A técnica de RFLP

Olá sejam todos muito bem-vindos ao universo da biologia molecular eu sou Eduardo castanha na aula de hoje nós vamos falar sobre um tema que já me pediram aqui várias vezes faz muito tempo anos até que me pedem sobre esse tema e eu tava enrolando para fazer mas hoje vai sair vamos falar da técnica de rflp também conhecida como PCR rflp uma técnica que foi e é ainda muito utilizada no processo de genotipagem que pode ser muito útil aí para você que faz pesquisa você vai aprender tudo sobre ela depois da [Música] [Aplausos] [Música] [Aplausos] vinheta

belezinha Então vamos falar sobre a técnica de rflp também conhecida como PCR rflp você vai entender já já porqu antes da gente começar dois recadinhos aqui quero lembrar você que você pode se inscrever lá no site se cadastrar no site do universo AB Mall no www.universal.com que ali você deixa seu e-mail mais nada e vai receber sempre a informação quando uma nova aula forar aula toda semana você vai receber as informações das aulas que estão indo para o ar e quando tiver um evento alguma coisa gratuita alguma ação que te interessa o universo sa você

vai ficar sabendo por lá também e claro temos o perfil no Instagram @universo biomall segue lá porque ali o conteúdo diferente que a gente coloca aqui no YouTube é mais dinâmico mais direto ao ponto consumo rápido mais um último recadinho antes da gente começar eu quero falar sobre o clube do DNA vamos lá antes de eu começar minha aula aqui deixa eu dar meu recadinho sobre o clube do DNA o clube do DNA que é a melhor maior escola online de biologia molecular deste brasilzão de meu Deus se você quer aprender biomol você deve aprender

biomol Você já está aprendendo se você tá aqui você tá aprendendo Mas você qu dar um passo além e se aprofundar ser um profissional mais capacitado lá na frente ou atualmente mesmo profissional de Sucesso Por que não aprenda biologia molecular Esta área está deixando de ser um diferencial profissional está passando a ser um pré-requisito assim como o inglês assim como acontece com o inglês hoje em dia um profissional ele não se diferencia por falar inglês é o mínimo que ele tem que fazer biologia molecular tá passando por um processo semelhante você está deix está uma

disciplina que está deixando de ser uma opção está passando a ser um pré-requisito e você pode aprender biologia molecular lá no Clube do DNA no clube do DNA você tem vários tipos de aula aqui aula ao vivo aula gravada aula avua cursos completos ele é tipo um Netflix aí da biologia molecular tem aula para caramba ali dentro mais de tr00 mais de 400 aulas você consegue assistir aqui dentro do clube Eu já falei várias vezes sobre o clube aqui no site você consegue ver os trechos de algumas aulas consegue ver as apostilas você pode tem

um monte de coisa que que você consegue ver mas hoje eu quero mostrar para você o clube por dentro vou entrar aqui no clube eu acessei ele com a minha conta e aqui dentro é como se fosse como eu falei né o Netflix da biomall você tem aula para caramba curso muito curso para assistir você escolhe o que você quer assistir na hora que você quiser no ritmo que você quiser pode baixar as aulas para você não gastar seu plano de dados e usar na academia lavando louça como você quiser certo Então olha só aqui

eu estou dentro do clube ele tá mostrando para mim eh a onde eu Teoricamente teria parado o meu curso né eu teria parado aqui nessa nessa aula de PCR em tempo real é uma aula que tá dentro do curso que é um curso teórico e prático de PCR em tempo real é prático porque eu fui lá no laboratório e gravei pus a mão na massa gravei no laboratório como se faz PCR em tempo real você pode assistir na teoria e na prática Mas aqui tem todos os outros os outros conteúdos os novos conteúdos que eu

tô colocando que nesse momento nós estamos subindo as aulas eh dos de um curso novo que é um curso sobre sequenciamento sanger já tem algumas aulas lá no ar tem aqui as boas-vindas ao clube nós temos aqui a introdução ao sequenciamento sanger né que é o curso que que eu falei que a gente tá gravando agora lá tem a formação básica em biomall tem as aulas sobre as técnicas tem as aulas sobre aplicações tem aula sobre software se você quiser aprender na prática utilizar os softwares de biomall tem aula para caramba tem séries a masterclass

temas não relacionados a biomall inclusive né diretamente relacionado tem as aulas semanais aqui a vusa curso de expressão gênica tem o curso de PCR em tempo real que eu falei para vocês o de crisper que mais o curso de ngs como estudar fora do Brasil curso sobre genética básica tem curso aqui é o guia prático para você desenhar emide PCR em tempo real esse é um curso muito interessante sobre os mercados de atuação que você pode atuar na área de biologia molecular como fazer apresentação apresentações incríveis no PowerPoint tem o curso aqui de genética forens

tem muita muita coisa aqui e você pode aproveitar isso por um preço muito pequeno a mensalidade custa menos do que um dogão com coca-cola que você gasta aí todo final de semana você paga isso por mês vai ter acesso a todos esses conteúdos aí ser um profissional mais capacitado um profissional com melhor formação Então eu queria dar essa dica para vocês hoje D esse recadinho vamos voltar pra nossa aula muito bem Dad os recadinhos vamos falar aqui sobre nossa aula ó para você entender bem Como funciona essa técnica você precisa de três conceitos iniciais aqui

você precisa saber sobre PCR você precisa saber sobre enzimas de restrição e sobre letter forese esses três temas nós temos aulas aqui no canal algumas eras a PCR eletrofor tem aula teórica e tem teórica e prática também então se o seu objetivo é entender aí profundamente como funciona a técnica de rflp assista essas três aulas aqui antes de você assistir essa Porém para te ajudar eu estou aqui para te ajudar eu vou fazer um resuminho sobre cada uma delas aqui nessa aula vou fazer um resumo rápido sobre a PCR sobre enzima de restrição sobre eletroforese

para te ajudar mais ainda vai que você já entende PCR mas não entende enzima de restrição ou entende eletroforese não entende PCR eu vou fazer o seguinte aqui na descrição do vídeo eu vou deixar ali marcado o tempo de quando começa cada um desses temas Então você vai ver Em que momento desse vídeo começa a parte de PCR que momento começa a parte em cima de restrição que momento começa eletroforese aí você pode escolher se você quer assistir os três ou só duis delas ou não assistir nenhuma e direto pra parte de rflp vai est

descrito aqui embaixo agora se você quiser saber em detalhes como é que funciona cada uma delas eu vou deixar as aulas o link das aulas aqui em cima para você assistir tá na íntegra Mas vamos lá nós temos aqui a nossa agenda como sempre dividida em quatro partes vamos falar das dessas três técnicas para finalmente falar sobre rflp tem que saber sobre essas três aqui para falar de rflp uma introdução rápida antes que você pule aí paraas próximas aulas se você quiser pular vê essa introdução aqui aí depois você pula para pras outras aulas pras

partes que te interessam Tá bom uma introdução rápida aqui ó R Felipe é uma sigla né que significa isso aqui ó restriction fragment length polymorph ou polimorfismo do tamanho do fragmento de restrição esse nome assim como acontece muitas vezes na biologia molecular né ele é horroroso mas ele é informativo é tipo crisper L são nomes são siglas horríveis n principalmente em vi inglês mas elas são muito informativas só de entender o que significa a sigla você já entende boa parte do que significa o essa técnica Então olha só nessa técnica Aqui nós temos um fragmento

DNA um fragmento alvo que nos interessa que nos traz algum tipo de informação esse fragmento quando ele é submetido a uma restrição quando ele é submetido a uma atividade enzimática que vai cortar ele no meio né uma atividade de uma enzima de restrição é uma atividade enzimática é uma nuclease que vai cortar esse fragmento no meio esse fragmento ao ser cortado ele vai gerar eh fragmentos de tamanhos diferentes fragmentos que tem diferentes formas e essas diferentes formas elas nos trazem informações que nos interessa de alguma maneira tem alguma informação funcional a partir do momento que

você pega um fragmento corta ele no meio e gera pedaços de tamanhos diferentes né vocês vão ver a gente vai usar um exemplo aqui muito prático de de como a gente pode utilizar essa técnica para obter uma informação funcional aí de algumas pessoas né um exemplo aqui então o nome ele é muito feio mas é bastante informativo que que dá para fazer com isso aqui só pra gente antes de começar a explicação o que que dá para fazer com com essa técnica dá para fazer um monte de coisa porque essa é uma técnica de genotipagem

de identificação de um genótipo é um genótipo que nos traz informação funcional você vê aqui no nosso exemplo que nós vamos falar sobre a identificação de pessoas que são mais sensíveis ou menos sensíveis a cafeína é uma informação funcional que você consegue obter a partir de uma análise de um genótipo a técnica de rflp é nada mais do que isso uma técnica que faz genotipagem e identifica um genótipo quando você identifica um genótipo tipo dá para fazer muita coisa com isso então dá para trabalhar com genética de populações identificação de mutação estudo de parentesco estudo

de associação genética filogenia análise de ogm estudos forenses diagnóstico de doença feita tem um monte de coisa que a partir de um processo de genotipagem identificação de genal você tem a você consegue uma aplicação consegue obter uma informação funcional uma informação que seja útil aí de alguma maneira certo então dá para fazer esse monte de coisa aí com rflp Seguindo aqui ó eu falei para você que para você para entender essa técnica você precisava entender aquelas outras três antes por quê Porque a RP ela nada mais é do que a combinação dessas três técnicas da

PCR da de uma de um tratamento do fragmento gerado aqui na PCR com uma enzima de restrição tratamento com uma nuclease seguida de uma análise por eletroforese então a combinação desses três métodos que a gente dessas três técnicas não permite nos permitem fazer rflp e e às vezes né Às vezes a gente fala só rflp às vezes fala PCR rflp é que dá para fazer a rflp sem o apcr antes dá para você pegar extrair o DNA de um indivíduo e jogar aqui direto na enzima de restrição depois aná eletroforese para fazer a detecção ali

dos fragmentos picotados mas o PCR ajuda demais não tem por fazer esse processo aqui na salva algumas exceções sem uma PCR antes então geralmente a rflp ela tá associada a PCR nessa ordem né primeiro faz o PCR depois o tratamento com enzima de restrição depois el foresta Então vamos seguir essa ordem aqui para vocês entenderem como funciona a técnica de rflp começando com PCR Lembrando que você pode pular essas partes introdutórias né sobre as técnicas que você já conhece se você sabe que é PCR pula e não precisa eh não precisa assistir mas aqui rapidamente

para quem tá querendo aproveitar esse vídeo como um todo a técnica de PCR é uma técnica que nos permite fazer cópias de um fragmento de DNA alvo você tem um fragmento alvo de DNA ele te interessa por alguma rão razão que você precisa para poder fazer as suas análises posteriores aqui no caso rflp fazer várias e várias e várias copas daquele seu fragmento alvo E aí fazer suas análises fazer as suas detecções então a PCR faz isso amplificação aqui no contexto de PCR amplificação é fazer cópias de um fragmento alvo de um fragmento específico que

nos interessa pode ser um gênio um pedaço de um gênio uma porção de um gênio sei lá qualquer porção de DNA aí você consegue amplificar consegue fazer cópias por meio de PCR para isso você vai vai precisar de dois grupos de elementos Você vai precisar de reagentes né para fazer a reação e variação de temperatura reagentes vai colocar num tubo todos os ingredientes que você precisa para amplificar aquele áv fazer cópias daele áv Então você vai precisar de um molde o DNA que vai servir como molde que vai servir como substrato para que as cópias

dos fragmentos sejam geradas ao longo da reação Você vai precisar de nucleotídeo né Fin final de contas o DNA ele é composto por nucleotídeo a unidade formadora do DNA são os nucleotídeos Então você vai precisar dos nucleotídeos Você vai precisar de uma Adna polimerase Adna polimerase é a enzima que polimeriza DNA que vai fazer as cópias d seu fragmento alvo utilizando esse molde utilizando os nucleotidos vai precisar de primers primers são pequenos fragmentos de DNA fita simples que vão se anelar vão se associar hibridizar as extremidades desse seu molde aqui desse fragmento alvo a ser

amplificado para que a DNA polimeras consiga começar a trabalhar e incorporar os nucleotídeos tem um ion de valente também geralmente a clorida de magnésio aqui o magnésio que você vai utilizar que é O cofator da Adna polimeras e uma solução tampão para manter as condições da reação junta tudo isso dentro de um tubo e vai fazer variação de temperatura que aí entra o segundo grupo de de elementos que é variação de temperatura ou a né tá aqui destacado o fragmento que a gente precisa Copiar ah durante a PCR considerando que isso aqui tá dentro de

um tubo com todos aqueles ingredientes uma temperatura alta 95 GC por um determinado tempo né Isso Aqui varia Isso Aqui varia também tudo que eu vou mostrar Aqui varia mas geralmente fica em torno dessa desses números que eu vou mostrar 95 GC por 1 minuto a dupla fita que é ligada uma fita outra ligada por ponos de hidrogênio tem energia de mais alta temperatura aqui essa dupla fita essa ponte hidrogênio ela se rompe formando duas fitas simples aí né Isso é uma primeira coisa que acontece então na na PCR a denatura da dupla fita de

DNA depois a gente abaixa a temperatura para 50 60 55º por um determinado tempo nessa temperatura aqui os primers que são aqueles fragmentos de DNA fita simples eh desenhados sintetizados especificamente para se anelar as extremidades do alvo vão encontrar o seu alvo Então esse pequeno fragmento de DNA fita simples aqui ele vai encontrar complementariedade lá na extremidade do alvo a ser amplificado a ser copiado por quê Porque ele foi desenhado para isso ele foi sintetizado artificialmente para isso com essa sequência específica ligando aqui a com t c com g geralmente um primer tem aí entre

18 20 23 nucleotides aqui eu tô mostrando com quatro só de forma didática Mas ele tem ele é um tamanho muito maior ele se liga aqui de forma muito específica a extremidade E no caso de uma PCR convencional a gente utiliza dois primers é um que se liga a uma extremidade do alfa e o outro que vai encontrar complementariedade de forma específica se anelar a outra extremidade do Alfa a gente aumenta a temperatura um pouquinho mais agora para 72 GC por um determinado tempo porque essa temperatura que a DNA polimerase ela funciona na sua máxima

eficiência então a DNA polimerase para ela funcionar para ela começar a polimerizar novas moléculas de DNA incorporar os nucleotídeos ela precisa dessa estrutura do plafit que foi formado aqui pelo primer com o seu alvo então a Adna polimerase ela tem a capacidade de identificar essa estrutura dupla fita e vi incorporando nucleotídeo aqui né formando uma nova fita usando essa fita superior aqui entre aspas superior né como molde eh sempre a com t c com g se aqui tem um a ela vem e coloca um t se aqui tem um um C ela coloca um G

ela vai utilizando uma fita com molde e veem sintetizando uma nova fita aí de forma complementar a Adna polimerase interessantemente também ela sempre funciona no sentido cinco linha três linha Então ela encontra essa estrutura aqui ela sempre vai incorporar nocle nesse sentido aqui ela não vai se ligar aqui e incorporar nucleotídeo para trás entre aspas para trás no outro sentido né ela vai sempre nesse sentido aqui a DNA polimerase 72 GC encontrou dupla fita ela vem e começa a incorporar nucleotídeo de forma complementar H com acontecer com g usando uma das fitas como molde a

mesma coisa acontece na outra fita né Acontece ao mesmo tempo de forma muito rápida em ambas as fitas aqui olha só no começo desse processo a hora que a gente eu comecei a mostrar PCR nós tínhamos um fragmento né uma cópia do nosso fragmento alvo no final desse processo né no final desses três passos que eu mostrei para você denatura anelamento dos primers e extensão nós passamos a ter duas cópias do alvo eu posso fazer eh bom antes né de de mostrar para vocês Deixa eu só falar que a denatura anelamento e a extensão é

considerado um ciclo da PCR o que eu posso fazer então é repetir esses três passos ou seja repetir esse ciclo uma vez mais fazer de novo a naturação anelamento e extensão só que agora eu tenho duas cópias do alvo eu comecei com uma produzzi duas Agora eu vou começar com duas e a hora que eu fizer isso né denatura alta temperatura abaixa para temperatura de anelamento dos primers eles se ligam de maneira específica complementar Adna polimera 132 GC vai estender formando as novas fitas E aí no começo desse passo né Desse ciclo eu tinha duas

cópias do alvo E terminei com quatro agora Eu repito mais uma vez só que agora vou começar com quatro e esse processo eu vou fazer várias e várias vezes de 30 35 40 50 vezes no caso da rflp se a gente fizer isso aqui 30 vez já é o suficiente a gente Teoricamente começou com uma molécula e no final desse processo teríamos bilhões trilhões de cópias dessa molécula Teoricamente primeira coisa que a gente não faz processo com uma molécula só dá para fazer com uma mas é muito Improvável geralmente a gente começa com várias moléculas

Afinal esse DNA alvo esse fragmento alvo que a gente tá copiando ele veio de um organismo a gente extraiu o DNA sei lá do suab bucal de alguém do sangue de uma planta não importa Então você não vai extrair uma molécula de DNA você extrai de várias células estão sendo em várias cópias Então você já começa esse processo com várias cópias no final você tem muito e muito mais porque é uma amplificação que acontece de forma exponencial um fragmento gera 2 2 geram 4 4 8 16 assim por diante então ele acontece de forma exponencial

por isso então que é exponencial e por isso que é uma reação em cadeia né a PC Reação em Cadeia da polimerase beleza falamos da PCR então foi a técnica que utilizada para amplificar para fazer cópias do óo que a gente quer detectar Então vamos para a segunda técnica que é o tratamento desses fragmentos amplificados aí por uma enzima de restrição então o que que é enzima de restrição enzima de reção a nuclease nuclease é aquela enzima que corta ácido nucleico aqui no caso ele vai cortar DNA dupla fita as enzimas de restrição fazem o

corte em DNA dupla fita uma nuclease que faz um corte em DNA dupla fita só que ela não corta em lugares aleatórios tem um fragmento ela não vai ali picotar de forma aleatória ela vai cortar em regiões muito específicas que são chamados sítios de restrição são as regiões onde essas enzimas as enzimas de restrição fazem os seus cortes de maneira muito específica E essas regiões específicas os sítios de restrição são regiões são sequências palindrômicas as sequências palindrômicas ou palavras palindrômicas ou frases palindrômicas Os palíndromos são aquelas frases sequências e frases que podem ser lidas Em

ambos os sentidos por exemplo se você pegar a palavra radar e ler da esquerda paraa direita você vai ler radar Ó raar mas se você ler da direita para esquerda você lê radar também ó radar até frases maiores anotaram a data da maratona se você ler da esquerda para direita tá essa frase se você ler da direita paraa esquerda ó anotaram a data da maratona e assim por diante acontece que o DNA ele é repleto de sequências palindrômicas ele tá lotado de de sequências que tem esse perfil aqui eu vou pegar mais clássica de todas

ó o DNA é lotado esse tipo de de de sequência Se você pegar a dupla fita do DNA com tc com G né uma fita aqui associada a outra se você ler uma das fitas nesse sentido ó g a a TC se você ler a sua fita complementar no outro sentido é gatt TC também então é uma sequência palindrômicas de restrição que reconhecem essa sequência aqui e fazem cortes em lugares específicos em locais específicos dessas sequências palindrômicas dá uma olhada na aqui na na enzima mais clássica de todos então Imagine que nós temos uma sequência

né uma sequência de DNA ali dentro daquela sequência tem uma região palindrômicas uma enzima de restrição chamada Eco R1 que se você pegar esse DNA aqui incubar numa solução as condições ideais temperatura ideal solução tampão com essa enzima com essa nuclease chamado Eco R1 ela vai reconhecer esse sítio aqui o sítio de restrição essa região palindrômicos específica ela vem faz um corte aqui entre o g e o a nessa fita e ela faz um corte aqui entre o g e a nessa outra fita aí fragmentando esse DNA que era uma um fragmento único ele passa

ser dois fragmentos menores aí porque ele foi e ele foi tratado com essa enzima de restrição ele sofreu essa ação desta nuclease certo a ecor R1 faz esse tipo de corte nesse tipo de sequência elas são muito específicas de novo ecor1 reconhece essa sequência que tá em vermelho aqui e só que existem diversas enzimas de restrição eh que reconhece diversos outros sítios de restrição então tem outras enzimas que eu peguei só um exemplinho de nada de enzimas de restrição que reconhece diferentes sítios tem centenas de enzimas aí disponíveis no mercado que você pode usar para

fazer esse tipo de digestão em regiões específicas de fragmentos que você selecionar que você amplificar por PCR por exemplo certo Então esse foi o segundo passo enzima de restrição Vamos pro terceiro passo que é eletroforese a eletroforese é uma técnica que nos permite separar biomoléculas como DNA RNA proteína de acordo com o seu tamanho com o seu peso molecular portanto com a sua carga com sua estrutura de acordo com essas essas características dela a eletroforese é uma técnica que funciona assim imagine que você tem um determinado ambiente um polo negativo e um uma extremidade numa

outra extremidade desse ambiente Você tem um polo positivo entre essas duas extremidades aqui você tem uma uma matriz gelatinosa porosa é uma substância muito parecida com uma gelatina que possui poros né ela não é absolutamente sólida ela possui poros muito pequenininhos que passam moléculas por ela e se você tiver uma situação e isso é muito comum na Biologia molecular que você por exemplo tem uma amostra de DNA essa amostra de DNA ela contém três moléculas diferentes tem um fragment de DNA um fragmento médio um fragmento pequeno ali tudo misturado dentro de um único tubo você

quer separar essas moléculas você quer visualizá-las separadamente dá para fazer isso por eletroforese Então você pega essa mistura de amostras com diferentes tamanhos diferentes pesos moleculares coloca próximo ao polo negativo DNA e RNA tem carga negativa são moléculas com carga negativa aí negativo com negativo polos iguais eles se repelem polos diferentes se atraem então se você colocar essas moléculas de DNA próximo ao polo negativo gerar corrente elétrica aqui numa solução aquosa né que é a onde está imersa essa sua matriz gelatinosa esse seu gel essa sua gelatina o DNA que tá aqui desse Polo ele

vai tender a migrar pro Polo positivo do negativo pro positivo só que acontece que essa Matriz gelatinosa vai causar resistência na migração dessas moléculas as moléculas menores de menor peso molecular tendem a migrar mais rapidamente através desses poros e as moléculas maiores migrar mais lentamente então se você deixa essa carga essa corrente elétrica eh ligada por um determinado tempo nessas condições as moléculas vão migrar só que as moléculas menores de menor peso molecular vão migrar mais rapidamente do que as maiores hora que você desliga esse sistema essas moléculas estão separadas e você consegue visualizar isso

eh e um aparato específico né jogando um corante que vai fazer aquele DNA aquele RNA brilhar é numa mesa trans iluminadora num sistema de captação aí de imagem você consegue ver aí nesse vídeo cada pontinho luminoso desse que você tá vendo aqui ó é uma molécula de DNA são fragmentos de DNA né aqui tá mais fácil de ver né então cada pontinho luminoso desse aqui ó são fragmentos de DNA que foram separados aí de acordo com o seu peso molecular certo isso aqui pode ser muito útil que você pode pegar isso é outra maneira de

visualizar né o resultado de uma eletroforese então isso aqui é um DNA isso é fragmento DNA isso fragmento DNA cada coluna dessa aqui é uma amostra nessa amostra um amostra dois isso aqui pode ser informativo você o fato de você conseguir pegar um fragmento e separar esse fragmento ou verificar que ele ele tá único ali dentro pode trazer alguma informação pode ser a presença de um patógeno numa amostra por exemplo então aqui poderia ser uma amostra de ovo e você detectou a presença de salmonela Você viu o DNA de salmonela aqui ou você pode fazer

um processo de genotipagem como que a gente vai fazer agora em rflp identificar genótipos por meio de de DNA certo então a eletroforese isso você entendeu essas três técnicas agora você vai entender como funciona a rflp que é a combinação dessas três vamos lá vamos usar um exemplo extremamente prático aqui de como a gente pode usar a rflp para obter algum tipo de informação né eu vou dar um exemplo mas você expande esse racional aí para qualquer coisa que você consiga fazer por por meio de genotipagem isso aqui é um exemplo de genotipagem então no

nosso exemplo aqui nós vamos fazer a identificação de pessoas que são sensíveis ou resistentes a cafeína tem outras aulas aqui no canal que eu já usei esse exemplo da cafeína Então a gente vai usar o mesmo aqui para manter o padrão tá só que eu falei de outras técnicas eu não falei da rflp aqui então a gente o objetivo nosso é por meio da técnica de rflp identificar indivíduos que são resistentes a cafeína e divíduos que são sensíveis à cafeína existe um gene chamado cip1 A2 é é todo mundo tem esse Gene esse Gene tem

uma sequência única lá todo mundo tem a mesma sequência do Gene Só que alguns indivíduos eles têm uma determinada porção ali do Gene uma adenina e outros indivíduos temm uma citosina quando existe essa troca de adenina para citosina nesse gen e existe uma informação já pré adquirida por pesquisadores outras pesquisas que foram realizadas anteriormente associando a presença de a ou C nesse Gene com a metabolização da cafeína que é o seguinte pessoas que TM a adenina naquela região específica daquele Gene São pessoas que metabolizam mais rapidamente a cafeína ou seja elas TM menor sensibilidade à

cafeína já as pessoas os indivíduos que tem AC citosina naquela porção específica daquele gênio CP 1 A2 São pessoas que metabolizam mais lentamente elas são mais sensíveis elas sentem mais o efeito da cafeína aqui né Vamos usar aqui o exemplo um exemplo hipotético essa sequência aqui eu eu criei tirei da minha cabeça aqui não é o que acontece na vida real para esse Gene não é a sequência do Gene mas ela serve para ilustrar o que acontece nesse Gene aqui tá ela é finge que é o que que tem lá no Gene só paraa forma

didática aqui então nós temos aí na população pessoas que tem o alelo um né então naquela uma porção então a sequência do Gene tá aqui Imagine que essa sequência do Gene existe uma região ali que alguns indivíduos t adenina e outros indivíduos T citosina estão vendo que a sequência do Gene ela é Idêntica o todo resto da sequência do gên é a mesma coisa não muda nada é só aqui nessa porçãozinha nessa nessa ligação de a com T aqui que existe uma troca alguns indivíduos t a e outros T G então na população nós temos

o Nós temos dois alelos disponíveis o alelo um tô chamando de Alelo um aqui que são aqueles indivíduos que não são sensíveis à cafeína tem uma adenina aqui mas aqueles indivíduos que tem o alelo dois são sensíveis à cafeína porque ele tem uma citosina aqui olha só que interessante aí já vai começar a entender Se você pegar o DNA desse indivíduo extrair o DNA desse indivíduo fazer amplificação por PCR desse fragmento aqui incubar este fragmento lá com a enzima Eco R1 né lembra que essa sequência aqui ah coincidentemente ela é justamente aquela sequência palindrômicos cítio

de restrição da eco r1 se você pegar os indivíduos que não são sensíveis à cafeína portanto que tem adenina aqui incubar o fragmento de DNA deles esse fragmento de DNA deles ali com a eco R1 que que vai acontecer ela vai cortar ela vai encontrar o sítio de restrição e vai cortar gerando dois fragmentos aqui de tamanhos diferentes né só que se você pegar os indivíduos que tem apenas um Alelo 2 C fizer a PCR desse fragmento aqui e incubar com a EC R1 ela vai cortar não porque ela não tem o sítio de restrição

não é uma sequência palindrômicas não consegue fazer o corte aqui então indivíduos que esse fragmento de DNA de indivíduos que são sensíveis à Cafeína que tem Ac citosina aqui portanto eles não são fragmentados mantém um fragmento único intacto tá Então guarde essa informação porque é a parte dela que a gente vai usar o racional da rflp ó para facilitar nossa vida aqui em vez de eu ficar mostrando essa sequência o tempo inteiro para vocês vamos eh deixar ela mais simplificada é a mesma sequência ali do slide anterior só que aqui eu fiz uma molécul zinha

de DNA uma tem a CG ou seja esse aqui é sensível à cafeína c é o que é é sensível a cafeína e que não tem o sítio de restrição da EC R1 e nós temos indivíduos que TM o at esses aqui não são sensíveis à cafeína e que tem o sítio da EC R1 sítio de regão da da EC R1 então numa população nós teremos três tipos de indivíduos aqueles indivíduos que são homozigotos pro C portanto são os indivíduos sensíveis a cafeína e não suscetíveis à ação da EC R1 né Nós estamos falando que

um homozigoto pro C porque nós somos aqui organismos diploides a gente recebeu um cromossomo proveniente do pai um um cromossomo homólogo proveniente da mãe Nós temos duas cópias desse Alelo por Genoma né no caso de humano são duas cópias desse Alelo aqui por Genoma então nós temos indivíduos que tem eh um Alelo que veio do pai que é GC e um Alelo que veio da mãe que é GC também então esses são os indivíduos homozigotos pro C eles não eles são sensíveis a cafeína mas o seu DNA se incubado com a com a EC R1

não degrada mas nós temos indivíduos são os esgotos pro a são aqueles indivíduos que receberam da mãe tanto o at como receberam do pai o at também certo então são os esgotos pro a esses são os caras que são não são sensíveis à cafeína mas se o DNA deles for incubado com ecor1 ela vai lá e corta e nós temos um terceiro tipo de indivíduo que é o étero esgoto recebeu do pai ou da mãe o GC e recebeu do pai ou da mãe o ta então ele tem as duas eh eles ele tem os

dois alelos isso tem os dois tipos de Alelo e esse cara tem sensibilidade intermediária a cafeína Então se o DNA dele foi incubado com a e com a EC R1 um fragmento um tipo de Alelo um dos alelos não sofre degradação não sofre o corte e o outro sofre então aqui tá o exemplo dos três tipos de pessoas os três genótipos que nós temos aí na população para essa para esse Alelo especificamente né para esse Gene específico para para esse caso que eu tô contando aqui para vocês então vamos começar a fazer a técnica de

rflp ela começa lá com a PCR PCR nós iremos amplificar o nosso alvo né aquela porção do Gen cp1 A2 que eu falei para vocês que contém esses alelos nós vamos amplificar essa porção desse Gene para eh fazer cópias dessa região pra gente conseguir identificar então quando a gente faz a PCR de um indivíduo é aqui olhando didaticamente né nave vida real quando a gente faz esse processo de genotipagem a gente não sabe se tá genotip um homozigoto pro C um homozigoto pro a se tá genotip um heterozigoto a gente vai coletar amostra de um

indivíduo na rua no laboratório Sei lá onde e vai fazer esse processo para identificar o genótipo aqui didaticamente eu tô mostrando o genótipo logo de cara então quando a gente faz a PCR de um indivíduo que é homozigoto pro C todos os produtos gerados A partir dessa reação de PCR Todas aquelas milhares milhões de cópias geradas a partir da PCR Desse nosso fragmento alvo aqui terão CG né vai ter a Ac citosina aqui naquela porção e a Gina na outra porção aqui todos os fragmentos serão CG não tem o at aqui no meio porque ele

era um zigoto pro C certo quando a gente faz a mesma coisa aí pro pro cara que é não sensível né que é m zigoto pro a todos os seus fragmentos amplificados gerados copiados por PCR vão ser at porque ele não tem o outro Alelo e só tem o at ele é um homozigoto por a quando a gente faz e apcr de um indivíduo do heterozigoto tem sensibilidade intermediária ele vai ter ambos os alelos né um que veio do pai e o outro que veio da mãe então a gente vai ele vai ter a mistura

dos dois alelos amplificados copiados ali ao longo da PCR beleza aí a gente vai pro passo dois que é pegar o DNA desses indivíduos e tratar com a nossa enzima de restrição específica aqui no caso a EC R1 que que pode acontecer alguns fragmentos eles podem ser picotados eles podem ser e alvos da ecor1 e ser fragmentados e out outros não a gente vai Depende do que da sequência do DNA dele então se você pega um indivíduo que é homozigoto pro a ele não é sensível a cafeína né então ele tem adenina aqui os dois

alelos né que veio do pai que veio da mãe que veio da mãe que veio do pai milhares de cópias desses dois alelos porque a gente fez a PCR no Passo anterior milhares não milhões de cópias desses dois alelos eu tô mostrando os dois alelos aqui para não mostrar milhões de de de sequência como aconteceria numa PCR tô mostrando só os dois aqui mas saibam que que nós estamos olhando para milhões de cópias isso daqui só que todas essas cópias tem a t aqui nessa porção portanto quando a gente pega esse produto de PCR coloca

num tubo mistura esse tubo com uma solução tampão e com a enzima EC R1 o que que vai acontecer com esses com esses fragmentos todos aqui eles serão cortados pela Eco R1 gerando aí fragmentos com dois tamanhos Diferentes né Nós tínhamos várias cópias de um fragmento de um único tamanho agora a gente tem várias cópias de dois fragmentos cada fragmento aqui de um tamanho específico né um menor que o outro maior que o outro não importa são fragmentos diferentes aqui que foram gerados são dois fragmentos que foram gerados a partir desse corte da enzima aqui

certo agora a gente vai faz a mesma coisa pro homozigoto C que é o sensível a cafeína mas que não tem o sítio de restrição da eco R1 então a gente pode pegar esse DNA aqui incubar fez a PCR pega o produto da PCR incuba com a EC R1 vai acontecer alguma coisa aqui não a enzima não vai degradar não vai fragmentar não vai cortar esse fragmento que ela não tem o sítio de restrição dela aqui então aqui nada acontece a gente permanece com um fragmento de um único tamanho várias cópias de um fragmento de

um único tamanho certo quando a gente faz a mesma coisa com étero zigoto que que vai acontecer algumas cópias do fragmento vão ter adenina e outras terão citosina as que tão que T adenina após Inc base e R1 vão ser cortados e os que não t adenina que tem citosina não vai acontecer nada Então esse indivíduo aqui ele vai ter fragmentos intactos e fragmentos cortados E aí a gente vai pro terceiro e último passo da rflp que é eletroforese que é identificar esses fragmentos que foram ou não picotados quando a gente tem lá o o

homozigoto pro C que é sensível a cafeína lembra homozigoto por Pro c não tem o sítio da restrição você pegou a PCR fez o produto PCR tratou ele com enzima de restrição ele não foi fragmentado agora você traz ele para uma eletroforese que que você vai ver uma única única banda o único fragmento de DNA que é o produto da PCR intacto bonitão agora quando o homozigoto pro a ele tem o sítio de restrição ele é não sensível à cafeína ele tem o sítio de restrição a hora que você fez a PCR incubou ele Eco

R1 o que a eco R1 fez cortou aquele fragmento em dois então você vai ver dois duas bandas aí referente a um pedaço do fragmento e o outro pedaço cortado do fragmento e o heterozigoto o heterozigoto ele tem a combinação dessa as três bandas porque ele tem o fragmento que não sofreu ação da enzima né quando o o alelo dele que possuí AC citosina que não era não tinha o sítio de restrição mas ele tinha um outro Alelo também que era sensível à enzima né que tinha o sítio de restrição do enzima esse sim foi

fragmentado então o indivíduo que heterozigoto ele tem os três fragmentos aqui então olha só com essa combinação dessas três técnicas a gente conseguiu olhando aqui a presença de bandas né numa eletroforese identificasse era homozigoto para um Alelo homozigoto pro outro Alelo ou heterozigoto a gente pega na rua DNA aleatório de pessoas aí sei lá pega da Cláudia do Humberto e do Eduardo e a gente fizer esses três passos sem saber qual que é genótipo deles basta a gente olhar aqui para essa eletroforese e falar ó no caso do Eduardo só apareceu uma banda de Alto

peso molecular essa essa banda de Alto peso molecular significa que ele não foi a a enzima não degradou o RNA dele Portanto ele não tinha o sítio Portanto ele é um cara que é sensível à cafeína a Cláudia sei lá não lembro os nomes que eu usei ela se pegou o DNA dela o DNA dela fez a PCR foi fragmentado então ela mo zigota pro a e o outro indivíduo outro indivíduo fez a PCR uma parte do DNA foi fragmentada outra parte não então ele tem os dois ele é um heterozigoto então ele tem uma

sensibilidade intermediária Então você traz uma informação funcional que é o nível de sensibilidade da cafeína a capacidade de metabolizar a cafeína analisando o DNA analisando como processo de not page por meio da técnica de rflp que é a combinação dessas três técnicas aí PCR tratamento com enzima de restrição e eletroforese beleza é isso aí você entendeu o que é rflp agora pra gente finalizar que qual é vantagem desvantagem essa técnica vantagem é uma técnica que já foi muito utilizada Então ela é muito bem padronizada ela é fácil de fazer ela não é assim vamos falar

não é que ela ela é ela ela é simples de fazer mas ela ela é trabalhosa tá ela é simples de fazer você não precisa de grandes equipamentos em laboratório basta você ter um termociclador e um aparato para fazer eletroforese o que é muito comum em todos os laboratórios de biologia moleculara que fazem pesquisa vão ter isso daí então você não precisa de grandes equipamentos para fazer essa técnica ela é barata fácil de fazer é simples de fazer você consegue fazer praticamente qualquer laboratório e tem enzima de restrição pra caramba disponível no mercado eu mostrei

uma delas aqui que é eco R1 que vai naquele sítio específico mas tem muita enzima de restrição aí que que que pode atuar cortar em diferentes regiões de interesse a diferentes fragmentos Então essas são as vantagens desvantagem é um processo muito manual ele é relativamente trabalhoso de fazer né são três passos aí trabalhosos e bem manuais é um quando a gente fala de coisas manuais Passos manuais na biologia molecular não combina com o mercado aplicado ele combina bem com pesquisa porque tem mão de obra eh sobrando que são os estudantes o pós-graduando a gente tem

mão de obra sobrando na pesquisa mas quando a gente fala de mercado aplicado vai no mercado de agronegócio vai no mercado eh de saúde que faz análise de rotina análise clínicas diagnóstico não combina porque ali eles demandam velocidade e automação então a desvantagem é essa um processo bem trabalhoso e muito isso aqui que eu mostrei para para vocês e quase tudo que eu das aplicações que eu mostrei lá no começo da aula elas podem ser facilmente substituídas por PCR em tempo real que é uma técnica mais cara de fazer é muito mais fácil de fazer

mais fácil de analisar também então assim FP é foi uma técnica muito utilizada ela é utilizada até hoje é eu até antes de começar essa aula aqui eu fiz uma busca no pubm eu vi que acho que o ano passado teve por volta de 600 publicações usando rflp né os anos anteriores eram mais ela vem caindo ao longo dos anos mas assim tem 600 Laboratórios aí publicando fazendo a rflp ao longo do mundo só para você ter uma ideia PSR em tempo real tava em torno de 15.000 mais ou menos eh então assim é uma

técnica que já foi muito utilizada muito bem padronizada mas ela vem caindo em desuso ao longo do tempo na pesquisa pode ser muito útil pode que você vai economizar reagente Você tem tempo para fazer isso né mão de obra disponível para fazer isso pode ser uma mão na roda para você que faz pesquisa se estiver trabalhando no mercado aplicado aí vai para outra técnica vai P em tempo real sei lá vai para outra técnica mas ainda na pesquisa ela tem o seu espaço Beleza Espero que você tenha gostado a gente se vê na próxima aula

tchau [Aplausos] [Música] tchau [Aplausos] [Música] k