Olá seja muito bem-vindo ao universo da biologia molecular eu sou Eduardo castan e na aula de hoje vou falar para você quais são e para que serve cada um dos principais componentes dos principais reagentes utilizados no processo de extração de DNA e RNA de ácido nucléico de um modo geral hoje você vai entender para que que serve aí as soluções Salinas para que que serve o etanol o isopropanol Para que serve o edta o te água enfim você vai entender Para que serve cada um desses componentes que você Muito provavelmente utiliza a no seu processo
de extração só que é depois da [Música] [Aplausos] [Música] [Aplausos] [Música] [Aplausos] [Música] [Aplausos] vinheta muito bem vamos começar a nossa aula de hoje mas eu tenho dois recados para você antes da gente começar o primeiro recado é o seguinte para você e entender essa aula aqui você não precisa ter nenhum grande conceito aí na cabeça mas seria legal se você soubesse como é que funciona como é que é o processo de extração de DNA RNA eu vou deixar uma aula aqui em cima para você que você pode assistir onde eu falo sobre e o
o básico né os mecanismos básicos utilizados nas diferentes estratégias aí de extração de DNA e RNA tá bom Então assiste essa aula você pode assistir essa aula aqui direto você vai conseguir entender mas depois se você quiser se aprofundar um pouco mais assiste essa aula de cima aqui que eu tô deixando que você vai se aprofundar mais vai entender vai pegar melhor dessas informações e o segundo recado Tá relacionado com o universo da biologia molecular se você ainda não segue universo biomall lá no Instagram vai lá no @universo bioball no Instagram porque tem um perfil
ali e o conteúdo é mais direto ao ponto a gente vai lá no Tet a Tet você pode mandar perguntas para mim lá nas caixinhas de perguntas e respostas vou responder para você e você vai ter uma informação mais direta ao ponto também Além disso você pode se cadastrar no site universo bmol www. univers bmol com deixar seu e-mail ali só vai deixar seu e-mail que de tempos em tempos eu vou te informar quando uma nova aula vai pro ar quando tem algum evento Quando vai ter o lançamento de algum curso eu informo você por
lá sem um estresse sem spam sem encheção de saco eu mando um pouquinho e-mail um e-mail por semana Geralmente só que eu não tenho alguns eventos aí durante a semana que eu mando um pouquinho mais Mas no geral é um e-mail por semana Beleza então vamos começar eu vou falar aqui para vocês desses principais componentes os principais reagentes utilizados na extração de DNA de RNA também mas antes a gente começar vamos só dar uma organizada aqui no raciocínio porque quase que quase que independente do método de extração que você utiliza se você vai fazer uma
extração eh por fenol cloroformo se você vai fazer uma extração mais suja se você vai fazer uma extração aí por coluna se você vai fazer uma extração por bid magnética no geral no geral você vai ficar você vai passar por esses três espaços que eu vou falar agora né Toda extração DNA ou RNA Muito provavelmente você vai ter o passo de lise que é o momento do protocolo que é extração em si né quando a gente fala de extração de DNA na verdade tá falando muitas vezes extração e Purificação o passo de Lise é a
extração em si aquele momento que você pega o seu ácido nucléico que tá dentro da célula e você tira ele de dentro da célula e você expõe os seus ácidos nucleicos aí pros outros componentes pros outros ingredientes reagentes da extração né esse é o passo de Lise é a extração em si então o primeiro passo é a Lise a extração do DNA ou do RNA o segundo passo geralmente é um passo já relacionado à Purificação é aquele momento que você vai pegar esse acid nucléico que já está fora da célula nesse momento mas ali misturado
com debris celulares outros reagentes outros componentes químicos Você vai isolar vai fazer a purificação propriamente dita Então esse é o segundo passo é o isolamento ou a purificação e o terceiro passo é quando você recupera esse ácido nucleico que nesse processo o seu ácido nucleico ele vai Possivelmente tá associado a uma matriz associado a uma bid magnética ou ele vai estar precipitado na sua solução você precisa recuperar esse ácido nucléico o terceiro passo é a ressuspensão ou a eluição desse Ácido nucléico é aquele momento que você coloca você submete ao seu ácido nucleico uma determinada
solução que é a solução onde ele vai ficar armazenado Muito provavelmente ou vai ser utilizado aí nas próximas eh os próximos passos aí do seu protocolo da do seu teste do seu experimento então a extração em si que é a lí da membrana celular extrai o ácido nucléico primeiro passo segundo passo passo é a purificação é o isolamento do seu ácido nucleico a purificação dele você separa ele dos outros componentes e o terceiro passo é quando você recupera esse seu ácido nucléico por eluição ou por ressuspensão Então são esses três passos agora eu vou falar
para você os principais componentes os principais reagentes que a gente utiliza nesses três processos em cada um deles eu vou começar falando dos principais tá aqui não dá para falar de todos porque tem muita variação de protocolo tem protocolo que você vai e utilizar reag muito específicos dependendo da Matriz da fonte de amostra né então não vale a pena a gente pegar em detalhe cada um dos protocolos aqui cada um das variações da extração de DNA RNA Então vou pegar o geralzão para você ter um raciocínio racional sobre eles e você entender lá no momento
que você tiver fazendo a extração o que tá acontecendo em cada um desses Passos em cada um desses momentos específicos do seu processo de extração e você não vai no escuro porque se você não tem esse tipo de informação que você tá fazendo ali simplesmente seguindo um protocolo né misturando aguinhas ali mistrando soluções sem saber o que tá fazendo então você a partir de agora vai saber o que vai acontecer em cada um desses passos e para que serve cada um desses componentes Vamos começar com a extração em si o momento de lise nesse primeiro
passo já que o objetivo é extrair o ácido nucleico né expor o ácido nucleico a aos outros componentes aos outros reagentes você vai fazer a Lise a disrupção a destruição da membrana celular para expor o seu ácido nucleico então geralmente você faz isso utilizando usando um detergente né muitas vezes esse processo de Lis ele acontece na presença do detergente e muitas vezes esse Detergente é o SDS ou dodecil sulfato de sódio que é um detergente já que a membrana celular ela formada por lipoproteínas você consegue desestabilizar a membrana lipídica na presença de um detergente do
SDS muitas vezes então você desestabilizando essa membrana favorece a sua alise a sua quebra para expor expor o ácido núcleo veícul um outro componente que é muito utilizado nesse nessa primeira etapa na etapa de Lis de extração é uma solução Salina quando você eh trabalha com uma solução em certa concentração de sal você favorece essa quebra também além de estabilizar estabilizar o seu ácido nucléico DNA RNA esse o fato de você estabilizar o DNA RNA vai favorecer a sua extração e de lá e lá na frente a sua Purificação a sua recuperação então uma solução
Salina também é muito utilizado nesse primeiro passo muitas vezes na grande maioria das vezes hoje com os kits né esses dois componentes né tanto o detergente como o sal eles estão já misturados numa já vem né num kit ele já vem ele já eles já vem numa concentração adequada numa formulação adequada que geralmente é chamado de solução de lce é a empresa vende isso para você como a solução de lce que nada mais é do que uma solução Salina na presença de detergente at vez tem outros componentes aí no meio mas basicamente é isso ainda
na etapa de lise muitas vezes são utilizados outros componentes não são obrigatórios Mas eles são e amplamente utilizados que são as enzimas digestivas um exemplo de enzima muito utilizado é a proteínas k proteína as k é uma enzima que faz a digestão de proteína isso é importante por quê para favorecer a quebra né da membrana celular fazer inibição digestão de enzimas de proteínas que podem interferir lá nos outros nos outros Paços lá na frente né no seu protocolo é interessante que você não tenha na grande maioria dos casos proteínas lá nos outros Passos não só
nos outros Passos como PCR PCR em tempo real sequenciamento mas ali no final da extração mesmo na hora que você vai armazenar que você não quer que tenha proteínas ali no meio como as nucleases que podem digerir o seu ácido nucléico enquanto ele tá sendo armazenado né Então as a proteinase k entre outras funções ela tem essas daí né favorecer a quebra da membrana celular e inibir as enzimas que não te interessam lá em outros processos ou mesmo no armazenamento da sua amostra mas não é só a proteína asz k que você utiliza nesse processo
você pode não é obrigatório Mas você pode utilizar por exemplo uma rnas se você tem como objetivo extrair DNA é interessante que você não tenha contaminação desse DNA com rnas com com RNA então você pode utilizar uma rnas para degradar para digerir RNA contaminante n nesse processo e o contrário é verdadeiro se você tá trabalhando com RNA você não vai querer a presença de DNA na sua amostra você pode utilizar uma dnas que pode ser utilizada nesse processo nesse momento aí do protocolo ou em outros momentos lá na frente até depois da extração dá para
fazer dependendo da das condições nessas duas configurações Então dentro da fase de L já na fase de extração no passo de extração em si nós temos aí detergente solução Salina e as enzimas digestivas aí a gente vai pro segundo passo que é o passo da Purificação no Passo da Purificação isso vai variar de protocolo é geralmente espaço que diferencia um protocolo do outro então quem trabalha com fenol cloroformo quem trabalha com e bid magnética com eh Coluninha É nesse momento que diferencia basicamente um protocolo do outro tá é no momento da Purificação mas aqui no
passo de purificação Você pode ter n geralmente você tem álcool que geralmente é etanol ou isopropanol e altíssima concentração numa concentração ali muito próximo de 100% tá então isopropanol ou anol Por que que você utiliza o isopropanol ou etanol nesse passo de purificação porque quando você extraiu o ácido nucleico ali de dentro da célula ele está em solução ele tá misturado com outras coisas ali ele tá misturado com a própria solução com o detergente os outros componentes que você utilizou com a com as próprias enzimas e proteínas presentes ali dentro você quer isolar você quer
separar esse componente que é o seu alvo né o DNA o RNA dos outros então o que que você faz utiliza o etanol ou isopropanol em alta concentração por quê Porque DNA e RNA não solubiliza na presença de álcool etanol isopropanol em alta concentração então se você tá nessa mistureba ali incluindo o seu ácido nucleico misturar esses ingredientes ali e Nas condições adequadas né no volume adequada na temperatura adequada talvez até na presença de uma centrífuga você consegue precipitar o seu ácido nucléico como o ácido nucléico não solubiliza na presença de álcool em alta concentração
principalmente etanol isopropanol você consegue precipitado separando ele do resto porque o resto fica em solução mas o DNA ou RNA não ele vai ser precipitado E aí a partir daí você consegue recuperar você consegue retirar por exemplo o o sobrenadante e deixar só o pellet ali se for o caso né se for essa estratégia que você tiver utilizando mas o álcool ele tem essa função muito importante nesse momento mas não é só essa função ele tem uma outra função uma segunda função que também tá relacionada essa fase né de purificação que é justamente a lavagem
daquele seu material daquele seu que você tá purificando para retirar você já já fez um processo de purificação né Já conseguiu separar o DNA RNA do resto mas com certeza nesse primeiro passo de purificação você ainda trouxe proteína você trouxe debis celulares você trouxe outros componentes que contaminam su a sua amostra você precisa fazer um processo de lavagem o etanol aí nesse caso geralmente é utilizado um etanol numa concentração um pouco menor geralmente 70% ali 65 70 75% você utiliza o etanol para lavar aquele seu ácido nucléico por que 70% porque que um álcool é
70% etanol 70% Você ainda tá com uma concentração muito alta você não solubiliza aquela sua amra que você ainda não quer solubilizar você quer mantê-la isolado da da de todo o resto né dos outros componentes da sua extração você ainda não solubiliza e você consegue lavar consegue retirar outros componentes outros contaminantes que estão presentes ali então o etanol nesse processo nesse momento ele tem essa segunda função também o que acontece em diversos kits comerciais que a gente tem hoje né esse etanol 70% ele pode ser chamado de solução de lavagem que basicamente etanol talvez tem
algum outro componente ali uma um sal uma determinada concentração para ajudar mas você tá falando da solução de lavagem que é basicamente etanol é por isso que muitas vezes quando você compra um kit Você tem uma solução de lavagem você prepara aquela solução de lavagem adicionando a a algum outro componente aliás muitas vezes é água Ultra pura que você mistura ali que nada mais é do que a preparação desse etanol dessa solução de lavagem para fazer essa lavagem que Eu mencionei feito isso a gente vai pro último passo que é a hora que você recupera
esse DNA e esse RNA é a hora que você ruspi esse ácido nucleico Aliás a diferença de eluição e ressuspensão é a seguinte quando você rusp quer dizer que aquele ácido nucleico estava precipitado você precipitou utilizando o isopropanol o etanol absoluto então ele estava precipitado quando você ressuspender você você coloca aquele se ócio nucléico novamente em solução isso é ressuspender a eluição é parecido mas geralmente é o ácido nu clío está associado a uma matriz sólida pode ser a sua a BID magnética por exemplo pode ser a membrana de sílica que você utilizou no processo
de extração ele tá preso a essa Matriz você vai retirar vai recuperar tirar aquele acio un clío dali e colocá-lo novamente em solução nesse caso nós estamos falando de eluição mas no final das contas o objetivo é o mesmo você colocar aquele seu ácido nucleico né que está em processo de purificação novamente numa solução nesse processo você pode usar basicamente dois componentes aí ou água ultrapura você pode fazer esse processo utilizando água ultrapura você consegue recuperar ressuspender eluir o seu ácido nucleico e ele vai ficar numa solução ali em água ultrapura na concentração que você
pré-determinarão 30 a 100 microlit geralmente vai ficar próximo de 50 60 microlit mais ou menos vai manter a sua solução e o seu ócio nucleico nessa solução vantagem de trabalhar com a água Ultra pura é que a água Ultra pura ela não tem nenhum componente que vai interferir nas reações enzimáticas lá na frente uma PCR uma PCR em tempo real um sequenciamento sequenciamento de Nova Geração é você não vai ter interferência de nenhum componente ali nessas eh nessas outras reações Qual que é a desvantagem a desvantagem imem é que se você não está trabalhando com
a solução tampão você não está tamponando aquelas condições então você pode acidificar variar o PH da daquela sua solução na água que contém o seu ácido nucleico e isso causar a a degradação no longo prazo desse ácido nucleico ou eventualmente você ter um pouco de contaminação com proteína com enzimas e essa enzima pode ser uma nuclease que vem a degradar que vem a degradar se fao nucleico durante o armazenamento durante a manipulação daquela sua amostra então a vantagem água não interfere nos Passos subsequentes nas reações enzimáticas subsequentes mas aumenta a chance de degradação daquele seu
acio nucléico ao longo do tempo mas você pode utilizar também um outro componente para fazer a ilui a ressuspensão você pode trabalhar com uma solução tampão muitas vezes esse processo é uma solução tampão chamada te que é composta por Tris e edta Tris é o agente tamponante da reação da da solução propriamente dito que vai manter as condições do PH ao longo da da do armazenamento daquele seu ácido nucleico e o edta é um agente quelante de magnésio ele inibe atividade enzimática impedindo que aquele seu ácido nucléico ele degrade mesmo na presença de eh nucleases
ali naquela sua solução certo então generalmente você trabalha com te ou low te que é mas basicamente a mesma coisa só que uma concentração menor de DTA Qual que é a vantagem de trabalhar com te e low te Você trabalha com um agente tampão agente tamponante que vai manter as condições daquelas sua daquela sua solução estabilizar o PH evitando degradação e vai evitar atividade enzimática também como uma nuclease uma dnase uma rnase que eventualmente está contaminando a sua amostra a desvantagem a desvantagem que o d DTA é um quilante de Magnésio e esse componente ele
pode interferir nas reações enzimáticas lá na frente que geralmente trabalham com o magnésio como cofator o Adna polimerase por exemplo para você ter o meio do caminho aí né entre água e uma solução te você pode trabalhar com um low te que tem o Tris e o edta numa concentração um pouco menor Então nesse caso você combina a as vantagens da água né que tá trabalhando só com um te ali com uma concentração mais baixa de DTA e e de um te que é uma solução tampão uma solução estabilizadora da sua amostra Beleza então low
pode ser uma boa alternativa você vai avaliar né O que que é melhor no seu caso mas geralmente te low te são boas alternativas bom esses são os componentes principais Esses são os principais ingredientes utilizados na extração de DNA RNA eh eu falei que a gente não ia entrar em detalhes mas acho que vale a pena para em alguns casos aqui né porque são muito comumente utilizados fazer aí um puxadinho e falar quase uma exceção não Nem chega a ser uma exceção Mas eles são bastante utilizados por exemplo no caso tanto de extração de DNA
e RNA são muito utilizados dois componentes aí numa estratégia que é amplamente utilizada que é o fenol e o cloroformo o fenol e o cloroformo são dois ingredientes aí bastante utilizados eles estão relacionados tanto com o passo de lise né a fase de lise como de purificação eles são utilizados é um componente que tá é um reagente são reagentes estão aí no meio do caminho que favorecem tanto A Lise como a o processo de purificação então o fenol cloroformo são componentes orgânicos que combinados permite que você faça uma uma Lise celular aí adequada e depois
separe por centrifugação o que é DNA o que é RNA O que é proteína você consegue se parar esses três componentes ajustando o PH do fenol quando você trabalha com um fenol mais ácido você favorece a extração de RNA quando você trabalha com um fenol mais básico você favorece a extração de DNA separando DNA RNA das proteínas dos debis celulares e fazendo uma extração então o final cloroformo também é bastante utilizado existe um outro componente aí que você vai ver de vez em quando que é uma desgraça trabalhar com ele porque ele fede demais que
é o Beta mercaptoetanol esse é um componente fedorento Mas ele tem uma função muito importante ele desestabiliza a estrutura de proteína ele degrada ele denatura proteínas porque ele destrói ele desfaz as ligações de ponte de dissulfeto dessas dessas proteínas então ele é um componente importante para eh primeiro degradar né E desestabilizar essas proteínas que eventualmente são as nucleases que podem interferir lá na na degradação do seu ácido nucléico lá na frente mas não é só isso também ele é importante porque muitas vezes o DNA o RNA ele tá associado à proteína né e e você
precisa eliminar essa Associação você precisa quebrar você precisa separar o DNA da proteína para para que no processo de purificação a hora que você tá recuperando o DNA o RNA você não traga a proteína junto com com ele então o Beta mercap tem essa função também ele é fedorento é ruim de trabalhar mas ele é bastante útil bastante interessante bom acho que é isso acho que esses são os principais aí componentes ingredientes e reagentes utilizados no processo de extração você sabe quais são você sabe para que eles funcionam mas eu tenho certeza que se você
trabalha com protocolo pouco mais específico você não escutou eu falando aqui de um produto um reagente que você utiliza no seu laboratório então eu quero saber deixa aqui nos comentários eu quero saber qual é um componente que você utiliza aí no sua extração Qual é a extração que você faz Qual é o material que você extrai Qual é a fonte desse material que você tá extraindo E qual é o componente que eu não mencionei aqui que você utiliza se você souber a função dele qual é e qual é a função dele escreve aqui nos comentários
que eu quero saber e com isso a gente finaliza a aula de hoje espero que você tenha gostado a gente se vê na semana que vem tchau tchau [Aplausos] [Música] [Aplausos] [Aplausos] [Música]
