Extração de RNA com TRIzol (TRI Reagente) - aula prática

O Olá seja muito bem-vinda universo da biologia molecular eu sou Eduardo castanho nós estamos aqui mais uma vez no laboratório de verdade para fazer uma aula prática de um tema que vocês pediram demais nós vamos fazer uma aula prática sobre extração de RNA com trizol Não não é o crisol vocês vão entender que é quase sol algo muito parecida vou explicar para vocês depois que eu vou dar vinheta mas antes que eu da vinheta Já deixa aquele como de outubro para mim já se inscreve no canal dá um like você assistir o vídeo compartilha com

alguém aí que possa interessar por esse assunto que a gente vai alcançar mais pessoas democratizar o conhecimento sobre biologia molecular a gente se vê Já já é [Aplausos] [Música] [Aplausos] eu [Música] [Aplausos] [Música] [Aplausos] estou Beleza deixa eu explicar algumas coisas aqui para vocês antes a gente falar Tecnicamente de como a gente vai proceder aqui no protocolo primeira coisa porque eu falei que o sol porque trizol eles vão uma marca assim como o teu Bombril de fala palha de aço sei lá água sanitária é canja é uma coisa não tem só uma marca que ela

ficou conhecida E todo mundo fala tem sol quando o protocolo utiliza um conjunto de reagentes são três que agentes mas que é baseado principalmente em tiocianato de guanidina Então nós vamos utilizar hoje aqui um reagente que é equivalente autorizou só que de outra marca que é chamado o trem e a gente que é da Mac então é por isso que eu falei três horas antes é o que eu o rei a gente faz exatamente a mesma coisa que o crisol é o mesmo protocolo começou a exatamente o Mesmo que você tiver só a marca Tirol

e a gente é outra marca que alguém pode utilizar aqui da Mac aí venha segundo o segundo recado é por isso que ele tá nesse laboratório top dá uma olhada nesse laboratório no vício que a Mac construiu que o São Paulo e eles gentilmente cederam para eu fazer essa gravação que eu pedi para ele se eles se verem o sabia que eles iam Laboratórios me ceder esse espaço aqui eu tô fazendo essa gravação que não é uma publicidade De fato não é foi Uma gentileza que eles fizeram para mim e o terceiro recado é a

dinâmica dessa aula que é o seguinte nós vamos começar com a parte teórica lá no estúdio vou explicar para vocês que como é que funciona aqui esse protocolo cada um dos Passos você vai entender como ele funciona e depois a gente volta aqui para prática e faz tudo na prática Beleza a gente vai lá na aula teórica agora a gente se vê na noite Studio Que maravilha então vamos ver aqui na Teoria rapidinho é como é que funciona outro sol como é que funciona o tio e a gente essa técnica esse método de extração e

eu vou colocar essa manifestação dentro do contexto das metodologias de extração purificação de DNA e RNA que no caso deve focar um pouco mais é real mas o racional é muito parecido para DNA é então eu vou colocar dentro do contexto utilizando outros métodos de distração só para que você tenha Claro aí as Possibilidades que existem certo então vamos começar é o seguinte ó então falando dentro do contexto de extração e purificação de DNA e RNA a são basicamente três passos no caso de quem tá trabalhando que vai fazer uma extração pelo método fenol-clorofórmio que

é o método utilizado por trizol frio e a gente DNA sol e assim por diante né que utilizam essa essa metodologia pode fazer três passos são três passos principais a primeira realize extração Do DNA de dentro da Selma exposição do a sal do ácido nucleico o ambiente para que ele possa ser purificado lá na frente aí vem processo de purificação mesmo o isolamento EA re suspensão momento que você recupera aquele ácido nucleico para seguir com os próximos passos gente vai seguir aqui nesse fluxo nesses três passos começando com Alice No caso da Lise né a

gente vai se falando de uma maneira geral de extração e purificação de ácido nucleico ali Naquele momento que você vai pegar o seu ácido nucleico extrair dentro das ela vai a romper a membrana celular expondo as um clipe O ao meio para que ele possa ser isolado lá na frente só que no caso do trio e a gente que a gente vai utilizar a técnica gente tá utilizando aqui o método que nós estamos utilizando aqui nessa aula o processo vai ver que alise Alice ela disse geralmente ela acontece junto com o próximo passo que é

a purificação Acho que sei lá noventa e Nove porcento das vezes deve seguir nessa nessa mecânica mas alisa mas todo jeito esses dois passa acontece mesmo que eles sejam ali misturados o que acontece em meio juntos no caso do time a gente Ele eles vão acontecer tá então a Lísia aquilo quando você rompe a as células e libera o ácido nucleico para que ele possa ser purificado há basicamente quatro mecanismo você pode fazer essa essa liberação física de maneira física química e mais que a Combinação dos dois no caso do trizol do Trio E aí

dessa estratégia que nós estamos utilizando aqui aqui para todos os carros para a maioria ou para todos os casos vai ser a combinação de dois Ali vai acontecer de forma física que você vai fazer uma força física seja nas ela num tecido e assim por diante como química utilizando justamente os componentes que eu vou mostrar daqui a pouco então a Lisa aquela mesclada é a combinação de nos dois metros será que Vai de qualquer maneira o racional da Lisa como vocês põe o ácido nucleico ainda não falei nada aqui do trio e a gente propriamente

dito aí vem o isolamento a hora que você vai fazer a purificação O isolamento e Purificação E aí quando você separa o seu ácido nucleico alvo de tudo o resto vai separar o r a de DNA de proteína de de celulares de outras moléculas como carboidratos é e assim por diante outras moléculas ali presente na sua própria Mostra e considerando a química utilizada no processo de extração e Purificação Então vai isolar o DNA RNA e proteínas e outros componentes celulares essa etapa pode ser subdividido em dois passos e aí a gente já vai aqui no

caso o protocolo trizol trio e a gente segue esse mesmo racional aqui que é o isolamento EA lavagem O isolamento o processo de isolamento e Purificação é aqui específica cada uma das estratégias cada um dos métodos de extração e Purificação é que o separei os três principais metros final e clorofórmio colunas e bits magnético a gente vai pode coluna já tem uma aula prática aqui sobre extração de DNA RNA por colônia vou deixar aqui em cima para você buscar e se você quiser é ia pedir magnética ele vai fazer sal em algum momento mais ainda

não tem tem aula teórica dela a prática é mas tem hora que eu tenho de mim de magnética também mas aqui no nosso caso nós vamos utilizar a Estratégia do fenol clorofórmio que no caso nutre e a gente utilizou também ele tem a adição de um terceiro componente que eu tiocianato de guanidina por isso que achava entre alguma coisa que são três componentes principais o fenol clorofórmio e tiocianato de guanidina do nós vamos focar nessa metodologia hoje na aula de hoje como que funciona a extração O isolamento por este método aqui no caso nós temos

a mostra que vai ser misturada ou uma organizada com o Trio EA gente é neste momento que começa o processo de extração e Purificação também mas aqui Mais especificamente tração você existe um momento aqui no protocolo a gente vai ver lá na frente que varia de amostra para amostra você vai pegar uma mostra e misturar um vigor com o triplo E aí deixa nesse momento que você tá fazendo a Lisa e começando a dos primeiros passos de purificação você vai entender melhor mas aqui mais mais focado nálise mesmo a passo nós podemos Aqui ter tecido

podemos ter célula suspensão se ela é cultivado em Mourão camada Você pode ter diferentes opções aí de fontes de amostra para fazer esse primeiro passo aqui do protocolo Então nesse momento você vai pegar o trio EA gente e misturar com a mostra diz que fazer de tal maneira que o ácido nucleico presente na mostra seja liberado seja exposto aos outros componentes aqui do trio e espaço ser feita Purificação então no caso quem Trabalha acontecido a gente vai ver rapidinho ali na frente quem trabalha com tecido Muito provavelmente vai ter que pegar aquele tecido misturar com

o trio EA gente homogenizar de alguma dele é uma maneira pode cercadinho e pistilo aquele Cadinho precinho que cabe dentro de um tubo eppendorf por exemplo para fazer uma utilização dessa maneira pode ser utilizando um politron é um homogenizador mais agressivo que é como se fosse um liquidificador quem não Conhece é como se fosse um liquidificador invertido no qual você tem Alan meu sem fio a lâmina dentro do tubo que está misturado contra e com a nossa acontecido e ele vai macerando misturando tudo ali expondo ácido nucleico fazendo porque esses reagentes é interajam né tem

a sua actividade no processo de extração tá então no caso do trio e a gente vai misturar a mostra o trio EA gente já tem o fenol ali nele então tem tiocianato de guanidina e o Final e o final misturado Depois dessa homogenização você vai misturar com clorofórmio é isso que a gente vai ver no protocolo daqui a pouco na verdade mais focado aqui porque o protocolo a gente vai fazer lá na prática quer que é melhor mas vai misturar essa essa mistura que você fez aqui do trio e a gente vão amostra junto com

clorofórmio no caso esse ela não falei né Se tiver trabalhando com tecido tecido tem que fazer uma movimentação mais vigorosa no Caso de selfie pode ser o o pen dar o capeta mesmo só de passar ali com a pipeta Possivelmente vai romper as células já e expor o ácido nucleico então pensar mistureba aqui misturou com clorofórmio depois que misturar com clorofórmio vai centrifugar hein a cidade acontece quando a gente centrífuga essa mistureba clorofórmio fenol at Oceanário guanidina mostra tudo aqui misturado depois a centrifugação o que que acontece a a proteína de Bill Celular celulares aquilo

que não nos interessa aqui no caso aqui nos interessa o RNA Talvez um ganhar alguns casos Então o que não nos interessa fica solúvel na fase orgânica que essa fase sozinhas vai ver direitinho lá no durante o vídeo aula prática essa fase Rosa o que nos interessa fica aqui na fase superior que a fase aquosa no caso o objetivo é extrair RNA e DNA o RNA ele tá na face superior o DNA é um filetinho aqui entre a fase orgânica fase aquosa e É a proteína que tá aqui embaixo da para extrair os três mas

utilizando esse protocolo tanto rma como o DNA como proteína também tá bom dá para extrair os três essas três morangos feito isso aqui já começou o processo de purificação né porque você separou o RH o resto aí no caso é real e ganhar eu tô começou o processo de purificação quem Basta Você Vir com a pipeta aqui retirar a fase aquosa Onde está o seu material né que Preto puxa faz aposta passa por Um tubo novo ele fica isolada ali agora mas um lavar isso aí dá uma mais uma mais algumas rodadas de purificação para

ficar só arranhar mesmo ou só arranhar ou só de inha tá bom Aqui nosso protocolo de hoje ela prática vai ser só em minha o passo seguinte é um passo de precipitação então que você tem o r a que está em solução ele está em soluções você vai precipitar com esse princípio precipita a ganhar com a adição de álcool aqui nosso caso não vai precisar De salto que ele já tem os componentes do trio e age no kit que já vem com tudo ali então a gente vai adicionar aqui apenas álcool no caso é álcool

isopropílico absoluto RNA DNA ou RNA ou DNA eles não são solúveis em etanol 100% etanol absoluto ou isopropanol absoluto os você misturar o pro Canal absoluto com o RNA que a gente acabou de separar lá da mostra é do Yuri e a gente das proteínas etc quando você mistura o isopropanol com o seu RNA mistura bem Vigorosamente para fazer uma mistura e depois centrífuga que que vai acontecer vai acontecer a formação de um palete o RNA de novo ah não é solúvel em isopor para outras moléculas são E aí mas quando você centrífuga você precipita

aquilo que te interessa o que não está em solução que ao RNA ele fica aqui pra esse tadinho em formato de pet e aí você vai para o próximo passo até o passo de lavar já que já tá praticamente isolado purificado mais fazendo uma lavagem aqui Vai favorecer eliminar até complexo de rma com proteína ou outras moléculas que eventualmente ainda estão contaminando a gente vem aqui Passos lavagem vejo né que eu mantive a que a informação dos três meses porque esses esses dois passos aqui são comuns a todos os métodos a cada um varia vai

fazer de uma maneira diferente no caso do fenol o telefone e do tio SENAT guanidina função desse jeito coluna outro jeito OBD magnético é outro jeito Mas aqui a lavagem no caso do trizol do trilho e a gente funciona seguinte maneira nós temos o Pelezinho formado aqui no fundo do tubo às vezes dá para ver as vezes não dá ele vai fazer é adicionar etanol 75 por cento e homogenizar só tem muito bem homogêneo muito bem não dá para desfazer o férias que não alta concentração de álcool que ainda mas vai homogenizar isso aqui muito

bem centrifugar e retirar o excesso de etanol 75 por cento e já fez A purificação já fez a lavagem essa mostra que ela está pronta para ir para o próximo passo quando a gente compara o fenol clorofórmio aqui no caso também que eu tinha assassinato de guanidina em relação a outros métodos como a coluna como as mesas magnéticas nós temos algumas vantagens aqui que a gente pode é helencar primeira coisa a vantagem de que a gente como outro e gente ele é primeiro que é muito eficiente ele funciona para diferença e mostra dá para Extrair

boa quantidade um rendimento muito alto de DNA Dr aquilo que você for precisar principalmente o rma ele é compatível com a extração de DNA de grande peso molecular então lá no protocolo para resolver que dá para melhorar dá para você favorecer a não fragmentação do DNA durante o processo de extração até um gente matem utilizar é basicamente utilizando aquele Cadinho e o pequenininho é o Cadinho intestino que Que cabe dentro do tubinho para erótico tá bom aquele lá vai fazer com mais não vai ser um processo mais delicada em vez de utilizar um politron que

a mais agressivo né as proteínas vão ficar na fase orgânica e elas podem ser purificado também tem um kit que permite você extrair outros outras moléculas se você quiser é um proteína o DNA Bom desempenho uma amostra simples mini-pizza Outra vantagem qualquer desvantagem o final turma forma pode Causar intoxicação tem um cheiro forte não tem que fazer esse trabalho dentro de uma no o ar e já se você tiver acesso a uma capela recomendado discos trabalhe Capela tem que usar óculos aquela coisa toda os resquícios de fenol e clorofórmio que esses são parte do processo

né ele se você não tiver luz na Mostra aí no processo de purificação falhou não funcionou muito bem vindo a falar sobre isso na prática pode inibir reações lá na frente não tem que tomar Cuidado no prazo de coleta da fase aquosa é a like e postar o pepino pode tá o erro beleza aí vem para terceiro passo aqui dos três principais né que a ressuspensão ruim que você pega aquele pele de arranhar e vai solubilizar novamente então basta nesse momento a retirar outra Nossa 85 porcento deixa secar um pouquinho ali adicionar água ou tampão

geralmente utiliza tampão tem ou louca é Dependendo do que você for fazer Então tá aqui o Pelezinho aqui no fundo adiciona o seu tampão só água que homogeniza muito bem desfaz o pallet e ele está pronto para você seguir os passos Ou você segue aí para malhação o controle de qualidade que é o mais indicado algumas observações in dicas você pode combinar a extração de RNA ou DNA com fenol clorofórmio e tias Renato de guanidina com outros métodos como Colônia não se pode fazer combinar as vantagens dos dois metros extrai Primeiro com final clorofórmico a

vantagem a grande quantidade do material que você consegue extrair eventualmente dependa do da sua amostra dependendo das habilidades que talvez o processo não seja o mais puro de todos aí você faz uma rodada de purificação com colônia como se utiliza o benefício dos dois metros em algumas dicas aqui algumas dicas eu vou falar aqui outras eu vou falar lá na prática então se eu não falar na prática Eu falo aqui agora é importantíssimo que você se atende no protocolo em relação à quantidade amostra utilizada e a solução de início no caso solução de ninja que

é o próprio trio e a gente então você tem que utilizar a com a quantidade o volume adequado para cuidar de modo que você tem que se você utiliza a mostra demais em relação ao Crime e a gente o que vai acontecer é que esse kit do que a gente não vão conseguir desempenhar o que não sei que Desempenhar ali na sua mostra incluindo a inativação de genes que são as enzimas que degradam r a ao mesmo tempo se você colocar pouca mostra em e muito trigo e este talvez você não tem a quantidade adequada

de RNA ou DNA lá na frente né é importante você não deixar à mostra esquentar Principalmente quando você tiver fazendo a uma organização né a um passo de lise que se você utilizar um cadinho que estilo um politron isso e tu ia mostra mais que tentando então evita Que a mostra esquente Como organizar muito bem centrífuga na velocidade certa em tempo adequado aqui a última isso muito bem claro para você fazer com que os reagentes entre em contato com a n a para fazer a purificação sem subir na velocidade certo não tem poder quado a

minha dica que você não processo muitas amostras por vez que tem um processo demorado muito manual e você acaba cansando e as últimas amostras provavelmente vão ser prejudicados né e Cuidado para não movimentar as fases quando tiver fazendo a retirada só que eu falo bastante lá na hora esse aqui também esse aqui também esse aqui também esse aqui também e esse aqui também tá isso você vai ver lá na prática aqui é mais legal só pra gente finalizar aqui vamos dar uma olhadinha no protocolo bate o olho rápido aqui no protocolo eu vou deixar o

protocolo do lado lá conforme a gente vai avançando nos Passos aula prática eu vou colocando O protocolo de tacando em que fazem está no protocolo maravilha então aqui nós estamos no protocolo do trio e acho que ele fala que eu te enviei Este também conhecido é aonde fala que a mistura do tiocianato em buridina com fenol que ele vai utilizar depois da mistura com o clorofórmio Ele explica mais ou menos o que eu expliquei aí para você depois aqui embaixo ele começa a falar para cada tipo de amostra cada fonte de amostra Qual que é

o procedimento então No caso de tecido tem que fazer uma organização com mais de boa utilizando um político é um por exemplo ele fala quantidade também se precisar se você quiser evitar o dano ao DNA fragmentação DNA faz um homogenização mais mais leve dá para trabalhar com células em Mourão Campo Mourão camada também aqui é bem simples basta adicionar o trio EA gente diretamente a cultura fazer eu vou pegar o capeta e seguir para a extração SUS trabalha com células suspensão retira ao Que for líquido desse processo na isola as células O que é líquido

lá na cultura Então por centrifugação 6 aulas as células essas células e aí mistura faz uma penal com o cliente para começar a extração Aí depois ele dá tô comendo ações para diferença condições Aí talvez você venha até dar uma olhada se aqui com calma depois E aí ele vem aqui na fase de separação homem que vai separar misturou à mostra com o fio e a gente adicionou o clorofórmio homogêneo zolben Centrifugou aí tem que é separar suas vai retirar as fases ele dá uma alternativa aqui o clorofórmio se você precisar aí ele tá falando

aqui vai transferir a fase aquosa por um tubo novo vai adicionar o isopropanol centrifugar para formar o peles e depois lavar com etanol 75 por cento certo aí lavou vai ressuspender depois que ressuspender você tem a possibilidade deixa secar ele bem não tem uma quantidade um tempo ideal que eu vou Falar em aula prática para você deixar secando não após retirada do etanol 75 por cento e aí tem um passo aqui que você pode fazer eu recomendo que você faça tá que eu não faço lá na prática porque sua mãe incubação Mas você eu recomendo

que você faça que é isso daqui ó para facilitar a dissolução mistura por pipetagem e misturando a sua o seu pet com a água o contecc você utilizou para ele ir entre 55 e 60 graus Celsius por 10 a 15 minutos e aí você Vai Facilitar a ressuspensão feito isso nós podemos voltar para uma prática para você ver todo esse processo aqui sendo feito na vida real vamos lá Maravilha voltamos aqui para bancada agora vamos fazer na prática o que vocês viram na teoria entender como funciona esse reagente vamos fazer aqui na prática algum algumas

comentários só nós vamos laboratório que tem altíssimo controle de qualidade Auto controle e grossão de segurança então eu tô aqui paramentado De uma forma adequada para trabalhar é vou utilizar aqui essa Capela tudo certinho de acordo com as normas laboratório e também com as formas de convite para gravação desse vídeo acende ainda no meio da academia a tampa acabando parece está indo para a melhoria mas ainda estamos na academia então é só para você saber para O que é passei por testes estamos seguindo Os Protocolos de distanciamento social tudo certinho beleza então vamos começar a

Gente vai fazer a primeira coisa agora com a gente vai pra poder trabalhar com amostra de verdade não pode entrar material biológico nesse nesse laboratório então a gente vai fazer uma simulação mas não tem muita diferença do que vai acontecer na sua vida real aí a gente viu lá na na aula teórica a Quais são os procedimentos para cada tipo de amostra então às vezes amostra de tecidos e zelo as vezes a célula que detalhe nunca mais em cada cada mostra Vai ter o seu protocolo Inicial mais não a partir dali não tem muita diferença

então aqui a gente não vai poder colocar uma moto de verdade vamos colocar aí por volta de 100 ml de água mesmo né que é equivalente a 10 por cento do ambiente que a gente vai utilizar como diz o protocolo só para ter alguma coisa ali misturado certo a partir dali a partir de uma organização desse primeiro passo o resto ele é igual independente do tipo de Amós e vai utilizar a moça tá uma Organizada com o tio e a gente Segue aí o protocolo normalmente Como eu vou mostrar aqui Fechou então vamos começar nisso

agora olha só eu tô com 12 tubos aqui vou fazer dois tubos só para não fazer um tubo só eu vou ficar aqui meio de costa para vocês porque eu precisava como eu falei a tabela aqui tá bom mas eu vou virando a gente vai conversando eu vou fazer dois tubos eu vou escrever chamar um tubo de um aqui vou colocar na tanpinha o outro tubo de 2 só para não Fazer um só se por um acaso gente perder um é mais fica com dois e pode fazer algum pezinho tá bom dois tubos só por

isso aí eu vou colocar primeira coisa é sem micro litros de água nesses dois tubos aqui Aqui tem água eu vou colocar 100 litros de água para simular o que seria a nossa amostra tá bom é tipo assim logo seria a alta E aí em Tóquio sem micro litros de água é muito bumbum à mostra um O e sem micro Tiago do tubo 21 a beleza feito isso vamos colocar o que seria equivalente ao trizol né lembra que eu falei para vocês é exatamente a mesma coisa só que é outra marca chamada the Freak show

é isso daqui tem que utilizar mesma cortisol é um cheiro é exatamente a mesma coisa cuidado para manipular esse negócio que ele é tóxico ele tem um Cheiro forte tem que tem que tomar cuidado para você não se contaminar não contamina o ambiente não se machucar manipulando esse esse reagente tá bom trabalho com bastante cuidado que isso aqui é o ponto eu acho que em termos de segurança mais delicado nesse protocolo fechado Vamos lá gente vai colocar 1ml 1ml do Tri e a gente em cada tudo e homogeniza vamos pegar aquilo a moniele ó mesma

cozinha e por acaso já Utilizou trizol e já viu é isso aqui ó não tem a menor diferença e homogeniza aqui bem se a gente tivesse com amostra de verdade esse processo de uma organização aqui ele é fundamental ele é fundamental se processo de uma organização ou até parar para falar com você sobre isso esse processo de uma organização que vai variar de amostra para amostra ele é fundamental porque porque neste momento que esses reagentes Aqui o componente do tio e a gente ele está entrando em contato com a amostra com rma com o DNA

Italy dentro Inativo urnas nucleares e condene nativas no criado e aí que é só nossa Fica tranquila Nem só você tiver trabalho com RH tiver trabalhando com RNA e a essa moça em temperatura ambiente nós estamos fazendo tudo aqui em temperatura ambiente até esse momento se você não inativar as nucleares aquele DNA que ele a Renata tá linda a gente vai começar a Degradar Isto é fundamental fazer uma homogenização adequada aqui nesse momento que vai favorecer a inativação da Serrinha e Ases das de mias vai favorecer é desfazer o complexo de DNA com proteínas de

RNA com proteína é o primeiro passo para você isolar o seu ácido nucleico Tá bom então processo de evangelização é muito importante varia de amostra mostra aqui no caso não fazer uma indenização por proprietário é mesmo Mas eventualmente aí no seu caso mas tem que fazer uma organização a com um politron será de alguma maneira dependurada almoço aqui por enquanto os homogenização público de preto vamos continuar que eu vou fazer para outra mostra colocar é um ml do trigo e aí deixe na outra mostro o que faz homogenização aí nesse ponto aqui para quem tá

trabalhando com RNA que tá naquela loucura é manipulação terminar vai degradar meu Deus do céu Aqui é um momento que a sua mostra já começa a ficar mais segura eu já aqui já não tem aquela correria de trabalhar um gelo nitrogênio líquido aqui já começa a ficar mais sossegado Tá bom então o Óbvio homogeniza bem para por todos esses motivos mas já não tem aquela loucura mais de manipular o RH inclusive até recomendado que você deixe agora essas duas amostras aqui em cubano por cinco minutos para justamente para o frio e a gente Funcionar ativar

fazer o que ele tem que fazer ali dentro e depois a gente continua aqui tá vamo lá cinco minutos de incubação a gente já volto beleza incubou cinco minutos agora vamos colocar o clorofórmio aqui tá uma num dos momentos críticos Esse é crítico de a difícil não mas é um momento muito importante do protocolo ele vai colocar adicionado 200 micro litros o clorofórmio nas amostras já encubada já com o trio EA gente e a e homogeniza Muito bem então o segredo aqui está na homogenização faz homogenização vigorosa depois da dessa mistura dessa edição e ele

vai encubada Pois por mais 15 minutos vamos fazer isso eu vou colocar aqui 200 eu já deixei a pipeta preparada 200 micro litros de clorofórmio um abrir o clorofórmio agora só porque ele também ele é muito volátil ele pinga se você for pipetar Então até deixar o tubo aberto já eu fico boa quer mostrar um 15 minutos amostra dois também eu vou adicionar 200 micro litros de clorofórmio Absoluto em cada uma delas estão aqui tem que não pode bobear muito não senão ele começa a pingar ó Tá pingando 200 micro litros fecha e mais 200

micro litros e feche agora o segredo tá aqui ó e misturou ele vai começar ele já vai começar que informar as fases é isso que A gente quer que ele vai formar as fases a gente viu lá na aula teórica que se inicia é um objetivo aqui só que para você fazer esse negócio funcionar direito tem que fazer uma homogenização vigorosa isso aqui ó sem medo de ser feliz se tiver um voto dizendo para te ajudar pode fazer um vodka também não tem problema nenhum Mas o importante é que o amostra misturado com firme e

a gente aqui microfone estejam muito bem organizados homogêneos Opá é ó ele vai Ficar cor-de-rosa tá vendo vai ficar com uma coisinha cor-de-rosa mais mais leve faz isso para outra moça também né Se tiver um boxe não faz um voto que está melhor Oi e aí depois disso aqui no homogêneo sou muito bem deixa em cubano aí 15 minutos temperatura ambiente vai cobrar por 15 minutos em temperatura ambiente e depois essa incubação a gente vai passar centrifugação Beleza vou deixar Cubana aqui quando em Cuba a gente pode fazer Um negócio eu só aguento com cuba

vamos fazer aqui essa diluição que ir lá na frente a gente vai precisar de anão 75 por cento eu vou fazer essa diminuição do etanol 75 por cento e já deixar pronto para quando eu for precisar num diluir lá na hora mas foi umas duas informações importantes aqui a primeira delas vai fazer etanol 75 por cento para lavagem que a gente vai preparar ele para esse passo faça fresco utilizei fresco prepare no dia não não pega está No alto foi diluído preparado em No dia anterior se ela dois dias atrás tem que fazer no dia

porque porque a nova a porta mesmo e aí você vai dar uma concentração diferente da ideal certo dessa primeira coisa segunda informação aqui nós vamos usar de um ml de etanol 70 um para cada amostra não vai para essas 2 ml para lá para os nossos eu vou fazer sim vou fazer 5ml que só para ter de sobra mesmo para sobrar um pouquinho Você Raça empinga alguma coisa do tipo e Para trabalhar com o volume um pouco um pouco maior certo para fazer então é etanol setenta e cinco porcento 15 ml de etanol 75 por

cento nós vamos pipetar... 75 ml de etanol e misturar com um ponto 25 ml de água ele vai ficar aí no seu 75 por cento se você está confuso com essas contas como fazer preparação as diluições tem um vídeo aqui no canal só sobre isso as contas a matemática que envolve laboratório de biologia molecular é coisa simples mas Se não tiver um uma organização de raciocínio você pode ficar perdido então se você eu vou deixar aqui em cima um link para você ou se você tivesse vindo aqui no to bullying que tá aqui em cima

se você estiver assistindo desde o DNA eu vou deixar o link aqui embaixo para vocês tirar o sobre diluição fechou vamos fazer essa diva e... 75 ml de etanol misturado com um ponto 25 ml de água para ficar 5ml há 75 porcento bom lá Vou colocar aqui o utilizar Como assim vai completar... 75 ml de metanol eu vou eu vou utilizar para mim o mesmo não poderia trabalhar com uma pipeta maior mas vou completar com a pernil para completar três vezes com cuidado né para não perder Aí o volume a de quatro eu tenho água

aqui que eu já tinha deixado separado eu vou pegar o etanol Vou colocar aqui dentro que o etanol absoluto Ainda não Peguei deixar o etanol absoluto aqui e aí a gente faz a Gilson beleza vamos lá hoje aí tá aqui se você tiver ficar mais organizado esse aqui é o de etanol ver se ele tá lá E aí eu não vou pegar três vezes um ml três vezes colocar aqui no clube de etanol metanol é volátil então cuidado pra não deixar ele pingar tá tu faz aqui com cuidado não fica bebendo não Bom e é

bom deixar de muito tempo aberto também que senão ele vai evaporando tô aqui peguei três ml vou pegar 750 agora vou trocar para vou baixar aqui para 750 AM o sexo 150 Ah beleza então Aqui nós temos o etanol absoluto vou fechar aqui para mim levar curar e agora eu vou colocar um e 25 de água vou aumentar aqui para um de novo é um a caixinha que ela tá entortando pouco a ponta da minha ponteira É ruim vou pegar outro lado depois isso aqui tá um pouco ruim só que eu vou colocar é um

ml e trocar que eu encostei agora 250 micro litros que era um ponto 25 né 250 microlitros para ele ficar aí a no volume e na concentração correta a gente vai precisar lá na frente um protocolo lá nos últimos faço a hora que a gente vai fazendo a lavagem da amostra eu vou explicar com calma Oi gente vai utilizar esse passo agora tá entortando tá essa caixa não tá legal vou pegar até aqui com não e com cuidado depois desse aqui eu troco lá para não ficar utilizando ela então a mais 250 de água é

muito bem já tá noll o melhor jeito seu homogenizar solução para inversão só inverter aqui o o etanol 75 por cento e tá pronto é Inscrever aqui no tubo para não confundir etanol 75 por cento sempre fresco beleza vamos deixar em cubano aí mais um pouquinho bom e daqui a pouco a gente volta à mostra incubada já preparamos o etanol 75 por cento agora a gente vai levar a moça lá para centrífuga ela vai ser que fugas 12.000 G por acho que 15 minutos né a 15 minutos a 4 graus Celsius entre 48 graus celsius

e aí ela vai separar as Três frases que nos interessa aqui mas só de incubar veja só só dela ficar aqui em Cubana alguns minutinhos ela já começou a separar as fases já tem ali a fase aquosa a fase orgânica já começa a se separar agora com centrifugação a gente finaliza esse processo se por um acaso você tiver alguma dúvida Como utilizar uma centrífuga a diferença entre g e r f e RPM se você tem dúvida sobre isso tem uma aula aqui no canal no canal no YouTube né se você tivesse Sendo canal no YouTube

eu vou deixar o link aqui em cima o cartãozinho aqui em cima se você estiver assistindo no clube DNA eu vou deixar o link aqui embaixo a para você assistir E centrifugação aí eu explico tudo então ele vai entrar em detalhes aqui sobre a centrifugação aí eu explico tudo que você precisa saber é para fazer o seu procedimento adequadamente por quê que é a centrifugação tem a ver com gravidade com g e e um pouco é por isso que a Gente deixou à mostra aqui em cubano também e é por isso também sobre essa explicação

que eu dou a um vídeo que as fases já começa a separar antes mesmo da gente fazer a centrifugação é a ver com a gravidade a ver com G tem a ver com a Ester tem a ver com RPM eu vou lá vou levar para certificação agora a gente volta aqui para separação das fases Então vamos para a primeira rodada centrifugação são três no total esse protocolo tá primeiro para mim separar As três fases Tá bom então a gente vai começar aqui com o primeiro a centrifugação é 12 mil G 15 minutos quatro processo mais

ou menos entre 28 graus Celsius deixa ali bonitinho centrifugando e depois direto para a bancada para remover fazer a remoção da face superior o Tube já tá aqui dentro vamos rodar terminando de rodar que a gente já vai para para bancada e faça Separação das faz a retirada da face superior Beleza Nossa centrifugação ficou pronta nesse momento que nós estamos na parte mais delicado protocolo que a gente vai separar o RNA a morte é remédio todo o resto do meu Deus me celulares proteínas carboidratos lipídios assim por diante então é que tem que ser para

a gente é o momento que a gente decide que a gente consegue obter uma amostra purificado de verdade tá porque pelo seguinte eu entendo não centrifugação que é nós temos amostras separada em fases né Nós Somos as duas fases que a gente viu que começou a se formar lá só por pela gravidade mesmo que a gente as duas fases mas separadinhos bonitinho na fase aquosa nós temos o RNA que é a parte aqui de cima parte mais clarinha e a fase orgânica que a cor de rosa nós temos de vir celulares proteína as outras coisas

tá tem tivesse com amostra de verdade aqui e vem entra fácil ganhar orgânica em acorda nós vimos propriamente uma camada Uma terceira camada uma camada mais esbranquiçada e ela estaria o DNA então com esse com esse aqui gente consegue extrair tanto DNA com uma regata com proteína mesmo se a gente fosse trabalhar com DNA e RNA o RNA está na fase na camada superior gente a retirar essa camada guardar nem eu ganhar na fase de baixo que seria um filetinho branco ali Entre As Duas Faces só agora o segredo o seguinte só com bastante cuidado

para a gente ir Obter amostra bem pura já deixei dois tubos aqui separadinhos eu já fiz dois tubos escrevi neles que eu tô com tubo dois na mão até trocar para não para não ficar vai ficar certinho vou pegar o tubo um aqui depois centrifugação com as duas fases separadas vou abrir o tubo um deixar ele aberto aqui do lado vou deixar o outro tubo que vai receber a minha mostro Dr ar aqui separadinho também a e agora eu com bastante cuidado é aqui que tá o Grande Lance desse protocolo aqui com bastante cuidado que

nós vamos fazendo até se você tiver fazendo isso pela primeira vez eu recomendo que você trabalha e com a ponteira menor um app também na hora que eu tô trabalhando com tira no ap mil só pra gente não demorar muito mas tem que fazer esse passo com bastante cuidado porque é o seguinte vamos pegar na mostro mostro tá aqui separado duas fases você vai retirar chovesse para câmera pegar aqui certinho Você vai retirar é a fase superior que aonde está a amostra de RNA tu vai puxar aqui com bastante cuidado sem deixar a fase de

baixo a subir junto só que pensar somente a fase superior tá na dúvida se tá puxando a a parte de baixo também há a fase Rosinha você para É melhor aqui nesse caso dica de ouro é melhor nesse caso você perder amostra do que você pegar a morte de mais contaminado combinar com proteína Tá bom vamo pegar só a face Superior que eu estava renia passa por um tubo novo é neste momento aqui nós vamos fazer uma Purificação passei por tudo novo É nesse momento é exatamente nesse momento que tá acontecendo a publicação a Estações

fez lá atrás homogenização aqui aonde nós estamos purificando se apegar demais a morte demais por um acaso você ficar desconfiado que tá pegando a fase de baixo também para é melhor parar pegar - rma extrair - arranhado que extrair RNA Impuro tá bom porque esse protocolo giro EA Gente esse protocolo que tá utilizando que ele entende Extra em grande quantidade o já vai ter bastante quantidade 20 provavelmente estão aqui a ganância não pode falar alto não vamos ver se eu consigo tirar mais um pouquinho aqui com cuidado e já Tá misturando né eu tô falando

aqui bastante com vocês eu faço para começando a se misturar Mas na vida real você não vai ficar de bobeira aqui Esperando as fases se misturarem tô aqui eu fiz Tirei até onde eu me sentir confortável Eu não vou mexer mais deixa aquele restinho de a Reali para garantir que eu tenho aqui tá tá puro a gente vai fazer o mesmo procedimento agora com o assunto agora vamos fazer a segunda amostra eu vou fazer ela que imagem perto para você conseguir enxergar direitinho e tal tubo dela a segunda mostra tá aqui ó as duas fases

bem fôrma dinhos Vamos atirar Com bastante cuidado eu coloquei aqui na minha pepeta só para se ter uma ideia um pouquinho menos de 500 micro litros tá mas se você tiver em seguro faça coloca o volume menor e utiliza uma ponteira um app tá mais delicada aqui para a gente ir hoje que eu mandei monstração a gente vai para não perder tempo tirei com cuidado eu tô puxando da superfície né coloquei aqui a ponteira comecei a puxar da superfície eu me enfiei lá no fundão não vem com bastante cuidado bastante Cuidado para não misturar as

duas fases não fiquei mexendo no tubo na vida real você não vai ficar de bobeira falando fazendo outras coisas pega o que faz você tem que fazer e já passo para o tubo Lobo aqui do Brasil colocando na quantidade o volume é aceitar é como eu falei não precisa pegar tudo não pega a ganância aqui faz você perder o jogo você vai pegar amostra impura mas aqui acho que dá pra puxar um pouco mais ó é só puxar um pouco mais em Oi tá com Cuidado vou fazer um negócio aqui para vocês verem né que

pode acontecer quando você tiver pipetando começou a pipetar tá insegura aqui fazendo com cuidado e sentiu que puxou a fase de baixo esquece joga fora acabou não tem não tem conversa não tem problema prender a fase de perder um pouco de material deixa ali não vai não vai internação almoça por causa de alguns poucos micro se você quiser muito muito muito mesmo misturou é centrífugo só que de novo Porém para Centrifugar e você E aí você faz as duas fases novamente e retira a a fase com R A beleza com segurança tão feito isso está

pronto a gente não precisa mais ficar aqui na Capela e agora a gente vai mais trabalhar com esses materiais tóxicos a gente pode comprar uma pancada mais aberto e a gente consegue conversar com Nescau também nem vou precisar mais desse óculos aqui e aí a gente vai falar mais mais com mais tranquilidade a partir lá vão lá para bancada é a fase Crítica passou se Você retirou ali com cuidado a face superior agora a gente pode começar a precipitar o RNA vamos fazer a precipitação Dr agora cruzou preparar o absoluto e depois a gente vai

fazer a lavagem do RNA já purificada não é mais um passo além de purificação puder deixar ele livre de de proteína qualquer outro contaminante fechado então vamos começar eh com isopropanol agora primeiro passo para se precipitar o r a gente vai fazer Vamos colocar 500 500 mil cores de isopropanol absoluto misturar que coisa nós elas vão que o baile depois tem que folgar Vou colocar aqui os 500 micro isopropanol deixar ele aqui antes e abrimos um toque 500 micro litros de novo aqui são propanol é volátil também então cuidado aí na hora da pipetagem tá

ele vai pingar não fica de bobeira aí só vai pegar o volume e na de quatro claro que é que o volume é importante mas não é a Coisa mais delicada do processo é pingar um pouquinho tem grandes problemas tá então colocar aqui ó vou misturar depois no outro tubo eu vou mostrar em detalhes aí para vocês que que acontece aqui na homogenização talvez estejam vendo aí já mas depois eu vou eu vou dar um incluso aqui no que acontece na uma organização do isopropanol com a amostra eles vão fazer tipo chames cartãozinho aqui eu

vou deixar ele aqui do lado improvisado vou fazer outra moça agora lá um Cruz Aqui para vocês conseguirem enxergar que quando a gente coloca o isopropanol ele como está muito concentrado ele misturado com a mostra dá para ver muito bem as duas soluções e é se organizando Você mistura o isopropanol tá muito concentrado na amostra consegue ver as duas soluções homogene Zando muito bem ó eu vou pegar aqui de um jeito para vocês conseguirem ver o colocando a solução Tô vendo dá para ver os meus soluções ali ó coloquei isopropanol misturando com a mostra o

que faz uma organização Porque pretaji mesmo ou pendao bonitinho com cuidado Oi e aí aqui vamos deixar cubano um tempinho e depois vai para centrifugação que a gente vai deixar vai deixar em cubando por uns 10 minutos mais ou menos e aí depois a gente vai para centrifugação para fazer a precipitação de se arrumar Agora nós vamos para segunda rodada centrifugação essa rodada é importante também porque aqui é nesse momento que o RNA vai ser o precitado tô aqui no momento em que precipita isolando mais um passo de isolamento do rma e aqui tem uma

dica que eu deixei lá naquele vídeo sobre centrifugação que eu falei para você isso é só repetir aqui quando vocês forem centrifugar Não esqueça de colocar esse Pinha que voltado para fora lá no motor da centrífuga Único motivo se você fazer isso que você tenha certeza que o pele deformado se formar a pele nem sempre Pet visível ele vai estar numa localização conhecido aqui no tubo porque às vezes não vai formar aperte você se você centifugar indico alquímico qualquer orientação aqui no tubos vai saber onde que vai estar o pé é para te perder perder

um pouco da nossa então é uma ideia é uma dica que você pode fazer para garantir que não vai perder nada aí Da sua morte beleza aqui são tudo demonstração nosso Boo já tá aqui vamos rodar são 12 mil G por 10 minutos quatro graus Celsius em todos os graus Celsius 4° Celso valendo Beleza então agora aqui a o nosso RNA ele foi centrifugado e alta velocidade misturado com álcool isopropílico isopropanol absoluto tendência é que esse RNA ele tem essa precipitada ele vai ficar ali no fundo do tubinho como a gente colocou a gente organizou

o tubo ali orientado na Centrífuga ou Teoricamente sabe onde está este prédio que acontece que muitas vezes muitas vezes é normal a gente não visualizar o pé Leite nesse momento isso significa que tem colocar mostra que deu errado Nadilson é normal chegar no final desse desse passo aqui você não visualizar o pé likezinho no fundo do tubo só que se isso aí em termos anima continua continua protocolo como se nada tivesse acontecido como super estivesse lá normalmente vendo ali dentro Considera que ele tá lindo mesmo que ele não esteja que vai ser o nosso caso

para que ele uma demonstração né você segue protocolo normalmente que vai dar certo lá na ponta não não não desista nesse momento tá bom então a gente vai fazer agora retirar o uso o álcool isopropílico isopropanol jogar fora descartar me fazer a lavagem se perde com outra nosso 75 por cento e aí centrifugar de novo processo de lavagem E aí tá pronto para gente ressuspender Essa Mostra aí guardar né guardar em utilizar e depois Seja lá o que você for fazer Beleza então vamos fazer isso para a retirada do isopropanol pegar a mostra Teoricamente Então

quando você terminar de centrifugar como você colocou esse tubinho lá na centrífuga orientado né com a com primo dele aqui orientado você sabe você Você tem certeza absoluta que o pet ele vai estar concentrado desse lado aqui na a orientação do pinguim certo topete vai tá aqui mesmo que você Não conseguisse chegar você saiba que o pele está ali então você vai retirar agora o sobrenadante aqui com cuidado E vai retirar o sobrenadante contra a posição do pé tipo pra gente ele não se desfaz ele não vai se desfazer aqui com etanol pois o próprio

se você não vai se desfazer ele vai puxar converte e dificilmente você vai puxar para gente conseguir completar ele mas umas faça com cuidado para evitar que sai eventualmente você muito simples somente Quando você não enxerga o pele puxar ele perder nesse momento vai retirar aqui o sobrenadante vai tirando o dia devagarzinho da superfície profundo sem colocar a ponteira lá no fundão de vez vai retirando com cuidado hora que chegar aqui no fim né já descarta um pouco se quiser trocar até para uma ponteira mais delicada pode trocar para fazer esse passo aqui com mais

tranquilidade tira todo sobrenadante E aí que hora que a mente o que ela está Ali naquele cantinho o mesmo que você não esteja enxergando Então tirou todo isopropanol Beleza Aqui tá pronto não deixa ela aqui daqui a pouco a gente coloca a gente coloca o etanol 75 vamos fazer a mesma coisa para amostra 2 se retira com cuidado da superfície por fundo soltando em bolo da pipeta devagar sem encostar a ponteira ali na região onde Teoricamente encontro se o Perry Faltará camente o que talvez em alguns casos não tem amostra né um erro com o

seu pode ser que não tem Rosa mas geralmente não tem erro não vai dar certo tira que o a todos sobrenadante não precisa se preocupar em secar o tubo nesse momento eu não preciso que a gente vai fazer lavagem vai continuar conversando aqui tá bom então não tem grandes problemas loja de vai colocar um ml de etanol 75 por cento que eu já deixei ele até Aberto aqui os vídeos e foi que ele tá ok a gente preparou lá na capela no começo naquela primeira incubação e deixou-lhe prontinho já então agora que a gente vai

utilizar que é na Lavagem vamos pegar aqui um ml e o ML Bom dia tá nossa 85 porcento coloca aqui eu gosto de colocar aqui ó aqui ó na dica vai mas não é obrigatório eu gosto de jogar o etanol aqui já direto em cima do Pet E aí pode ser com Vigor mesmo porque é a ideia que ela Val R aqui tá aqui dentro né então coloquei aqui o etanol na Moção Vamos colocar na mostra 2 o etanol 75 por cento ele é 75 por cento porque não que graça tem que cinco porcento não

absoluto porque o RNA que já está precipitado você não quer prestar o de novo não precisa que já tá prestado mas ao mesmo tempo você quer para esse processo de lavar suficiente não posso ser absoluto senão o não vai Ter nada de solubilidade desse RM aqui e o etanol de fato não vai lavar se ele fosse 100% absoluto lavaria estou aqui para lavar tem que ser 75 já tem que ter um pouquinho de água misturar o show misturou aqui no pet agora é importante homogenizar só que muito bem se você tiver um voto a gente

Laboratório você vai vou ter que tá se você não tiver uma voz que vai fazer o aprender o capeta mais com, Tá bom eu volto aqui isso aqui que eu nem deixa ele preparado ver se Ele tá sendo tá ligado aí ele tá ligado já e fechar esse do bom aqui para não derramar e dá uma Vortex a daí vigorosa Deixa ele ver texano bem que vou tirar a caixinha amarela aqui para vocês conseguir enxergar melhor ou tá aqui para trás não deixa ele ver tô pensando bem pelo seguinte aqui o objetivo é você lá

vai se pede né o RNA e tá peletizado aqui Mesmo que você não enxerga tem que entrar em contato com outra Nossa 85 porcento eu tenho que lavar aquela hora que tá lavando fazendo qualquer outra proteína que seja associado qualquer outra empresa Tá bom então vou técnica bem e dá um spin né se não tiver o espinho é que é bom fazer se quiser fazer dentinho dar um spin Mas tira o excesso de de etanol e da parede do tubo e agora a gente vai direto lá para centrífuga e fazer a última rodada de Centrifugação

que a depois essa lavagem vamos lá última rodada de centrifugação agora a gente vai fazer a lavagem do pele e curta Nossa 85 porcento vai lavar aqui é uma centrifugação mais direto agora ela vai ser por 7500 jeito 5 minutinhos 4 graus Celsius também é só para fazer a lavagem importante mas tem que fazer lavagem Renata Renata precipitado Olha gente vai retirar qualquer resíduo de impureza proteína Olá seja associada com a molécula é Nesse parte de lavagem vamos lá mostra tá aqui dentro última rodada valendo fizemos a última rodada de centrifugação Teoricamente amostra agora está

lavada bonitinha pronta para você ressuspender lá e se vender colocar novamente essa essa mostra de RNA em solução porque a gente precipitou é como ele tá na álcool isopropanol depois lavando com etanol agora a gente vai ressuspender colocá-la novamente em solução para você possível Que me passa aí de controle de qualidade é com as suas reações mesmo que você for fazer Tá bom agora o próximo então próximo passo é retirar o etanol guenta nosso 85 porcento que a gente utilizou para lavar a gente pode retirar aqui inclusive no Passo anterior também né que a gente

utilizou isopropanol você pode retirar com a pipeta como eu mostrei para vocês com cuidado ali puxando de cima para baixo para não mexer no pet mas muitas vezes Principalmente você consegue visualizar o pet você não precisa ter Se Curar todos você pode é simplesmente botar colocar o descarte aqui você pode simplesmente pegar a mostra que acabou de centrifugar tá lavadinho o pele vai tá aqui no cantinho né se você estiver visualizando ele que você pode simplesmente inverter aqui ele removeu o Wesley vai estar mão e o isopropanol também Mas faça isso você tivesse Visualizando super

visualizando não tem porque é arriscar né apesar de ser bem difícil do Palete de estranho dele do fundo tá bom inverte aqui agora o seguinte o fez isso que você pode fazer é retirar o excesso de dia tanol agora o etanol não nos interessa mais vai retirar o excesso de etanol você pode fazer isso ali encontra no sentido oposto do da localização do Pet e tirar esse excesso com cuidado né agora a gente não quer Mexer no pele ti e faz isso para um e faz isso para o outro e agora você vai para remover

o excesso final aqui nesse Sobral que Possivelmente Sobradinho canal aqui no seu tudo vai deixar secando ali tampinha aberta mesmo deixando encontrar diabetes pode deixar ele no papelzinho se quiser tirar um pouco do excesso do etanol que tá aqui na tampa aqui batendo Pode pode deixar aquele um secando na num papelzinho Mas você quiser deixar lhe cercando simplesmente na bancada com um tubinho aberto pode deixar secando aqui também protocolo fala que você deixa Até Dez minutos só que aqui tem um segredo Aqui tem uns um na dica de ouro para você sabia que Diogo a

seguinte você secar de menos aqui você não secar no eliminar o etanol suficientemente ele vai acontecer outra nova vai continuar apresentando só Mostra e esse excesso de etanol pode prejudicar se você as suas lá na frente a análise e controle de qualidade vai prejudicar ação enzimática lá na frente o excesso de etanol nesse momento ele pode o passo a associação na frente ao mesmo tempo se você secar excessivamente esse pele tsr Natalie tirar e vou remover todo ele não consequentemente você resseca ele vocês vai ressecando a sua mostra e quando você resseca na hora de

Ressuspender de recuperar E solubilizar essa mostra a o processo ficar mais difícil é o rendimento da estação lhe cai tão não pode secar pouco não pode sercar demais é o meio tempo protocolo fala até dez minutos eu tenho o número mais porque aqui para mim sempre funcionou pode estar no seu laboratório 4 minutos 4 minutos na bancada secando aí guritinha é o sente Deus quatro minutos a gente vai para o último passo que é o penúltimo passa na verdade tem Um passo ensinando que você pode fazer ou não mas basicamente último passo que a ressuspender

é só mostra com pé com água com outro tampão vou esperar em que o bar EA gente já volta brincou o tempo que você determinar em seu laboratório aqui para mim quatro minutinhos tá de volta a mãe vamos ressuspender essa mostra homogenizar a água tem na verdade é que o seguinte ó como você vai responder essa moto vai ser uma solução que você vai determinar Pode ser água pode ser ter que é um tampão composto por trilha de terra outro tampão o seu luta é você que vai determinar Qual é o teu pão que você

vai utilizar para ressuspender Como que você vai saber assistir o vídeo que eu vou deixar aqui em cima para quem tá no YouTube para quem está no clube Daniel vou deixar o link aqui embaixo no vídeo onde eu explico qual qual solução que a mais adequada para você tem tem um porquê de você escolher a água ou até os Tampão Beleza então assistir os vídeos aí para você fazer com segurança aqui ele vai fazer com água e vamos lá vamos colocar o volume aqui o protocolo não fala exatamente o volume a gente vai colocar de

água mas geralmente em 30 de 20 a 50 micro litros de tampão de água que funciona bem vou colocar 30 micro litros aqui que geralmente é o volume legal para gente fazer os próximos passos só que simplesmente vão pegar a água 30 microlite já tá ali Cotado aqui bonitinha porém também que eu disso vamos ali onde está o pallet naquela porçãozinha lá na bundinha do tubo Onde está o pele ti joga a água ali dentro e aqui ó homogenização tem que desfazer o PEP se você estiver enxergando o pé net no seu caso tem que

desfazer o pet aqui tá vai homogene Zando aqui até ele se desfazer até ele desaparecer ele ficar invisível completamente solubilizado na água então sempre vença nesse momento sem preguiça Nesse momento faz homogenização aí até você garantir que o Perry está de se você não tiver enxergando parte fica nesse tempo que eu tô aqui fazendo mais ou menos que com certeza é feito isso tá pronto aqui já o ideal é você oi para o próximo passo que eu já vou explicar ou guardar o colocar no gelo Tá bom já vou falar sobre isso daqui a pouco

só um fazer a outra mostra antes há 30 micro litros de água aqui na segunda morte a mesma coisa ou homogenize aí muito bem se desfaz o pet e sem preguiça com cuidado a garantir que a sua mostra foi solubilizada fui ressuspendidos de facto Tá bom agora basicamente você tem duas opções versão tá pronto pegar pegar essas amostras aqui de guardar Vou colocar um gelo para você seguir para os próximos passos você guarda essas amostras depois já no menos 20 aí onde você for mas é na Ou você tem a possibilidade também de se for

para esse difícil de desfazer se você quiser garantir aquele pele se não for solubilizado pode incubar a 60 graus Celsius no banho-maria um banho ser comer supõe que o barco 60 graus Celsius por um tempo ele para garantir que aquela aquele RL foi de fato sobre mim usar só nossa foi rede de fato ressuspendidos beleza Mac brigadão demais aí por vocês terem Disponibilizado esse laboratório aqui para mim foi uma gentileza no fundo do coração obrigado eu agradecendo vocês e em nome das pessoas que estão aprendendo aqui também com o da prática vendo na prática o

que faz esse tipo de extração então brigadão a duração e Obrigado você também que ficou até agora aqui comigo assistindo esse protocolo Espero que você tenha gostado Espero que você tenha aproveitado esse vídeo se você gostou compartilha com um amigo porque você vai Fazer a gente distribuição conteúdo com mais facilidade você vai fazer com que a gente alcançar mais pessoas e democratizar o conhecimento que muitas vezes por muito tempo ele foi muito fechado que são as técnicas de biologia molecular tem outras coisas relacionadas a genética biotecnologia e assim por diante o seu do educação vai

saber o mal a gente se vê no próximo vídeo tchau tchau tchau [Aplausos] [Aplausos] E aí