análise quantitativa análise quantitativa com acurácia beleza o pulo do

gato das análises quantitativas eu já falei é uma pergunta que é uma pergunta que você tem que fazer pra você mesmo para você conseguir entender como você quantifica coisas Através da pcr em tempo real ea pergunta é a seguinte quanto os ciclos de pcr foram necessários para que a flor essência de cada amostra atingisse o trecho de que eu estabeleci de novo quanto os ciclos de pcr foram necessários para que a flor essência de cada amostra ao longo da pcr atingir aquele limiar de fluorescência que eu estabeleci para fazer análises quanto menor a quantidade de

ciclos de pcr maior a quantidade inicial de alvo Quanto maior a quantidade excessiva de pcr menor quantidade inicial de alvo isso é verdade sempre vai variar de caso a caso ninguém fazer normalizações é preciso vários controles mas aqui não importa isso agora o que importa você entender o conceito e o conceito é isso que acabei de falar só de novo né voltando lá o nosso exemplo a resposta da pergunta anterior a quantos se hoje percebe cada amostra precisa para atingir aquele limiar de florescência Que eu estabeleci no caso da laranja e precisou de 14 17

ea vermelha 20 então a gente pode inferir aqui de uma maneira grosseira que a quantidade inicial de amostra do laranja era maior do que a azul que era maior que a do vermelho mas o você falou pra mim eduardo que essa fluorescência esse trecho onde é esse limiar de fluorescência que a gente estabeleceu estabelecido de maneira aleatória contanto que fosse dentro da fase Policial exatamente você pode colocar o trecho em qualquer lugar contanto que seja ainda a fase policial ou seja você vai escolher um lugar na arquibancada para assentar não pode ser muito no começo

da corrida e não pode ser muito no fim da corrida também no final da corrida no começo da corrida todo mundo aquecendo tem um burburinho e se não consegue ter muita informação do que está acontecendo lá no final da corrida no finalzinho depois da linha de Chegada os corredores já tão cansada e ficar mais rápido quando não dá não tem que ser sempre aí mais ou menos no meio contanto que seja na fase inicial é uma quantidade de florescência uma linhagem florescência que você estabelece de maneira aleatória a então se eu trocar se eu escolher

um outro trecho onde vai mudar os resultados se diminuir esse limiar de fluorescência valdir vai alterar os resultados se aumentar esse limiar de fluorescência vai alterar os Resultados se você estiver trabalhando dentro da fase exponencial e se a eficiência da reação ela foi igual pra todo mundo não vai alterar seus resultados olha esse outro gráfico aqui ó eu baixei um pouquinho o limiar de florescência ou seja eu sentei em outro lugar ali na arquibancada na corrida quando eu diminuir é o limiar de florescência na verdade eu fiquei em um dos corredores largaram da onde os

corredores os Atletas largarão na corrida olha o que aconteceu diminuir o limiar de fluorescência então como eu sentem mais perto da largada os corredores os corredores precisaram de menos tempo para passar ali na minha frente eu tava sentado ou seja as amostras precisaram de menos 5 de pcr para atingir aquele limiar de fluorescência a nossa laranja passou a ela precisou de 13 pontos pontos cinco ciclos de pcr azul 16.5 ea vermelha 19.5 exatamente meio ciclo é a Menos pra cada uma das amostras o valor absoluto que vocês estão vendo aí ou seja o ct valor

de cêtê absoluto ou c que ele diminuiu né ele diminuiu passou de 14 para 13 meio de 17 para 16 e meio de 20 para 19 e mail esses valores absolutos diminuíram mas é isso que importa não é isso que importa o que importa é saber a distância entre os corredores se você olhar na no primeiro caso um trecho de mais alto nós Temos uma diferença de exatamente três ciclos da amostra laranja para azul se você fizer 17 ciclos - 14 ciclos da três ciclos de diferença três ciclos de diferença se você for pelo gráfico

2 onde a gente abaixou o limiar de fluorescência de 16.5 para 13.5 também dá três ciclos diferença exatamente então a relação entre as amostras não mudou e é isso que interessa não me interessa o valor absoluto não Interessa a relação entre a nossa estou sempre comparando olhando uma mostra com a outra é bom fazer um teste aqui pra vocês pra ver se você entender a pergunta eu sei que a amostra laranja tinha x cópias do meu alvo antes de eu fazer a pcr um algum motivo é por mágica por alguma razão inexplicável sabia que a

mostra laranja tinha x cópias do meu alvo antes de eu fazer a pcr agora eu faço uma pergunta pra vocês quantas cópias do meu alvo tinham as Amostras azul e quantos moram a cópia do meu alvo tinham a amostra vermelha uma coisa a gente consegue falar de cara a gente consegue falar que a mostra laranja ela tinha maior quantidade de cópias do meu alvo do que azul e maior quantidade de cópias do mel que é vermelha a gente já consegue falar isso logo de cara porque ela precisou de menos ciclos de pcr para atingir aquele

limiar de florescência que eu estabeleci certo certo agora quanto quanto a mais Ela tinha o quanto a menos tinha a azul quanto menos tinha vermelha olha só vamos lá aqui neste exemplo dele os valores lá embaixo da hora lá embaixo agora porta a gente olhar para esses novos ciclos ct ou ciclos e que a mostra laranja precisou de 15 ciclos de pcr para atingir o limiar de fluorescência que estabelecia a amostra azul ela precisou de 16 círculos de persegue para atingir já atingiu o limiar informações Que eu estabeleci e exatamente um ciclo de pf o

que acontece em um mesmo tubo em uma mesma reação entre um ciclo e outro de da pcr o que acontece com o número de cópias do meu fragmento alvo entre o ciclo e um outro ciclo da pf a cada ciclo vocês já sabem a quantidade do meu alvo dobra ela dobra se portanto se a amostra sul ela precisou de um ciclo a mais de pcr quer dizer que ela tinha exatamente a metade de dna que tinha a mostra laranja se a mostra azul Precisou de exatamente um ciclo a mais de pcr que a nossa laranja

isso quer dizer que ela tinha ou não tinha antes da pcr exatamente metade da quantidade do meu alvo antes da pcr ea mostra vermelha acusou de exatamente dois ciclos em relação à nossa laranja então ela tinha quatro vezes - alvo antes da pcr do que a laranja então a resposta é x sobre dois para azul e xii sobre quatro para vermelha finalizando aqui então vamos transformar Isso agora em número se eu sei que a mostra laranja tinha 10 mil cópias do meu álbum mas ninguém quer modificar a carga viral de um paciente eu sei que

a amostra o paciente um tinha 10 mil cópias de um determinado pacote num determinado vírus ali no seu passo no seu sangue dez mil cópias daquele vírus no seu sangue à mostra laranja 10 mil cópias então é antes a pgr tinha 10 mil cópias quantas cópias eu tenho desse mesmo Vírus no paciente azul no paciente azul que foi o paciente que precisou de exatamente um ciclo mas percebe a gente fez um exercício anterior exatamente a metade 5 mil cópias o vermelho quatro vezes menos duas mil e quinhentas cópias nesse caso aqui eu tô falando de

carga viral por exemplo eu 'tô' olhando para os números absolutos né eu 'tô' olhando para o número de cópias e é isso que me interessa saber Quantas cópias de um paciente um quantas cópias de um paciente pois é preciso saber se a informação do número absoluto é importante esse tipo de análise quantitativa é chamado de análise quantitativa absoluta onde me interessa o valor final absoluto do número de amostras meu alvo agora olha isso aqui nesse caso eu não sei quantas cópias eu tenho do meu alvo néné essas amostras laranja azul e na vermelha mas não

me interessa saber Não me interessa becos me interessa saber a diferença de quantidade do meu alvo em relação uma mostra e outro interessado em ver quantas cópias do álbum quanto tinha dado ao stress saber comparar uma cota quer saber a relação de diferença entre a nossa laranja entre a mostra azul entre a mostra vermelha nesse caso fazendo uma análise é quantitativa relativa nesse caso não me interessa saber os valores absolutos e sim a proporção ou a Relação do número de cópias do alvo entre as amostras esse tipo de qualificação é chamada de quantificação relativa não

me interessa saber o número absoluto mas sim a relação entre o então quando eu quero isso quero saber aqui o que me interessa saber é que eu não quero saber quantas cópias têm a mostra laranja eu quero saber que a nossa laranja é duas vezes mais concentrada ou a nossa laranja tem duas vezes mais alvo do que a amostra Azul e azul duas vezes mais que a nossa vermelha interessa saber quanto tem ali número de cópia a quantidade de dna alimento não me interessa b3 comparar uma com a outra geralmente é isso que a gente

faz canais de expressão gênica não quero saber quantos genes está bem expresso dentro da situação em relação a dois o interessa isso quero saber se a mostra uma situação um ato teve uma expressão de genética diferenciada em relação a Moça dois se teve diferença a expressão gênica entre as duas situações que experimenta beleza então é isso aí essa é a qualificação relativa ao resumo aqui ó para a gente finalizar fechar o raciocínio lembrando que a pcr em tempo real é a técnica é uma técnica baseada em pcr e aqui lembrando os puro dos gatos o

número de florescência aumenta de maneira proporcional ao aumento do número de cópias do álbum a reação essa É a premissa da pcr em tempo real ea gente falou que nessa aula dos sistemas de detecção cyber itaqui ma lembrando que eu posso falar de outro se vocês quiserem saber a temperatura the melt de um fragmento de dna depende do tamanho a quantidade de bases e da sua proporção de gc em relação à at&t é assim que a gente identifica atm assim que a gente analisa o perfil de dissociação e é dessa maneira que a gente descobre

se tem ou não é a Amplificação específica uma reação com cyber green a duas fases da pcr ou qpcr que nos interessa mais a fase de platô onde vai fazer as análises qualitativas ea fase exponencial onde a gente vai fazer as análises quantitativas a análise da corrida maluca a pergunta que você deve fazer quando vai fazer uma análise quantitativa quando você quer quantifica alguma coisa seguinte quantos ciclos de pcr foram necessários Para que a flor essência de cada mostra atingir aquele trecho onde aquele limiar que eu estabeleci b.leza é isso aí a gente é essa

aqui foi uma aula é introdutória pcr em tempo real aqui os conceitos mais básicos iniciais para você entender e finalmente concretizar esses conceitos na cabeça de vocês e se vocês tiverem qualquer dúvida deixe nos comentários manda pra mim que eu vou ter o maior prazer do mundo e responder se eu souber eu vou ter o maior prazer do Mundo e se com isso pra vocês antes finalizar se você ainda não se inscreveu no canal não se esqueça de se inscrever daum joinha pra mim e aí o tal link pra mim as outras redes sociais entra

lá e nos siga por lá também beleza um grande abraço a gente se vê na próxima aula tchau