Aprenda os fundamentos do sequenciamento de nova geração

o olá seja muito bem-vindo ao universo da biologia molecular eu sou eduardo castanho e hoje nós vamos falar em sequenciamento de nova geração sequenciamento de nova geração para você que está chegando agora chegou aqui e não veio por causa da semana do comércio por aqui saiba que esse vídeo é saulo é parte de um conjunto de aulas um de mala mais completa que é uma aula básica com conteúdo básico dedicada a as pessoas que estão começando a fazer biologia molecular agora ou querem aprender organizar o raciocínio aprender desde 10 então é só essa aqui é

a quinta aula teve outras várias aulas longo da semana procura vou deixar aqui a playlist o link da playlist você quiser assistir às aulas lá no comecinho lá das partes a parte mais básica aula completona vai tá tudo lá a partir do dia vinte e seis de janeiro de 2020 e se você quiser saber tudo busca lá então tá bom mas saiba que ele já essa é a quinta aula desse conjunto de aulas que eu tô dando eu tô falando isso porque porque talvez alguns conceitos aqui que você não saiba e é por isso que

eu te recomendo aqui para você assistir essa aula entender tudo que eu vou falar aqui você precisa entender a estrutura do dna você precisa entender pcr e talvez ali um pouquinho de sangue você conhecimento o sangue tá então além do link da para início da semana começa por aqui eu tô colocando aí também o link da aula de pc que ali eu falo da estrutura de dna explica exatamente como funciona a pc então assim se essas outras aulas antes que você precisar desses conceitos iniciais tá bom antes de começar se inscreve no canal por favor

não se esquece escrever no canal se importante demais para que o algoritmo do youtube entenda que pessoas com o seu perfil gostam desse conteúdo e assim a gente vai alcançar mais pessoas a fazer esse canal crescer e desmistificar toda essa complexidade que não existe em relação as técnicas em biologia molecular também me siga no instagram arroba unir e vão para lá né e aí e aí tá começando então a parte de sequenciamento de nova geração agora a gente começou a conversar agora a gente começou a conversar quer ir as técnicas estão começando a ficar mais

complexas um poucos é complexo mas não é muito não tá ela ela tem bastante paciência mais um negócio difícil entender vocês vão entender tudo o que vocês precisam entender hoje para começar a parte de energia sequenciamento de nova geração então vamos lá então sequenciamento de nova geração também a sequenciamento como temos que a gente falou ontem que foi o sequenciamento sangue também você conhecimento objetivo é gerar a descobrir a sequência de nucleotídeos na ordem correta de uma molécula de dna é esse objetivo você conhecerá nucleotídeos que uma molécula de dna alpha a diferença do sequenciamento

ou as diferenças do sequenciamento de nova geração em relação ao sequenciamento sanger a verdade são muitas mas existem duas que a gente é a primeira é a quantidade de dados que é gerado consequência mente nova geração a quantidade de dados que geral por sequenciamento sequenciamento de nova geração é infinitamente maior quando a gente compara a consequência muito sangue em um mesmo período de tempo por exemplo sequenciamento sangue um equipamento de alta outro pude seja de alta demanda consegue tirar bastante dado sequenciamento sanger vai 96 amostras por por corrida vão falar que consegue fazer um sequenciamento

bem feito aí mil pares de base sequenciado então 96 mil pares de bases sequenciados em uma corrida o sequenciamento de nova geração vai variar de equipamento para equipamento de química para química mais é possível sequência às 20 vezes um genoma humano ou seja se 60 milhões de base sequenciados e uma única correta é possível fazer isso depende da máquina e uma toda a máquina que faz isso não é toda a química que faz isso mas é possível fazer com sequenciamento de nova geração então a primeira coisa é essa com o fim de dados gerados é

muito maior em lgs em relação a sangue outra coisa metodologia que não tem nada a ver na verdade são técnicas completamente diferentes até dentro das técnicas disponíveis aí dentro de emergência tem variação e eu vou explicar para vocês sobre isso então nosso objetivo é sequenciar dados muitos dados muitos no teu tios todos ao mesmo tempo uma observação aqui né essa que a gente fala de mgs como eu disse para vocês nossa a gente sempre associa ngs como geração de muito dado e era isso mesmo começar a isso o grande diferencial mais hoje com a evolução

das tecnologias equipamentos que a gente tem hoje no mercado dá para fazer os dois você consegue gerar muitos dados muitos dados o que vai diminuir bastante o seu custo por base sequenciada mas você pode ir há poucos dados também dependendo do equipamento que você tem isso pode ser interessante porque quando você conhecia pouca coisa e muita coisa você aumenta muito as possibilidades os você pode fazer com mgs então vocês vão fazer entender um pouco sobre isso lá no final da hora que eu falar de aplicações o objetivo você conhecer esse monte de coisa aqui que

nós vamos fazer é pegar o nosso alvo é que eu tô mostrando uma molécula que o nosso alvo é azul a gente vai modificar as extremidades dessa molécula fazer várias cópias dela e depois fazer o processo sequenciamento nós vamos falar aqui em duas tecnologias de duas empresas que são as duas empresas que dominam esse mercado de longe então assim tem outras máquinas que fazem isso tem mas é tão pequeno principalmente aqui no brasil na américa latina a presença dessas outras desses outros equipamentos é tão pequena que não vale a pena mencionar hoje a não ser

que vocês queiram muito ou que essas outras tecnologias venha a ganhar mercado aqui no brasil mas a gente tá falando principalmente de thermofisher.com a tecnologia aí o torrent ilumina é independente de qual das empresas qual máquina não importa não importa com que você esteja trabalhando o que você está estudando sobre ngs necessariamente você vai cair nesses quatro passos aqui do fluxo de trabalho o primeiro passo é a geração de uma biblioteca a construção de uma biblioteca de fragmentos são os fragmentos que nós vamos se conhecer lá na frente e isso é necessário eu vou falar

porque necessário com calma ali na frente mas é por principalmente por conta do tamanho do fragmento que a gente consegue sequenciar e para gerar para fazer a modificação nas extremidades desses fragmentos que é fundamental colombo todo o processo que são esses dois motivos então depois a gente vai ter que fazer uma amplificação que nada mais é que uma pessoa é uma pessoa é modificada e vai fazer uma purificação para para que as máquinas e os equipamentos de energético e conseguiu detectar um sinal e o sinal varia de máquina para máquina de equipamentos o equipamento e

depois a gente vai para técnica de sequenciamento 15 anos da molécula está sendo sequenciado aí por último gente vai para análise dos dados que é um outro universo e obviamente não dá para falar só de só de análise de dados gente poderia ficar uma semana conversando é bastante bastante coisa mesmo e é um tema bastante complexo pão lá então desse dentro desses quatro passos aí por que que a gente precisa fazer essas quatro passos né eu comecei ali falando um pouco sobre a biblioteca mas por que que a gente precisa fazer uma biblioteca depois fazer

uma amplificação para ir sim você conhecer a porque a gente não se conhecia direto mais ou menos como a gente faz com sangue só que também não é exatamente direto mas é um processo bem mais rápido bem mais simples porque a gente precisa criar uma biblioteca e depois eu não tenho que ficar só biblioteca são características da metodologia de sequenciamento aqui da técnica de sequenciamento em sim a gente poderia dizer até que são limitações dessas técnicas e vocês vão entender e eu tô falando mas de todo mundo uma das limitações o tamanho do fragmento que

a gente consegue sequenciar independente do equipamento que você utilize a tecnologia que você utilize dentro dessas duas tá é iluminado thermofisher é você não consegue sair conhecer a fragmentos muito grandes maior que dá para você conhecer aí chorando assim sente-se para de base mas são aplicações muito específicas no geral vai ser conhecer a fragment de 200 pares de bases mais ou menos 150 200 até 300 mas no geral fica entre 250 e mais honesto o que é o fragmento muito pequenininho né quando se compara com genoma inteiro a gente consegue resolver esse problema lá na

frente eu vou mostrar oi e a sensibilidade de detecção também porque é de alguma maneira a gente vai gerar um sinal no processo ao longo processo de sequenciamento e e sinaliza ser detectado quando a gente tem um sinal muito fraco talvez o equipamento eu não consigo detectar ou detecção não seja suficiente que a gente precisa fazer cópias do nosso alvo várias cópias do nosso alvo para que a gente gera um sinal forte o suficiente para o equipamento consiga detectar sinal ao longo do processo de conhecimento e como entender então aqui sobre a construção de biblioteca

na construção de biblioteca eu não vou separar entre iluminai thermofisher porque a a ideia é muito parecida o independente da máquina você tá utilizando o conceito geral é o mesmo então não precisa de um tempo porque separar entre thermofisher iluminaki e olha só a gente pode separar a construção de biblioteca em três objetivos principais então nós que a gente vai fazer uma cascata agora uma hierarquia de informação nós temos os quatro passos do fluxo de trabalho um deles a construção de uma hipoteca a função de biblioteca tem três objetivos principais são os quatro passos os

três objetivos principais e um dos objetivos dele é gerar fragmento no tamanho adequado gerar fragment o tamanho de quarto e a gente pode girar fragmento o tamanho adequado de três maneiras diferentes que é o que eu vou mostrar aqui então de novo a passo que de trabalho um deles a construção de biblioteca a construção de biblioteca ela tem três objetivos um dos objetivos é gerar fragmentos do tamanho adequado para se fazer isso a gente tem aqui basicamente três opções tem outras opções também mas essas aqui são as principais e olha só primeira coisa e tudo

porque a gente tem que gerar fragment de tamanho adequado porque como eu disse para vocês uma alimentação da tecnologia de sequenciamento de nova geração ainda não é possível pelo menos dentro dessas duas tecnologias que eu tô mostrando para vocês não é possível você conhece a fragmentos muito longos pagamento muito longo eu tô dizendo mim parte de baixo por exemplo mais outra ou acima de 600 não é possível fazer sequenciamento nesses fragmentos longos e longos então a gente tem gerar fragmentos menores para aí sim cadê dentro da tecnologia você é compatível com a tecnologia e fazer

o processo de sequenciamento então para gerar esses fragmentos pequenininhos de 200 250 150 300 pares de base a gente pode digerir o nosso alvo que pode ser por exemplo dna genômico que a gente saiu de uma célula de um tecido a gente pode digerir esse dna genômico com uma enzima ou um conjunto de enzimas então fazer uma digestão enzimática a gente pode fazer também a quebra mecânica que não é digestão tá eu vou arrumar depois é uma quebra mecânica desse fragmento de se fragmentam a gente vai fazer pode ser por exemplo um processo de sonegação

e vai vibrar numa frequência lá muito rápida e a mulher com ela vai fragmentar a gente consegue ou pelo tempo que a gente deixa a essas enzimas digerindo a molécula de dna ou pelo tempo ea frequência que utiliza aqui no processo de comunicação escolher o tamanho de fragmento que vai ser gerado toda para escolher mais ou menos o tamanho do fragmento que você quer gerar o quanto mais tempo que você deixa ingerindo com enzima por exemplo você vai ter fragmentos menores essa regra mais ou menos tá mas dá para ajustar o tempo que você digere

ou que vocês única amostra faz sonegação da mostra é para selecionar fragmentos tamanho que você quer e a terceira opção é pcf que eu vou explicar já para mim ficar confuso vamos falar aqui primeiro dois sistemas né de fragmentação a fragmentação mecânica não digestão mecânica fragmentação mecânica então a gente que você tem aqui seu dna alvo seja o que for pode ser um gênio dna genômico não importa agora não importa o que seja você vai fazer ou trabalhar com as enzimas ou fazer a solicitação por tempos determinados e o que você vai gerar é isso

aqui fragmento pegar esse seu dna e fragmentário inteirinho no caso da pcr que a terceira opção a gente vai fazer terceira você não faz pcr para amplificar um fragmento de sequência específica então aqui a gente também consegue selecionar um fragmento específico aqui amplificação e se ela não é tão importante mais o mais importante é selecionar um fragmento específico editar no específico são a pcr utilizar persegue para gerar fragmentos adequados por sequenciamento é uma estratégia excelente excelente para várias aplicações e muito mais simples é um um simples e muito mais versátil do que as ingestões que

eu mostrei pra vocês a fragmentação por enzima ou mecânica então o que a gente vai fazer aqui a pcr só que em vez de fazer a pessoa rir de um pagmento vai fazer a pessoa rede um fragmento com gente faz quando vai fazer uma pcr aqui ele vai fazer uma pcr multiplex ou seja fazendo mais de uma pcr em uma mesma reação isso é uma reação de pcr multiplex só que eu não tô fazendo eu não tô falando de qualquer multiplex não eu tô falando de um ultra-high multiplex você vai fazer centenas pode ser dezenas

centenas ou até milhares de reações de pcr em um único tubo existem tecnologias que fazem só mais utilizada é aplique da thermo fisher que a ilumina comercializa também é então que você vai fazer aqui pegar seu alvo e fazer perseguem de vários fragmentos dentro do seu alvo e aí você no fim das contas vai ter os fragmentos que você quer do tamanho que você quer e as regiões que você quer em toda essa maneira a gente fez aí o primeiro objetivo que era gerar finalmente de tamanho adequado segundo objetivo adicionar adaptadores as extremidades de cada

um desses fragmentos e só que é fundamental porque como todo fluxo de trabalho do mgs de sequenciamento de nova geração ele é complexo e demorado e demanda muita manipulação desses fragmentos dessa biblioteca que a gente está construindo é fundamental que a gente conheça as extremidades nesse fragmento mas como a gente vai conhecer extremidade desse palio mensagem de gerir com mãe zima ou sonicor fez uma sonegação ou aí no caso a pessoa gente conseguiria é mais cada fragmento da linha uma sequência diferente então para solucionar esse problema que a gente faz adicionar liga fragmentos dupla fita

fragmentos de dna dupla fita de sequência conhecida nas extremidades de cada um dos fragmentos que a gente tirou no passo anterior que é o que eu estou mostrando aqui então vamos só fazer um é só raciocínio porque todas as vezes na maioria das vezes eu mostrei a molécula de dna como molécula de dna aconteça com g né aqui eu estou mostrando molécula de dna com essa fita essa fita azul estou imagine que isso aqui é uma molécula de dna dupla fita que eu tô mostrando para vocês só que eu tô mostrando só uma fitinha azul

aqui para ficar mais fácil tá e que a gente vai fazer nós vamos colocar aqui uma extremidade desse fragmento um dna dupla fita também só que você conheça conhecida que é a sequência vermelha nessa extremidade e eu vou colocar uma sequência dna dupla fita também de sequência conhecida que a sequência verde para as empresas elas produzem isso as empresas elas comercializam geralmente você compra isso junto com os kits de mgs depende da aplicação que você vai fazer já vem com tudo isso daí sai aí ficou uma mão na roda só fazer uma ligação aqui eu

mando ela ligar assim mesmo que vai fazer essa ligação é não é não é nada muito complexa um pouco demorado mais nada complexa e dessa e passa conhecer as extremidades de todos os fragmentos mesmo que a gente não saiba que nem ali no meio as extremidades a gente conhece agora isso vai ser uma mão na roda vários pontos lá na frente oi e aí por último a gente vai adicionar marcadores de amostra que no caso da ilumina chamado the index no caso da thermofisher era chamado de bar code isso também é muito interessante porque você

consegue fazer multiplex da sua reação ou seja você consegue sequenciar um várias amostras ao mesmo tempo tudo misturado o que você vai fazer é construir a biblioteca de cada uma das suas amostras separadamente depois pegar todos esses fragmentos que você de todas as bibliotecas que você construiu seja todas as amostras juntar tudo num único tubo e seguir com protocolo tudo ali misturado e dá para fazer isso porque porque quando a gente adiciona os adaptadores lá nas extremidades do fragmento você tem diferentes versões dos adaptadores existe uma parte dele aqui quer é igual para todo mundo

que a parte vermelha existe uma parte aqui na outra extremidade que é igual para todo mundo que a parte verde mas os adaptadores eles é bem com um outro fragment ali no meio um pedacinho pequenininho é que no caso é um fragmento tinho preto e que que eu faço eu construo a minha biblioteca da amostra a utilizando esse adaptador que tem esse fragment nho essa aqui preto e só as bibliotecas de dna da minha mostra a vão ter esse fragment eo preto eu faço a mesma coisa aqui para mostrar b só que utilizam fragment o

roxo e para mostrar ser eu utilizo um fragmento tinho é laranja o amarelo dessa maneira quando eu sequenciar a cada um desses fragmentos eles vão estar todos misturados lá na minha na minha reação uma das primeiras coisas que é sequenciada uma das primeiras partes que é sequenciada no fragmento é isso daqui que é justamente o meu marcador de amostra então quando o sequenciamento começa a e o equipamento detecta a presença desse preto aqui eu sei que ele dá mostrar ou não sei conhecimento começa ela tudo misturado equipe e esse fragmento de um roxo eu sei

que dá mostra bem assim por diante então esses fragmentos eles são uma mão na roda para gente poder misturar misturar amostra de sequenciar várias amostras mesmo tempo tá dá para fazer de duas amostras até 384 e aí a gente vai para amplificação tão biblioteca foi isso daí esses três objetivos que eu falei para vocês que é gerar fragmentos tamanho adequado adicionar os adaptadores nas extremidades de todos os fragmentos e adicionar marcador de amostra a gente quiser trabalhar com mais de uma amostra quando a gente entre amplificação nós vamos ter que separar agora entre ilumina e

thermofisher porque a tecnologia muda o processo muda de um para o outro vamos a primeira ilumina como é que funciona olha só eu tenho aqui um fragmento da biblioteca e eu vou repetir isso que eu vou falar para vocês agora várias vezes porque isso tem que ficar muito caro eu não vou trabalhar com fragmente-se é o certo o meu fragmentando o dna genômico por exemplo então eu tenho milhões de fragmentos gerados ao longo do meu processo de construção de biblioteca eu tô mostrando uma para ficar fácil entender de uma maneira didática tá mas imagine que

o que eu vou mostrar a partir de agora tá acontecendo com todos os fragmentos todos o mesmo então tem um fragmento aqui que eu não sei assim conhecido meu que eu quero diz colocar o descobrir mas você as extremidades porque eu coloquei adaptador eu preciso amplificar esse produto por que que eu preciso amplificar eu disse lá para vocês que assiste fosse colocar esse aqui esse fragmento sozinho lá no processo de sequenciamento ele ia gerar um sinal independente da tecnologia no caso da ilumina é um sinal fluorescente e a gerar um sinal fluorescentes algum sinal florescente

muito fraquinho a máquina não ia conseguir detectar essa variação de fluorescência essa geração de fluorescência e não ia ter sequenciamento então que eu tenho que fazer tirar várias cópias desse meu fragmento para no final das contas gerar um sinal fluorescente bom detectar então que eu vou fazer aqui gente nada mais é do que pcf é isso que eu tô fazendo aqui é uma amplificação precisa reiniciar tão criticar eu tô fazendo uma amplificação é fácil verificar isso daqui por quê que é fácil porque eu conheço as extremidades estão enganados são iguais para todo mundo só que

vocês estão vendo que meu percebe está cortado aqui né porque que tá cortada porque não é uma pessoa reconvencional no caso da ilumina na verdade um caso das duas tecnologias que a gente vai fazer o seguinte é fazer a pcr desse fragmento eu tô mostrando de um fragmento mas eu não quero que esse fragmento fica em solução eu não quero que as cópias esse fragmento ao longo do ciclo da pessoa que eles vão ficando em solução dispersa eu quero que todos eles fiquem juntos eu preciso que todos eles fiquem juntos para quando lá na frente

eu vou gerar um sinal fluorescente eu consigo gerar um sinal bem forte então eu vou manter eles todos juntos aí sim eu vou gerar um sinal fluorescente lembrando de novo eu tô mostrando para um fragmento mas a gente vai fazer essa e certa de e aqui e manter todos os fragmentos juntos de todos os fragmentos a minha biblioteca todos os fragmentos por direito lá no meu ao longo da minha criação de biblioteca eu vou fazer esse processo tão cada fragment vai ser amplificado e o produto essa amplificação vai ficar tudo juntinho no caso da inúmera

como é feita essa pcr então como é feita essa amplificação a gente vai pegar o produto lá da minha construção de biblioteca e jogar nessa superfície aqui ó eu tô mostrando dessa superfície assim funciona nessa superfície nós temos oligonucleotídeos associados ao longo de toda ela ao longo de todos os perfis que óleo nutritivo e esse daqui gente é primer isso aqui é primer primer complementar a quem aos adaptadores tão a gente vai fazer a pcr utilizando esses primers que estão presos nessa superfície um desses crimes é complementar à a dori se o outro primo é

complementar ao outro adaptador então vamos jogar um fragmento aqui para gente ver a deixar mais claro que essas superfícies para ficar bem evidente o que acontece lá na reação a gente pegou aquele produto da nossa construção de biblioteca que ainda não tão amplificada ele só tá fragmentado e com adaptador até agora e vai colocar vai hibridizar esse fragmento aqui nessa superfície hora que ele encontra a complementaridade com primer tá lotado de primeiro ali pra ele vai se ligar ele vai se ligar ali e como isso daqui é um primer sem te colocar uma dna polimerase

nucleotídeo livre fazer os ciclos da pcr ou proporcionar as condições para que a dna polimerase e faço a extenção exatamente isso que vai acontecer a gente vai gerar um fragmento complementar ele fez uma cópia fiz uma cópia só que que tem diferente aqui vocês repararam que esse primo ele tá preso né esses planos que está utilizando aqui eles estão presos nessa superfície sem o produto dessa pcr o produto dessa pcr está preso na minha lâmina que tá preso nessa superfície e essa essa primeira mulher que a gente usou veio lá da construção da biblioteca tá

solta e solução eu tiro ele ele ali da minha reação é e o produto desse primeiro ciclo de pessoas que ficou preso aqui se eu fizer mais um ciclo de pcr agora utilizando esse produto aqui com o template que vai acontecer tem primer para essa extremidade aqui tem eo primer está aqui está aqui o seu repetir agora fazer mais um ciclo dessa pessoa é de frentona esse fragmento ele se dobra que se dobram estão dobrado aqui dentro não fica para cima como eu tô mostrando né mas ele tá aqui ele se liga no outro primer

próximo a ele que também está preso na superfície e também está pelo superfícies e aí eu faço mais um círculo de extensão formando um novo fragmento se eu de naturais e os dois fragmentos aqui essa dupla fita que acontece só que tem agora dois fragmentos presos na minha lâmina e na minha superfície se eu fizer mais um ciclo de pcr tem primeiro para esse cara aqui tem tá aqui do lado e tem primer para esse tem tá aqui do lado vamos fazer mais um ciclo de pcr e como é que ela vai circulava vai sociale

com os primers das que estão presos na superfície a gente faz a extensão e que aconteceu agora a gente tem quatro cópias no meu alvo nas quartas estão presas e a gente repete esse processo algumas vezes e tal maneira que a gente forma isso daqui que que é isso daqui só que é chamado de cluster em um cluster de pcs tá tudo preso ali nessa nessa superfície e agora esse clã será que a gente tem cópias suficientes e o mesmo alvo aqui de tal maneira que quando a gente for gerar fluorescência a fluorescência seja forte

o suficiente por equipamento detectar e mais uma vez não se esqueçam eu mostrei um fragmento mas a sua superfície é gigantesca e tem esse processo acontecendo com vários fragmentos a biblioteca que eu gerei lá nos passos anteriores então é assim que funciona nós iremos um cluster aqui de um fragmento são várias cópias de um mesmo fragmento aqui várias cópias de um outro fragmento aqui várias cópias de outros fragmentos aqui de um outro e aí esse processo aqui vai gerar florescência lá na frente e a gente consegue detectar no longo do processo de sequenciamento o que

é o que eu vou explicar agora então a gente saiu da biblioteca fez amplificação nessa em processo chamado de pcr em ponte e agora a gente vai para reação de sequenciamento como é que funciona a reação de sequenciamento primeira coisa gente tem que fazer é eliminar as fitas que estão em um determinado sentido porque a gente vai ser conhecer a primeira e um sentido um caso da ilumina está a gente vai se conhecer a primeira e um sentido depois do outro então olhar aqui no primeiro sentido a gente elimina aquela fita né que tá aqui

como o primeiro vermelho no caso gente elimina todos os fragmentos aqui que estão conhecimento com esse primeiro vermelho e a gente vai se conhecer ar só as que estão com os primers verdes os adaptadores verdes oi de novo olhando para um o que eu vou mostrar agora está acontecendo para todos os fragmentos lá do cluster para todos os clusters da flor do céu ah então tá aqui no nosso fragmento preso e aí nós vamos fazer um processo que é muito parecido de novo compasso de extensão da pcr uma da minha polimerases que vai adicionar nucleotídeos

de maneira complementar o que tem de diferente tem diferentes são os nucleotídeos que estão coloridinhas que já já devem saber o porquê né porque esses nucleotídeos aqui eles estão marcados com fluorocromos eles estão marcados com fluorocromos além deles estarem marcados com fluorocromos eles são bloqueados ou seja toda vez que não tenho tido não importa qual ele é incorporado pela dna polimerase a reação para como foi que eu tô falando aqui mas então para isso que eu tinha sair na reação dna polimerase se ligou aqui na extremidade vai começar a acionar nucleotídeos de maneira complementar e

eu não sei que sequência que eu tenho aqui os nucleotídeos a as adelina estão marcados com fluorocromos azul as agonias com floral fundo verde as de minas com flor off vermelho e a citosina com amarelo e quando dna polimerase em corporal nucleotídeo aqui ela incorporou aqui no caso uma guanina encontrou uma menina que que vai acontecer essa flor essência do nucleotide vai ser citada a esse a fluorescência que vai para o meio captadas pelo equipamento e o equipamento vai detectar que cor que é no caso aqui era uma flor essência verde tão sério uma flor

essência verde que foi detectada eu sei que uma menina foi adicionada se uma agulha na foi adicionada eu sei que o nucleotídeo da minha fita molde era uma citosina então a gente começou o processo de sequenciamento agora acionamos uma acionamos um nucleotídeo que gerou fluorescência verde portanto era uma agonia na portanto a minha fita morte tinha uma citosina o que acontece e esse bloqueio e essa marcação desse nucleotídeo bonina lição eliminados eles são eliminados então agora essa agonia ela passa a ser funcional de novo e não tem inflorescência mais o que permite que a dna

polimerase continue adicionando nucleotídeos aqui e agora ela adicionou uma timina gerou uma fluorescência vermelha portanto eu sei que é uma timina e eu repito esse processo elimino essa florescência esse bloqueio e aí ó vou adicionando os próximos o que eu tinha diz que vão passar por esse espaço exatamente esses passos até que toda a fita seja sequenciada então no final desse processo eu fiz uma cópia complementar do meu molde aqui ao longo da ciência dessa nova fita fluorescência foi sendo gerada pouco a pouco equipamento foi captando toda vez que uma flor essência foi gerado agora

dá para repetir esse processo no outro sentido eu não vou mostrar e no outro sentido porque exatamente a mesma coisa e eu não quero carregar muito de informação na aula de hoje porque não é um tema é simples tá mas saibam que foi assim é assim que funciona o sequenciamento utilizando ilumina mais uma vez lembrando que aquilo lá aconteceu aquele processo de sequenciamento aquela extensão lá com os flor opus com os nucleotídeos marcados com flor opus é ela aconteceu em todos os fragmentos do meu câncer em todos os clusters tubo ao mesmo tempo tanto que

acontecia a gente olhasse mais ou menos aquela aquela superfície aquela fosse a de cima nos veremos isso aqui ó esse clã ser aqui lá no primeiro ciclo gerando fluorescência azul esse outro aqui gerando fluorescência vejo outro vermelho e outro amarelo a elimina a fluorescência libera o bloqueio da do nucleotídeo e aí a dna polimerase incorpora a outra outro nucleotídeos gerou fluorescência verde agora o vermelho amarelo azul e aí fica esse jogo de cores aqui a cada vez que eu no que eu tinha incorporado e o equipamento ele vai guardando esse informação tô aqui monte de

plantas ter que tá sendo sequenciado que tá passando por esse processo aqui um monte um monte de são milhões mesmo estão acontecendo isso você tá acontecendo em milhões de câncer todos ao mesmo tempo o equipamento tá guardando informação de fluorescência que está sendo gerada pipoca azul amarelo vermelho cada um daqueles que se aquela informação vai ser armazenada e o computador do equipamento ou o servidor associado a esse equipamento que tem que ser um servidor poderoso ele vai é processando essa informação e fazendo a chamada de base ele vai fazer na chamada de base então para

cada fragmento de informar que a t c g c naquele era cga tenta depois de informação não vai ser processado por me informar que a gente consegue ler fragmentos grandes o que não vem ao caso hoje mas eu queria que você entendesse que funciona dessa e para a thermo-fisher a parte de notificação muda é igual nós vamos fazer uma pcr a gente quer que todo produto dessa pessoa fique unido para gerar um sinal forte suficiente para máquina detectar a diferença é que aqui o sinal é uma variação de ph não é uma flor essência não

é geração inflorescência é variação de ph e vocês vão ver como é que funciona tá e o processo da pcr também diferente não é uma pessoa ruim ponte não utiliza não tem nada a ver com aquilo que eu te mostrei mas é uma amplificação que mantém todos os produtos daquele daquela amplificação de um tinha ali para gerar um sinal forte no caso até meu fischer se utiliza a pcr em emulsão então aqui de fátima é pcr só que vc é uma pessoa que acontece um pouquinho de uma placa ou no pocinho ou no seu tubinho

ela acontece dentro de uma micela é uma solução uma solução com todos os ingredientes da pcr uma bolha azinha os ingredientes da pcr em volta dessa bolha tem óleo estou imagine que em vez de você ter uma placa você tem uma solução com óleo e dentro desse óleo tem micelas bolhas com reagentes de pc e vai acontecer uma reação de pcr em cada uma dessas bolhas em cada uma dessas bolhas mas em várias dessas bolhas em várias essas micelas então ali dentro desse óleo e vão produzir produtos de pcr é isso que eu tô mostrando

aqui ó então imagina que eu tenho esse tubo nesse tubo eu tenho óleo que é o que está aqui em branco e volta e as bolhas as micelas aqui como se fossem tubos de pcr cada mês ela desce aqui como se fosse um tubo e tem milhões essas micelas ali dentro o que que acontece em cada uma delas em cada micela que é povoada nós vamos pegar o produto da biblioteca que a gente acabou de criar então volta aqui a gente voltou lá atrás da gente até agora da ilumina a gente fez tudo passo completo

até o sequenciamento não e a gente só com a melhor teka agora a gente vai amplificar e então já tá colocando o produto da nossa biblioteca aqui com os adaptadores com os barcos a tudo aqui a gente vai colocar o produto da nossa biblioteca aqui e a ideia é tentar colocar somente um fragmento aqui é um só um fragmento por miss ela tem um monte de miss ela mas eu quero colocar somente um fragmento por mês ela vai ter missão lá que tem mais um fragmento tem tem um monte de inicial de cá vazia tem

mais aqui a gente vai utilizar para gerar dados para sequenciar são as micelas que tem só um fragmento da minha biblioteca então essa miss ela aqui ó ela tem um fragmento da biblioteca essa micela que tem um outro fragmento da sua biblioteca essa mistura que tem um outro fragmento na minha biblioteca e o que vou mostrar nem tudo essa miss ela aqui nessa grandona é o que tá acontecendo em todas elas ao mesmo tempo oi e a quem vai fazer pés é aquele vai fazer pensa que tem dna polimerase tem primeira opção complementar complementares aos

extremos o meu fragmentos adaptadores e a gente vai fazer várias e várias cópias do fragmento o álcool e o que tem diferente tem isso aqui essa molinha aqui é uma mídia uma esfera nessa esfera nós temos primers um dos primers complementares a um dos adaptadores estão presos são todos a expressão dele que tem alguns aqui que estão solução os primeiros referente a esse adaptador de solução os primos referência adaptadores solução também mais uma boa parte deles tá preso nessa esfera tá preso nessa bolinha aqui tem uma pessoa ela vai acontecer alguns vários fragmentos vão ficar

presos nessa esperem aqui mais ou menos parecido com o cluster lá no caso da ilumina né que a gente fez a pcr ponte tirou vários fragmentos eles ficaram presos naquela naquele câncer em um próximo do outro aqui é mesmo ideia só que não vai ficar em clãs de dentro vai ficar nessa bolinha aqui então vai ficar um negócio mais ou menos assim né imagina que tá bolinha e um monte de dna várias cópias várias e várias cópias de um mesmo fragmento povoando aqui a superfície dessa bolinha só para você saber a gente tira aquela bolinha

que tá no óleo tira o óleo dali de dentro é seleciona as bolinhas que tem os fragmentos que podem ser sequenciadas aí segue para parte do sequenciamento que ela que eu vou mostrar daqui a pouco lembrando então de novo eu mostrei um processo que acontece em uma micela que vai fazer uma pessoa que vai povoar essa esfera e isso tá acontecendo em várias micelas ao mesmo tempo seja várias bolinhas várias esferas serão povoadas por várias cópias cada um cada cada bolinha com seu fragmento específico cada bolinha com um fragmento da biblioteca e aí que eu

faço eu pego essa bolinha e coloca um chip aí no caso da iluminar grande parte dos equipamentos para vários equipamentos é a a fonte e o sequenciamento acontece tudo no mesmo ambiente no caso da terra e vai pegar essas bolinhas as esferas que a tem as cópias o meu alvo tirar da onde elas estão e colocaram um chip esse chip ele tem vários pocinhos necropos mais ou menos com a plaquinha de pc só que uma plaquinha de pessoa que tem 96 poços e esse chip aqui ele tem aí de 2 milhões a mais de 11

milhões e dependendo o chip tem mais com mais 15 inclusive então imagina uma plaquinha de pcr só que ficou 11 milhões de pós a ideia desse chip e aqui a gente vai fazer a gente vai colocar as bolinhas ali e só cabe uma bolinha propôs então vocês estão vendo aqui um monte de pocinho a gente vai colocar uma bolinha para o postinho não cabe não entrou duas ali dentro só uma pocinho e a reação de sequenciamento vai acontecer em cada um desses pocinhos individualmente a gente vai olhar para dentro de um dos passinhos a gente

vai olhar para dentro de um dos focinhos em tudo o que eu vou mostrar agora eu vou mostrar em um fragmento e sem todos os fragmentos dessa esfera aqui em todos os passinhos do chip e entramos então na parte de sequenciamento da termopro ficha mais uma vez mais uma vez o processo de sequenciamento ele é muito semelhante a extensão da pcr ao passo da extensão da pcr então nós temos um dna molde um template que eu não sei aqui meu caso eu tô mostrando a sequência para vocês entenderem vai funcionar seu conhecimento mas é isso

que eu quero descobrir na vida real eu tenho um primo que vai se ligar extremidade que no caso a extremidade justamente um adaptador que a gente colocou lá na construção de biblioteca uma dna polimerase que vai funcionar nucleotídeo e nucleosídeo livre para ser incorporado qual é a diferença a diferença é que uma pcr a gente tem os quatro nucleotídeos níveis para dna polimerase e incorporando formando as novas fiz a tcg tá tudo ali disponível para lá colocar aqui no caso não há que a gente vai disponibilizar um nucleotídeo por vez o equipamento ele tem a

capacidade de pegar um que eu tigio jogar e na reação colocar dentro aqueles pocinhos e tirar isso no que eu tive depois ele pega colocar o e a reação acontece é mentira ele lava aquele colocou outra ele vai intercalando a tirar o rg tira g conhecer tira se ele vai fazendo isso aqui no primeiro no meu exemplo o primeiro nucleotídeo que a gente colocou que o equipamento disponibilizou aqui para essa reação para esse chip para todos os passinhos esse chip foi uma guanina a minha fita tem leite que eu tô se conhecendo o primeiro nucleotídeo

que eu tenho aqui para ser incorporado de maneira complementar é uma menina então guanina nem a colina se a máquina o equipamento disponibilizou a nena aqui para mim a reação essa guanina vai se ligar no meu alvo não vai não vai dormir não lembro que estão que é que para a gente vai fazer agora tirar essa agonia e vai colocar o próximo que eu tinha aqui em casa uma adelina adelina entrou ela vai se ligar aqui a dna polimerase consegue incorporar uma menina aqui não consegue acontece nada saia de nina entra divina ele é a

polimerase consegue adicionar time eu também não tô não acontece nada aqui site minas e eventualmente algum momento a citosina vai ser disponibilizada quando a citosina for disponibilizada a dna polimerase vai incorporar nucleotídeo e aqui está o pulo do gato o que acontece toda vez que um nucleotídeo é incorporado por uma dna polimerase isso na pcr a criança reação a casa ele mentalmente o que acontece toda vez que um nucleotídeo é incorporado por uma dna polimerase tem a liberação de pirofosfato é porque o ntp tem esse p no final que justamente pelo grupo fosfato então tem

duas duas dois átomos a mais de fosfato aqui de fósforo e ele vai ser retirado para tirar pelo fosfato além da liberação de pirofosfato nós temos a liberação de uma molécula de hidrogénio que tá aqui nesse hora h e a molécula de hidrogénio ela vai ser liberada ela vai para a solução então ele vai gerar a liberação de um ainda mais quando a gente libera em 1h mais numa solução o que acontece que eu solução que acontece com ph dessa solução ele cai e o que é que cada por cima do chip faz ele detecta

variação de ph é como se cada um daqueles 11 milhões de pocinhos do chip que eu falei para vocês é como se cada um deles fosse um micro peagâmetro detectando variação minúscula de ph então toda vez que um nucleotídeo é incorporado tem a liberação de íons h + a solução quando isso acontece tem a variação do ph quando tem a variação do ph o equipamento detecta o pocinho detecta aquela variação então olha só se eu não sei qual sequência tá sendo sequenciada mas se a máquina disponibilizou uma adenina na que oi para todos os passinhos

aquele chip a disponibilizou uma adenina e teve um pouquinho ali que teve variação de ph quer dizer que aquela dele não foi incorporada se for encorporada quer dizer que tinha uma menina então a gente começou a fazer o processo de sequenciamento agora detectando variação de ph e sabendo que nucleotídeo foi disponibilizado então a primeira base a gente já sabe aí esse processo vai se repetir de novo no caso de novo amazonina né seguida aqui da guanina era uma outra menina então o gol g ah ah não aconteceu nada hoje não condicionada à condicionada te não

acontece nada a hora que chegar uma citosina acontece uma incorporação a liberação de pirofosfato que não interessa a liberação de manga mais liberou e o mangá mais caiu pegar equipamento detectar avaliação que não que eu tive foi liberado lá citosina então na minha fita tem uma agonia ah e assim vai até a gente completar todo o sequenciamento dessa fita aqui até que toda essa fita seja estendida ao longo desse processo certo mais uma vez lembrando eu mostrei um fragmento está com seu em todos os fragmentos da espera e está acontecendo em todas as esferas que

estão nos milhões de pocinhos uship tão de também assim como no caso da iluminação computador outra poderoso capitando informação lá no ilumina captava fluorescência diferentes cores aqui tá capitando variação de ph e liberação de nucleotídeo oi e aí a gente entra análise dos dados que não vou falar nada sobre isso com vocês hoje porque é muita coisa é super complexo mas só para vocês saberem é tão ter uma ideia aqui esse esse daí é tudo tá fragmentado né tá tudo quebrado a gente pega uma molécula de dna a primeira coisa que foi fez foi quebrar

a gente primeira coisa vai ter que fazer juntar de novo e tem duas maneiras de juntar se você tiver uma sequência como referência aí você pode fazer como se fosse mais ou menos uma uma pcr numa pessoa é mais uma realização digital né aconteça com jesus tem um fragmento 200 pares de bases aonde aquele seu fragmento 200 200 pares de bases se a nela na sua referência você tiver um genoma sequenciado por exemplo se eu marcar um banco de dados com essa informação e você consegue e juntando esses fragmentos de novo mas se você não

tivesse a referência aí o negócio complica um pouco mais aí um fragmento tem que saber por o outro é um outro negócio você vai juntando formando a informação até consegue sequenciar a partir do zero mas dá para sequenciar bom só para vocês terem uma noção a primeira coisa que faz lá na análise dos dados é remontar na primeira tá essa é uma das primeiras é remontar tudo aquele fragmento que a gente gerou todo aquele dna zão que era o que a gente queria saber de fato e quebrou agora a gente remonta ele de alguma maneira

geralmente é por alinhamento em uma sequência de referência aí depois tem um monte de outras coisas aí tem que fazer no meio do caminho mas não vamos falar de suas e o que dá para fazer consequência de nova geração cada vez mais coisa porque está ficando cada vez mais barato a variação de tributo ou seja o quanto você pode ser conhecer tá mudando também você pode ser começar pouca coisa e pode ser conhecer muita coisa que eu tenho de várias aplicações que migraram de outras técnicas para ngs quem foi prejudicado com isso me criei técnico

de micro e muitas coisas fazer para o lado daí para cá e sangra também e algumas coisas de que apesar tão vindo também então assim nós a mudança aliás sobre o volta sem postar essa mudança porque tudo muito novo tecnologia saindo o tempo inteiro e nada tá parado na trabalhar mas qualquer maneira que dá para fazer genotipagem dia que eu te página é descobrir o genótipo você tá se conhecendo você consegue descobrir genótipo tô indo aí fazer o que você consegue fazer daí na infinidade de coisas identificação humana eu não falei disso ainda só é

só mencionei no começo da aula né da semana do comércio por aqui mas da edificação ou você faz por eletroforese capilar' em análise fragmento ou você vai fazer por aqui por mgs análise de meta genoma aliás a gente pode falar de umas quando se fala de emergência né dá sequência muita coisa ao mesmo tempo então você conhece ar começa genoma por exemplo você quer uma amostra ambiental que é muito difícil você ter uma uma visão geral do que tá acontecendo na nossa ambiental seja a água você passa uma piscina ou uma amostra de solo ou

o filtro de ar condicionado tudo técnicas mais antigas é difícil você tem uma a tal da população microbiana que tá a presente animais com a gs é possível fazer isso não se consegue fazer análise de metagenoma por exemplo isso pode ir serve para microbiota intestinal também mesmo a ideia muito parecida detecção de mutação tá sendo muito utilizado para estudo estudo não só estudo mais mercado aplicável com câncer também porque detectar mutação somática às vezes é difícil porque ele fez porque como ela é uma mutação somática não germinativa muitas vezes ela é extremamente rara e como

ela é muito rara ela pode ser muito rara pode ser difícil para gente conseguir detectar em outras técnicas talvez ver-se-á em tempo real por exemplo não seja sensível o suficiente para detectar uma mutação extremamente rara ou qualquer outra vez extremamente raro a mesma coisa para sangue só que aqui como outro a quantidade de dados ela pode ser muito grande a gente pode controlar a quantidade de dados que é gerado a gente consegue aumentar bastante a sensibilidade e é de um teste por exemplo que é detectar uma mutação somática fazer isso para várias células ou fazer

isso para várias possíveis mutações e determinar qual tipo de terapia que um paciente com câncer vai vai ter melhor resposta e assim vai análise expressão gênica também foi uma das áreas bastante positivamente impactado por mgs porque além de você conseguir fazer análise de transcriptoma completo ou seja sequencial transcriptome inteiro você consegue se conhecer a gênesis individualmente fazer uma análise pressão gênica é esse semelhante a pcr em tempo real plano é detecção de aneuploidia estão interessante para quem trabalha no mercado e saúde reprodutiva estou fazer análise de embrião antes da implantação por exemplo é um exemplo

e aí você detecta aneuploidia e não implanta aquele embrião defeituoso né você conhecimento de novo que é sequenciar pela primeira vez um fragmento ou eu não tenho uma referência sequenciamento de exoma que é sequencial e consome inteiro de uma pessoa sem interessantíssimo onde se trabalha com uma doença hereditária mudou e sua genética que ainda não é bem caracterizada como se conhece exatamente como funciona aquela doença para vocês e conhecer a cultura inteiro para tentar encontrar alguma coisa que seja diferente naquela pessoa com aquela síndrome com aquela doença em relação a outras pessoas e aí vai

aí tem um monte de coisa para fazer também pensando então que é sequenciamento e em larga escala tão aplicações muito mais do que eu tô colocando aqui tá que são alguns exemplos finalizamos então a parte de sequenciamento de nova geração e vamos para a próxima técnica é