o Olá pessoal tudo bem Hoje nós vamos falar sobre homem cima que integra duas vias bastante importantes do metabolismo mitocondrial nós vamos fazer a caracterização da enzima succinato desidrogenase uma Flávia proteína que participa tanto do ciclo de Krebs quanto da cadeia transportadora de elétrons na membrana mitocondrial interna mas vamos ver como é possível utilizar aceptores artificiais de elétrons para desviar o fluxo de elétrons que passa por essa enzima como sempre prepare as suas anotações e acompanha o protocolo do experimento através do livro didático ou do material disponibilizado pelo seu professor depois de uma breve explicação
teórica nós vamos fazer um experimento de hoje uma boa aula a todos muito bem pessoal Vocês já viram na aula teórica que a enzima succinato desidrogenase também pode ser chamada de complexo dois da cadeia transportadora de elétrons ou de ubiquinona oxidorredutase os seus papéis é transferir elétrons para as moléculas de biquíni na na membrana mitocondrial interna essa enzima representa a integração do ciclo de Krebs aonde o suco sinato será oxidado até fumarato com a cadeia transportadora de elétrons uma vez que os elétrons provenientes da oxidação dos oficinato serão transferidos para uma molécula de Flaviana adenina
dinucleotídeo Fábio que será reduzida até tarde H2 ainda no complexo dois esses elétrons serão transferidos para o centro ferro-enxofre da proteína e posteriormente a seguiram para a redução da ubiquinona transformou bithionol e dar continuidade a cadeia transportadora de elétrons até o aceptor final de elétrons que é o oxigênio essa enzima succinato desidrogenase Como o próprio nome já diz tem como substrato oxidado um dos intermediários do ciclo de Krebs um composto muito parecido com o succinato de chamado de malonato tem a capacidade de atuar no sítio ativo da sua assinatura desidrogenase como um inibidor competitivo ou
seja na presença do malonato a em o Renato no sítio ativo da sua assinatura desidrogenase fica prejudicado impedindo portanto que ele seja convertido até fumarato consequentemente impedindo a redução do FAD até fazer H2 e interrompendo a respiração celular ou seja interrompendo a cadeia transportadora de elétrons nessa etapa nós podemos verificar o funcionamento da enzima succinato desidrogenase no laboratório utilizando substâncias chamadas de receptores artificiais de elétrons ou seja nós podemos desviar o fluxo de elétrons que teriam como aceptor final o oxigênio lá no complexo quatro da cadeia transportadora de elétrons para a sectores artificiais que podem
ser introduzidos nas reações esses aceptores artificiais elétron possui um valor redox que favorecem com que os elétrons sejam transferidos para eles ao invés de serem transportados para os co-fatores de enzimas para molécula de fadinha que seria transformada em fase H2 um exemplo de molécula que funciona como um aceptor artificial de elétrons é o 235 trifeniltetrazolio essa substância quando nossa forma e tem cor amarela bastante Clara praticamente transparente quando reduzida entretanto Ou seja quando recebe elétrons de alguma reação o trifeniltetrazolio se transforma em preferiu formasan na que é um composto que tem cor vermelha bastante intensa
portanto se nós fizemos um sai enzimático utilizando a sua assinatura desidrogenase junto com seu substrato succinato e adicionarmos o trifeniltetrazolio a esse meio de reação nós podemos observar 6mm está realizando a oxidação dos oficinato até fumarato desviando os elétrons que seriam utilizados para reduzir o Fábio para reduzir o tetrazólio se essa redução acontecer o tetrazólio vai virar formosana e o meio vai ficar vermelho se alguma coisa interferir nessa reação enzimática entretanto não vai ser visualizado nenhum composto de cor vermelha no experimento Então é isso que nós vamos fazer no nosso único experimento de hoje nós
vamos utilizar uma suspensão de mitocôndrias obtida de fígado de rato para observar o comportamento da sua assinatura desidrogenase em diferentes condições cá o que nós vamos utilizar a seguir terá uma composição diferente então para que você compreenda bem O que está acontecendo nesse experimento deu uma olhada com bastante cuidado na tabela de composição dos seis tubos de ensaio que nós vamos utilizar muito bem pessoal então no nosso tubo um nós vamos ter apenas tampão fosfato PH 7,2 solução de sucos inato que é o substrato da nossa reação e o tetrazólio 0 25 ml de tetrazólio
e se tu vai ser o nosso turno Branco uma vez que nós não vamos colocar a suspensão de mitocôndrias ou seja não vai ter a sua assinatura desidrogenase nesse túmulo e no tubo 2 nós vamos ter também tampão nós não vamos colocar a solução de sucos Renato nesse tubo 2 portanto nós não estamos adicionando o substrato da reação nesse túmulo nós vamos colocar o tetrazólio e nós vamos colocar 0,2 ml de uma suspensão de mitocôndrias frescas funcionais o YouTube três além do tampão nós vamos ter o succinato que é o nosso substrato também vamos ter
o tetrazólio Nossa receptor artificial de elétrons e nós vamos colocar a 0,2 ml de uma suspensão de mitocôndrias servidas Você já sabe o que acontece quando a gente aquece uma proteína Então já sabe o que vai acontecer com a sua assinatura desidrogenase que vai estar presente nessas mitocôndrias o último quatro nós vamos ter o tampão também vamos ter o suco sinato também vamos ter o tetrazólio e vamos ter 02 ml de uma suspensão de mitocôndrias frescas funcional portanto como vocês podem notar o tubo 4 vai ter todos os componentes necessários para que a reação se
processe de forma plena vai ter a enzima funcional tem o substrato e vai ter o aceptor artificial de elétrons a essa altura do curso a gente já pode prever o resultado que a gente vai ver nesse tubo 4 o tubo 5 e outubro seis pessoal eles são praticamente idênticos com uma diferença bastante importante ambos vão ter 0,2 ml de uma solução de malonato Cês já viram que eu malonato é um inibidor competitivo da succinato-desidrogenase a diferença entre o tubo 5 outubro 6 é que o tubo cinco vai ter 0,1 ml da solução de fluxo Renato
0,1 ml da solução do substrato próprio da enzima Oi Ju tudo cês vai ter dez vezes mais a quantidade de sucos inato ou seja nós vamos colocar 1 ml da solução de fixe Nato então ambos vão ter uma Lonato mais a concentração de sucos inato no tubo 6 vai ser dez vezes maior Então vamos lá para bancada preparar esse experimento e ver quais são os resultados que nós vamos obter e não é que a gente começar o experimento propriamente dito nós precisamos preparar uma amostra de suspensão de mitocôndrias servidas que vai ser utilizada em um
dos nossos tubos para isso nós vamos pegar 0,2 ml da nossa suspensão de mitocôndrias e vamos solubilizar em 3 ml de tampão fosfato PH 7,2 e essa solução essa suspensão de mitocôndrias no tampão vai ser fervida durante 10 minutos vamos preparar esse tubo é tão 3ml da nossa solução tampão e 0,2 ml da nossa suspensão de mitocôndrias 10 2 ml da suspensão de mitocôndrias o Tom a gente agita e esse tubo aqui com essas mitocôndrias vão agora ser servidas por 10 minutos então vamos colocar elas lá no banho-maria tá darmos prosseguimento ao resto do experimento
eu tô muito bem pessoal já fervemos a nossa suspensão de mitocôndrias passou dez minutos no banho maria a 100 graus e agora a gente já pode realizar o nosso experimento com todos os tubos que nós vamos verificar hoje então eu já deixei separado aqui vocês tubos que nós vamos usar em todos eles Eu já coloquei o tampão nas quantidades que vocês viram na tabela todos eles também já tem a solução de subs inato de sódio - ho-ho tubo 2 o tubo 2 não tem isso piccinato então o tubo 2 vai ser o tubo que a
gente não está colocando o substrato da nossa em cima os demais tubos vão ter 0,1 ml de solução de socos inato menos o tubo 6 que vai ter um ml de tampão de solução de fluxo inato tão lembrem-se o dois não tem nada disso piccinato os seis tem 1 ml da solução de socse Nato e o tubo 134 15 tem 0,1 ml da solução de succinato do nosso substrato Eu já coloquei também todos eles 0,25 ml de solução de trifeniltetrazólio que o nosso aceptor artificial de elétrons e no tudo cinco minutos seis já foi colocado
também 0,2 ml de malonato tão tubo um dois três e quatro não tem malonato o tubo 5 outubro 6 vão ter 02 ml de malonato solução de malonato a única coisa que falta a gente adicionar os tubos agora é a nossa enzima que se encontra na solução na suspensão de mitocôndrias bom então no tubo nós não vamos adicionar nenhuma mitocôndria não vamos adicionar nenhum ml da suspensão de mitocôndria no tubo 2 4 5 e 6 nós vamos utilizar a solução ou a suspensão de mitocôndrias viáveis de mitocôndrias frescas e no tubo 3 nós vamos utilizar
a nossa suspensão de mitocôndrias fervida Ok então vamos colocar a suspensão de mitocôndrias nos tubos dois até o tudo cês o tubo 3 vai ser a suspensão fervida bom então já vou colocando tudo três primeiro E aí 10 2 ml e no tubo 3 E aí E aí os hinos de mais estudos 0,2 ml da suspensão fresca tão no tubo 2 E aí o tubo 4 E aí o tubo 5 E aí E aí Ah e tudo sei se eu tô colocando o direto na solução sem deixar escorrer pelo tudo porque como é uma suspensão
viscosa e pode grudar na parte de dentro do tubo de ensaio da Encosta na solução não vai adiantar nada tá então estão prontos os nossos tubos vamo agitar E aí E aí E aí já estão prontos os nossos tubos para gente verificar o resultado desse experimento todos esses tubos agora precisam ficar incubados a 37 graus por 30 minutos então vamos colocar eles lá no banho-maria 37 graus para gente conseguir verificar o que que vai acontecer e o que pessoal então estamos aqui na bancada com o nosso banho já a 37 graus e os tubos que
a gente acabou de preparar vou ficar incubados aqui por 30 minutos para gente conseguir ver e o resultado desse experimento eu vou marcar aqui 30 minutos E é só aguardar é muito bem pessoal então transcorrido os 30 minutos dia reação podemos parar o nosso cronômetro e podemos tirar os tubos para ver o resultado desse experimento e tirar aqui para mostrar para vocês é muito bem e o que que nós temos aqui pessoal e os nossos seis tubos contém o trifeniltetrazolio Ou seja aquele aceptor final de elétrons que quando reduzido quando recebe os elétrons vai ficar
de cor vermelha então aqui nos respondem observar a intensidade da cor vermelha que representa a redução do tetrazólio para formar Ana e como vocês podem ver o tubo um ficou praticamente transparente nosso tubo branco o último dois ficou com rosa bem clarinho e o tubo 3 ficou praticamente igual ao tubo Branco praticamente transparente o último quatro nós temos a maior intensidade da cor vermelha Entre todos os todos o YouTube cinco ficou um pouco mais claro do que eu tomo quatro mas ainda assim dá para perceber que foi formada a formação na foi reduzida o tetrazólio
para formar o armazena e outros seis ficou um pouquinho mais escuro um pouquinho mais forte intensidade do vermelho em relação ao todo cinco e um pouquinho mais fraco em relação ao tomo 4 bom então vamos limpar o quadro para gente analisar cada uma dessas situações individualmente bom então vocês viram pessoal que cada um dos tubos apresentou uma intensidade de coloração vermelha diferente que é relativa a redução do tetrazólio até forma zona e que portanto indica a atividade da enzima succinato desidrogenase nós podemos expressar os resultados observados através de uma tabela de intensidade da cor vermelha
para facilitar a interpretação dos resultados então vocês perceberam que o tubo um aonde não haviam mitocôndrias e portanto não havia enzima succinato desidrogenase apresentou por transparente ou seja a intensidade do vermelho foi a mínima possível uma vez que não houve a conversão de sucos Renato até fumarato e portanto não houve a transferência dos elétrons até o tetrazólio esse tubo ou que nós podemos chamar do tubo branco ou seja é o tubo que diz que nós temos 10 de quantidade de tetrazólio reduzido até forma ano no segundo turno nós não colocamos a solução de fluxo inato
mas nós colocamos 0,2 ml de uma suspensão de mitocôndrias frescas e vocês observarão que o como ficou um pouquinho vermelho ele ficou com uma intensidade de vermelho bem o porquê que isso acontece porque dentro das mitocôndrias que nós adicionamos a solução tem um pouquinho de succinato é o que a gente chama de suco sinato endógeno então Mesmo não tendo adicionado solução de surf Natal meio esse pouco succinato endógeno que estava presente nas mitocôndrias foi oxidado até fumarato os elétrons foram transferidos até o trifeniltetrazolio que foi reduzido Até formar Ana que gerou um pouquinho de composto
de cor vermelho uma vez esgotadas se reservatório endógeno succinato a reação sessa o nosso tubo 3 vocês observarem também que praticamente não houve formação de forma asana ou seja a intensidade da cor vermelha foi praticamente nula nesse tubo nós colocamos 0,2 ml de uma suspensão de mitocôndrias feridas quando você ferve a suspensão de mitocôndrias você Deus Natura todas as proteínas que estão presentes nas organela incluindo assassinato desidrogenase que consequentemente vai perder a sua função portanto no tubo 3 mesmo tendo colocado succinato no meio uma vez que em cima não está e não houve oxidação do
succinato não houve a transferência de elétrons e você observou que nada do tetrazólio foi reduzido até a forma na os nossos próximos três tubos são bastante importantes pessoal então Observe o que aconteceu no tubo 4 outubro quatro nós temos solução de succinato que é o substrato nós tínhamos a suspensão frescas mitocôndrias portanto a enzima succinato desidrogenase estava funcional temos o tampão que garantia a manutenção do PH do Meio tínhamos o aceptor artificial de elétrons e colocamos essa mistura uma temperatura adequada para que a reação pudesse esse transcorrer de forma adequada nós temos todos os fatores
necessários Então para que a reação enzimática esse processo de maneira satisfatória nisso de fato foi observado pela intensa cor vermelha observado nesse tubo Ou seja a enzima succinato desidrogenase funcionando catalisou a oxidação de grande quantidade de substrato consequentemente os elétrons retirados desse processo de oxidação foram em grande parte transferidos para o o que gerou portanto a formação em grande quantidade e que deu essa cor vermelha intensa ao nosso Tubo o tubo 4 é o que nós podemos chamado o nosso teste positivo o nosso controle positivo é o tubo de maior intensidade de reação observado nesse
experimento no túmulo cinco Nós também tínhamos o piccinato e também tínhamos enzima funcional entretanto nós colocamos 0,2 ml de uma solução de malonato que você já viram eu inibidor competitivo da sua assinatura desidrogenases que significa que quando uma Lonato estiver presente o sítio ativo da enzima vai estar indisponível para que o SUS inato seja transformado em fumarato existe uma competição entre os sucos inato eo malonato pelo sítio ativo da enzima o que acaba prejudicando a conversão de succinato em formato dessa forma menos oficinato é oxidado menos elétrons são transferidos para o tetrazólio e a cor
vermelha derivada da forma Zana também um pouco menos intenso já não tudo seis o que nós observamos é que a concentração de isso o que nós adicionamos foi 10 vezes maior em relação à presente no tubo 5 ou seja no tubo 6 a competição pelo sítio ativo da sua assinatura desidrogenase vai ser mais favorecida para os sucos inato que está presente em uma concentração muito maior ainda assim a presença do malonato ainda atrapalha na oxidação do succinato pela enzima O resultado é que a intensidade da cor vermelha no tubo 6 é o maior do que
no topo 5 e menor do que na turma 4 a onde não havia nenhum tipo de inibidor Então por hoje era isso Pessoal vocês viram que no nosso único experimento de hoje que era relativamente simples nós podemos observar várias coisas importantes a respeito do funcionamento da enzima succinato desidrogenase eu espero que vocês tenham entendido e gostado da aula e até a próxima E aí E aí
