Carlos Menck: O Que é CRISPR-Cas9?

[Música] bom eu queria começar a minha apresentação para lembrar que nós tivemos em 1960 até 1970 a primeira publicação foi 1971 do Werner harb Ah tinha tava tendo um trabalho Que Se eu chamasse anunciasse aqui na biomédicas que é assim um centro de pesquisa por Excelência pesquisa básica etc e tal se eu anunciasse estudos de defesa de bacteriófago para ah em bactérias ia ter cinco gato pingado cinco e ainda assim reclamando ainda assim reclamando e no entanto isso deu a toda a engenharia genética que mudou a sociedade quer dizer se hoje tem fármacos tem uma

série se a gente hoje tem Genoma sequenciado se a gente tem uma série de avanços é por causa de uma pesquisa básica muito clara que foi feita na década de 60 e comecinho da década de 70 bom isso aconteceu naquela época mas gente ninguém esperava que ia acontecer de novo mesma coisa mas foi absolutamente idêntico que aconteceu Ah o Instituto pter Sobretudo o Instituto paster tava trabalhando com o quê sistema de defesa de bactérias contra bacteriófagos exatamente a mesma coisa e que se na década de 90 ou mesmo 2010 eu chamasse aqui uma palestra sistema

defesa de bactérias contra BA os cinco gato pingado a gente tá mais que 100 aqui certamente tá para ouvir falar de crisper cas e a razão pela qual vocês estão aqui é que essas duas mulheres elas na época eu já vou falar isso já se sabia que era um sistema imunológico de bactérias e elas foram tentar desvendar o mecanismo gente elas não são empresárias elas não são batalhadoras da Inovação fizeram Inovação de primeira linha elas são pesquisadoras básicas que elas se reuniram para desvendar o mecanismo que tava envolvido nessa defesa da das bactérias Esse é

o paper que foi publicado então em agosto na Science agosto de 2012 eu já vou deixar para vocês o seguinte tem prêmio NOB na parada vai aparecer prób tenho quase certeza que nos próximos anos muito rapidamente elas duas são candidatíssimo alguns sites americanos Se você entra lá e curiosamente estão deixando elas de lado Ah então não sei acho que elas se garantem aliás eu estive numa conferência final de semana nos Estados Unidos e um pesquisador falou que estudou com a Jennifer DNA então a Emmanuel chapan ela é francesa que tá trabalhando na Suíça e na

Alemanha e a Jennifer é americana e esse americano teve aula com ela e ele falou que isso na década de 90 disse que as aulas foram brilhantes foram maravilhosas Eu acho que isso é importante bom que que é crisper e que nome chato quer dizer agora tá começando a ficar ok né que a gente tá se acostumando então crisper é o nome que a gente tá se acostumando agora né Então esse é o l crisper e basicamente eu lembro que a gente tinha visto isso eu acho que na chela ou na chant omonas quando sequenciou

na década 90 gente é uma sequência muito chata é um monte de repetição repete repete repete e com alguns espaçamentos e isso é um negócio assim que no fundo é não tem muita graça na época a gente achou isso não deve se valer servir para nada que bobo né havia ter ido atrás Ah isso foi identificado em 1987 em genomas bacterianos que tinham essa sequência e ganham esse nome clustered regularly interspersed short palindromic repeat então ganhou Esse nome que ficou o crisper que a gente tá começando até a acostumar agora né agora até vai mas

C Nosa é feio e próximo a essas sequências nós temos também os genes cas que correspondem as nucleases cas representam crisper associated proteins tá que são nucleases na verdade já vou explicar um pouquinho melhor isso Então essa é a razão tem alguns colegas estavam falando que era caspase não não tem nada a ver com caspase é crisper associated isso em 2012 elas Descobriram que essa cas tem uma atividade nuclease em 2013 o pessoal começou a propor isso para fazer edução de genomas de uma forma genérica já vamos falar um pouquinho mais sobre isso Então essa

é cronologia Deixa explicar um pouquinho como é que essa tal da imunização bacteriana aquilo que vocês não queriam saber mas que agora vocês querem acho bom o fago infecta e eventualmente algum desses fagos sem lisar a bactéria eles são processados o DNA deles e o DNA é integrado pedaços deles são integrados no Genoma e ficam exatamente nessa região do genoma da Cris perc e aqui você tem repetições essas repetições espiam vários DNA que são na verdade sequências de vários fagos diferentes tá bom são as sequências do fagos que estão aí isso é a memória imunológica

do crisper e a partir dessa sequência é que ele vai conseguir chegar a reconhecer o fago Quando ele entrar quando o fago infecta uma bactéria depois pode ser décadas pode ser milênios depois se ele tá com memória tá lá vai se produzir RNA do Pré crisper esse RNA vai conter entre outros rnas uma sequência que é ah similar a do bacteriófago se é similar ao do bacteriófago ela pode hibridizar com ele e é exatamente isso que nós vemos então ela sintetiza esse RNA sintetizado pelo crisper vai identificar uma sequência homóloga do fago E aí a

cas vai vir e vai quebrar o fago E assim a bactéria fica resistente ao bacteriófago Essa é a base do sistema crisper cas assim que dá a a o processo de eh de corte é só isso é isso que é Emmanuel Sarti charp charpentier e a Jennifer dner Descobriram que a cas Ela cvavr poderia ser utilizado em outros dnas dnas que não são mais de bacteriófagos que a gente pode tentar controlar esse processo e usar ele para clivar DNA humano por exemplo DNA de outras bactérias Mas de repente DNA humano e isso foi demonstrado pelo

grupo do Feng Zang é é um sino americano é outro que é candidato a nóbel também o Feng Zang ele foi ele que descreveu que isso era possível de editar genomas e demonstrou que isso era possível fazer em células humanas esse esse cara tem menos de 30 anos ele fez coisas absolutamente fantásticas já eu vou mostrar mais alguma coisa que ele fez que nós estamos usando inclusive Ok esse aqui é 2013 tá bom bom então basicamente o que eu falei para vocês é que a cas ela é uma a uma enzima que cliva numa região

específica específica definida pelo RNA guia então se eu conheço uma sequência do Gen eu faço a célula expressar aquele RNA guia e aquele RNA guia vai guiar a nuclease para clivar ali tá é isso que eu falei para vocês bom mas com isso você pode fazer um monte de outras coisas você pode chegar por exemplo ah modificar o gen imagina que você faz ele clivar isso é reparado pelo sistema tinha que ter reparo no DNA gente porque eu trabalho com DNA tinha que ter repara só que ele repara malfeito e eventualmente coloca mutações se essas

mutações vão fazer a perda daquela atividade para você poder estudar a função daquele Gene tá ou eventualmente aquele Gene ele já tá com uma mutação que dá um problema qualquer que dá uma mutação que dá uma doença hereditária ele vai a crisper vai corrigir vai clivar e ao mesmo tempo você coloca na célula um DNA que por recombinação homóloga ele pode entrar na posição da quebra e eventualmente você vai poder modificar corrigindo aquele Gene Então isso é uma das formas que você pode trabalhar com crisper cas Mas você pode trabalhar de outras formas também você

pode simplesmente colocar a cas é uma proteína a cas foi feita fusionada a outras proteínas por exemplo a repressora gênicos de forma que você pode reprimir genes com a ca porque a ca está sendo direcionada para aquela região Eles tiraram a atividade nuclease e colocar uma atividade de repressão daí vai reprimir o gene ou ativar o gene Eu quero ativar genes em posições específicas daí eu direciono a cas para um promotor gênico o promotor gênico o RNA guia vai ficar lá RNA a o RNA vai vai vai hibridar a cas vai reconhecer aquilo só que

em vez de clivar ela vai aar o gen então tem uma série de coisas que podem ser feitos com o mesmo sistema crisper C apenas você tem que meer nisso você po fazer magamento você pode purificar genômico porque é um sistema de reconhecimento de sequência basicamente é isso que a gente usa da imunidade bacteriana ok aqui eu queria só para garantir que torm in eu quero pedir a paciência de vocês qu minutinhos de filme basicamente Ele tá dizendo Aí que esse é o sistema do de de prevenção de proteção a vírus né na bactéria tá

colocando aí o DNA do fago que quando a bactéria detecta ela produz sequências de RNA pequeno na verdade são duas sequências que contém tem a sequência do bacteriófago e então ela hibridiza e a cas CVA quebra o DNA do vírus tá mostrando como quebra o DNA inativa o vírus Isso é o que dá resistência da bactéria ao vírus E aí ele tá propondo de de usar isso de outra forma agora ele tá fazendo em cima do alvo que eu escolho o alvo de que eu escolho eu como pesquisador escolho ele é clivado tá aí o

sistema de reparo que pode induzir mutações e isso pode fazer com que você tenha knockout para estudar função aqui ele tá ele vai propor de você colocar um DNA mais de forma que esse possa através de um processo de recombinação homóloga modificar o Genoma naquela posição que vocês têm o RNA guia isso pode ser feito em células normais ou pode ser em células tronco pode ser feitos em em embrião pode criar animais noout do jeito editados eu prefiro dizer editados de uma forma geral você pode usar mais do que uma do que um alvo você

pode usar vários alvos ao mesmo tempo de forma que você pode estudar doenças complexas e pode ser utilizado não só em pesquisa básica mas também em outros tipo de de atividade bom eu vou fazer simplesmente alguns exemplos de coisas que foram que tiveram até o impacto na mídia e que São relativamente importantes Então esse é um paper que foi publicado em que foi feita a correção de fibrose cística que é uma doença genética humana então isso foi feito em princípio nas células tronco induzidas de entes que T essa deficiência então ele foi corrigido nessas células

eventualmente essas células podem retornar ao paciente para ele poder chegar ter as células corrigidas Ah esse aqui foi feito a mesma coisa também para pacientes fibrose cística mas em células tronco já em organoides que o pessoal acha que pode colocar de forma a fazer órgãos e definidos Em algum momento você consegue corrigir o Genoma é um grande passo saiu na mídia alguns dias atrás na verdade é uma continuação desse trabalho de que eles com células de pacientes HIV com a crisper Eles simplesmente cortaram o Ah o HIV tirando o HIV fora das células e eles

conseguiram um sucesso de 95% das células de um modelo animal tá a Ah o professor al milker da UFRJ está fazendo uma coisa similar só que ele tá fazendo knockout no correceptor no ccr5 para HIV então A ideia é que vai pegar células de de pessoas contaminadas com HIV tirar essas células do sistema hematopoiético sistema imunológico clivar o receptor de forma que essas células vão ser resistentes ao HIV e voltar para o paciente Essa é a ideia que tá sendo feita aqui no Brasil ah já Desde 2005 eu sou editor da revista excelente revista genética

molécula biology aproveitar fazer propaganda Ah e Desde 2005 a gente tem visto uma invasão chinesa na ciência É impressionante como eles estão invadindo mais recentemente a gente vê isso de uma forma muito clara com trabalhos de primeira linha feitos na China antes era os chineses nos Estados Unidos agora é feitos na China e agora eles são rápidos no processamento de questões éticas e coisas assim então eles eles simplesmente eles fizeram alguns trabalhos absolutamente fantásticos que fizeram um deles foram criar modelos animais então nós temos gente quem tá fazendo a o curso de pós que eu

tô dando sabe que para fazer um animal knockout é difícil fazer desde 87 foi desenvolvido um sistema para fazer isso mas faz com camundongo E é difícil fazer eles acabaram de fazer o animal knockout só que o animal é um primata é é um macaco que agora ele é knockout para um determinado gene e os animaizinhos estão vivos e funcionou tudo certo gente agora você tem não preciso dizer que tem tem um modelo animal muito mais próximo do ser humano com todas as questões que vão ser levantadas e discutidas mais tarde aqui nesse nosso simpósio

ah na agropecuária o avanço é fantástico você pode simplesmente ter porcos Como foram criados resistentes a infecções virais porque simplesmente foi nocauteado o receptor desses porcos imagina gente deixar bem claro de des já que nós vamos discutir isso mais tarde desde já você pode fazer isso de forma transiente você passa o Cris perc de forma que você vai ter uma mutação e não vai ter nenhum Geninho Extra nas células daquele indivíduo nada você vai ter simplesmente a mutação só isso então não é um animal transgênico o processo é transgênico mas o animal não é transgênico

os chineses fizeram também um trabalho que eu achei muito interessante um paciente com câncer de pulmão câncer de pulmão quem não sabe é devastador ele é um ano um ano e meio a pessoa eh de se for pego eh se não for pego muito cedo a chance de sobrevivência é muito pequena e o que foi feito nesse paciente na China foi que pegaram as células do sistema hum atopo ético dele sistema imunológico as celas tronco cortaram esse Gene pd1 que depois a luris vai dizer o que que serve Mas é uma espécie de freio pro

sistema imunológico de uma forma geral de forma que a células do sistema imunológico não ah nos protegem contra o tumor e a ideia é que cortando fazendo knockout desse Gene e voltando essas células para indivíduo esses indivíduo ele terá mais chance de ter uma resposta imunológica forte contra o tumor você vai dizer ah mas ele pode ser que tenha problemas depois problemas Auto imunológicos depois é possível depois mas ele vai sobreviver à doença dele então esse trabalho tá sendo feito ah Nós também vamos ter oportunidade de discutir isso mas agora sim apaga a luz de

novo por favor em insetos você pode simplesmente fazer knockout de genes e E aí tá muito ruim isso mas o noout é o azulzinho aqui tá ele teria um gen daí ele vai ter uma herança ele vai se espalhar o knockout se você espalhar na natureza ele vai se espalhar só que se você deixar a tesourinha Agora sim é Trans Se você deixar a tesourinha no organismo essa tesourinha também vai se espalhar não só de um modo dominante porque ela vai clivar como cada descendência que normalmente teria só um dos genes nocado vai ter os

dois genes nocauteados então ele vai espalhar essa herança muito mais rápida de forma que você pode ter Esses mosquitos imagina mosquitos que não conseguem eh ser que não são infectados por zica por exemplo e você Jogando na natureza eventualmente Você pode ter todos esses animais uma população inteira que simplesmente vai continuar sendo mosquito vai continuar sendo chato mosquito mas não vai carregar o zica não vai carregar dengue e coisas do gênero esse chama jein drive nós vamos ouvir falar mais sobre jein drive aqui obviamente isso está sendo feito existe muito interesse no Brasil eu acho

assim vocês estão demonstrando interesse Mas vocês boa parte de vocês já ouviu falar o que é crisper C ah Provavelmente em dois ou TR anos vai virá tipo aula de primeiro ano na na Biologia na biomedicina e todo mundo vai saber o que que é e as pessoas vão estar boa parte dos laboratórios vão estar usando o Cris perc porque é muito poderoso porque ajuda muito é uma tecnologia muito poderosa mesmo e a Embrapa tá fazendo isso bom eu só para chamar atenção que nós usamos no nosso laboratório dois sistemas de ativação gênica ou de

knockout mas só só que nós usamos isso de forma de fazer um screening genom Wire quer dizer genérico ou seja foi feito o Zang de novo ele fez duas bibliotecas que são livres quer dizer você pode comprar na Ed de dinin e é barato é relativamente barato e e você recebe Só que você tem que daí fazer amplificação são duas bibliotecas que contém o crisper de forma que você tem crisper com para todos os 20.000 genes humanos na verdade a biblioteca de knockout que simplesmente faz a clivagem ela tem três alvos para cada Gene Então

são 60.000 Clones Ah é uma biblioteca não é Clone e ele também fez a mesma coisa pros 20.000 genes mas colocando como alvo o promotor de todos os nossos genes de forma que se ativa esses genes e se você colocar isso em cultura celular você vai ter uma cultura celular que vai est ou nocauteada vai ter células na sua cultura que vai estar nocauteada em todos os genes ou vai estar ativada em todos os genes então basicamente no nosso laboratório O interesse é trabalhar com crisper de forma a combater célula tumoral a gente trabalha com

agentes que lesam o DNA tá e que por isso causam morte no na ah na célula tumoral são agentes quimioterápicos normalmente utilizados no caso temos lamida é utilizado para tratamento de glioblastoma tá o que a gente fez foi com temos lamida e a ideia é que as células a gente trata essas células ou com a biblioteca que faz o knockout ou com a biblioteca que faz ativação gênica Ou uma ou outra e depois a gente simplesmente mata as células com di e ver aquelas que sobreviveram aquelas que sobreviveram elas vão estar enriquecidas com o cas

seja que ativa genes ou com o cas que inativa o Genes E aí você consegue sequenciar isso com sequenciamento de Nova Geração E aí no sequenciamento de Nova Geração você sequencia e você consegue verificar quais eram os genes que ajudaram a células a sobreviver a a TMZ isso para identificar vias relacionadas à Resistência a quimioterapias de forma a gente poder entender melhor como que os tumores acabam Resistindo à nossa quimioterapia ver se a gente consegue chegar a evitar isso ok basicamente eu não vou chegar a entrar em detalhes mas basicamente entre os genes top para

ativação entre os gen genes knockout nós temos as gênes que que a gente já sabia que deveriam est lá ou seja funcionou bem como controle para isso mas a gente tem uma quantidade enorme de genes novos obviamente o que a gente mais interessa são os genes de reparo Então essas vias de reparo nós estamos estudando agora como vias de reparo que tão que dão resistência a quimioterápicos essas são as a as vias que a gente viu para ativação opron Cult de forma que você tem reparo e mmet isso já era conhecido que dá resistência ou

a gente tem nrf2 que também é eh conhecido mas a gente tem outros genes e outras vias que estão envolvidas nesse processo e a gente tá estudando isso esse trabalho foi basicamente o trabalho que a Clarissa desenvolveu que o André chimura tá tá continuando Ok ah Nós nos reunimos no final do ano passado na pró-reitoria de pós-graduação e com um grupo de pesquisadores daqui da USP mas nós fizemos um documento que está no jornal da USP foi publicado no jornal da USP ontem na verdade em que a gente discute explica um pouco e a gente

discute um documento da USP em relação a isso e basicamente a ideia a conclusão que a gente chega que eu gostaria de trazer aqui para vocês que vai permitir mais discussão é que a gente deve desenvolver trabalhos de pesquisa na área com utilizando essa tecnologia deve fazer isso deve fazer isso com cuidado existem normas a gente vai discutir mais isso mas basicamente Essa foi a conclusão da gente que a gente deve estimular discussões permanentes e aprofundadas por tempo por isso nós estamos fazendo isso Ah o ano passado nós recebemos dois parlamentares franceses que eles vieram

para ouvir os professores da USP a respeito do assunto eu particularmente Gostaria muito que os nossos políticos tem um risco aí né associado mas que gostaria que os nossos políticos também pudessem de certa forma ouvir e a gente precisa estar representado nos Congresso Nacional eu tô em defesa da gente ter uma frente parlament ativa de defesa da ciência no Brasil crisper é uma pecinha Ness nesse ponto e eu queria agradecer as agências de fomento obviamente que tem permitido a gente fazer alguma coisa no laboratório e agradecer a vocês principalmente obrigado gente