Aula #7 - Caracterização da Enzima Urease de Soja

o Olá pessoal tudo bem com vocês na hora de hoje nós vamos ver a caracterização de uma enzima chamada urease Mais especificamente da urease extraída da soja nós vamos ver quais são os parâmetros necessários para que uma reação enzimática se processo e com eficiência portanto prepare suas anotações e acompanha os protocolos experimentais através do livro didático ou do material que o seu professor disponibilizar uma boa aula a todos E aí é muito bem pessoal para gente falar da urease primeiro nós precisamos falar do seu substrato que a ureia a ureia é um metabólito rico em

nitrogênio e que é sintetizado pelo ciclo da ureia que acontece no nosso fígado o ciclo da ureia que acontece nos nossos hepatócitos é responsável por remover o excesso de nitrogênio no nosso organismo principalmente o nitrogênio presente na forma de íon amônio que é bastante tóxico pro nosso corpo nós produzimos entre 25 e 40 g de ureia por dia e todo esse material é excretado pela urina nós podemos considerar a ureia portanto como um lixo metabólico uma vez que nós não somos capazes de reaproveitar essa molécula extraindo energia ou produzindo outros tipos de metabólitos a partir

dela existem entretanto organismos que possuem uma enzima chamada urease essa enzima está presente em plantas microrganismos e alguns invertebrados e essa enzima é capaz de quebrar a molécula de ureia para gerar gás carbônico e amônia é com essa enzima que nós vamos trabalhar hoje E o nosso primeiro experimento vai ser para verificar o Karatê o único das enzimas realizando duas reações diferentes bastante simples Então vamos ver muito bem pessoal nosso primeiro experimento vai ser para determinar o caráter proteico da enzima urease então nós já temos enzima aqui isolada e que nós vamos fazer é dois

testes colorimétricos o primeiro você já conhecem o teste do biureto como vocês já sabem da aula teórica com exceção de algumas ribozimas que tem atividade catalítica toda enzima é uma proteína todo mundo vê isso de maneira experimental o que eu vou fazer aqui é colocar duas gotas de solução de urease no tubo a o e 2 ml de água destilada também no tubo a a o YouTube b eu vou colocar apenas 2 ml de água destilada o ou seja o nosso Turbo BBS o nosso tubo branco vai ser a nossa controle negativo e o que

nós temos que fazer agora é colocar dois ml do reativo de biureto em cada um desses tubos para ver qual vai ser o resultado dessa reação é muito bem e vamos agitar os tubos o e ver o que acontece bom então Vocês conseguem perceber pessoal a diferença de coloração entre eles é muito blá aonde nós tínhamos a urease não se extrato de Grease a gente tem uma reação caracteristicamente positiva para violento né para retrô reativo de Violeta significa que tem proteínas essa mostra é um indicativo de que a nossa urease é uma proteína o nosso

tubo B nada mais é do que água e biureto ou seja o nosso controle negativo mostra que não tem nada de proteínas Então se vocês conseguirem observar lado a lado vocês vão reparar a diferença entre eles é muito bem e o segundo experimento para mostrar o caráter proteico da urease a gente vai fazer utilizando esse tubo aqui que eu chamei de tubo h e eu coloquei esse nome tubaga Porque aqui nós vamos fazer uma reação chamada de reação de ré ler então para isso nós vamos colocar nesse tubo 4 gotas da nossa solução de urease

e mais 2 ml de água destilada E aí e vamos agitar um pouquinho e Aqui nós temos que fazer agora é adicionar a esse tubo 1 ml de ácido nítrico concentrado o ácido nítrico com ácido bastante perigoso que produz vapores por isso nós vamos realizar essa etapa na capela de exaustão é muito bem pessoal de volta aqui a bancada o ácido nítrico foi adicionado ao nosso Turbo H foi adicionado bem devagarzinho pelas bordas do tubo para que não houvesse um turbilhão na solução um para que Ele pudesse se assentar no fundo já que eu ácido

nítrico é um ácido mais denso do que a água esse tubo Agora vai ficar parado aqui sem nenhum tipo de agitação por mais ou menos uns dez minutos depois desse tempo nós vamos ver o que vai acontecer é muito bem pessoal então passados 10 minutinhos nós temos aqui a nossa reação de reler não vou mexer muito para não agitar não sei se vocês conseguem ver mas nós temos ali a formação de duas fases uma fase transparente embaixo que é o ácido nítrico na que é mais denso e um anel formando ali um anel mais ou

menos esbranquiçado às vezes ele fica com cor mais ou menos azulada ou arroxeada aqui mostra a interface das proteínas que foram desnaturadas e que em alguns em alguns casos podem ficar coloridos o ok então mostrando novamente que nós temos proteínas dentro desse dessa mostra de urease é só uma curiosidade essa reação de Harry era utilizado antigamente nas análises clínicas para detectar proteínas na urina ou seja a condição de proteinúria então é o mesmo princípio nós estamos usando aqui para detectar a proteínas né ou enzimas na nossa solução de urease bom agora que você já viram

que o Brasil é de fato uma proteína vamos ver qual é a reação que ela promove e vamos fazer algumas reações de caracterização dessa enzima é muito bem agora que você viu que a urease trata-se realmente de uma proteína vamos ver com um pouquinho mais de detalhes como ela processa a Hidrólise da ureia e como nós vamos usar as características derivadas dessa reação para fazer os nossos experimentos então como eu já mostrei para vocês a urease e a capaz de quebrar a ureia para formar como produtos o gás carbônico e amônia uma vez que essa

reação se processa no meio aquoso seja dentro das células seja um tubo de ensaio o gás carbônico formado vai ser combinar espontaneamente com as moléculas de água para formar o ácido carbônico Deus moléculas de amônia formada também vão se combinar espontaneamente com as moléculas de água para formar o hidróxido de amônio é importante perceber que a formação do ácido carbônico Rio do hidróxido de amônio não tem nada a ver com a reação promovida pela enzima urease essas duas relações são espontâneas e acontecem pela presença do CO2 e da amônia no meio aquoso a presença de

um ácido de uma base na mesma solução sempre Vai resultar na formação de um sal por nós temos ácido carbônico hidróxido de amônia sendo formados juntos na mesma solução eles vão acabar formando um sal chamado de carbonato de amônio o carbonato de amônio é um sal de caráter básico ou seja sua presença na solução faz com que o PH suba e essa é uma característica importante para que a gente possa acompanhar o desenvolvimento da reação da urease de uma forma indireta ou seja já que nós não conseguimos observar a formação dos produtos de forma direta

uma vez que tanto o CO2 quanto amônia são gases incolores nós podemos acompanhar a variação de PH do Meio ou seja se a reação enzimática se processar de forma eficiente gerando CO2 e amônio consequentemente haverá a formação de ácido carbônico e hidróxido de amônio e consequentemente haverá a formação de carbonato de amônio isso vai fazer com que o PH do Meio suba se por algum motivo a reação da urease não for processada de maneira correta não haverá a formação dos produtos consequentemente não haverá formação do carbonato de amônio e consequentemente o PH ficará estável pH

Não vai subir bom então antes da gente fazer os nossos próximos experimentos onde a gente vai verificar o funcionamento da enzima urease nós precisamos saber quais são os parâmetros necessários para que uma reação enzimática se processe de forma eficiente para que uma enzima funcione de forma adequada nós precisamos de cinco parâmetros principais primeiro a enzima precisa estar funcional em segundo lugar nós precisamos a presença de um substrato adequado em terceiro lugar o PH da solução deve ser adequado à atividade da enzima em quarto lugar EA temperatura que também influenciam a velocidade da reação enzimática em

quinto lugar é a ausência de inibidores que possam impedir que a reação se processe então acompanha agora como é que vai ser o segundo experimento para verificar a atividade da urease é muito bem pessoal nesse novo experimento nós vamos fazer alguns testes para verificar a funcionalidade da enzima urease para isso é preciso vocês prestem muita atenção no conteúdo de cada um dos tubos que nós vamos utilizar aqui então aqui embaixo nós temos três soluções tampão só que com constituintes diferentes Então a primeira solução tampão é uma solução tampão fosfato PH 7 sem nada só tampão

fosfato a segunda solução é uma solução tampão PH 7 com um por cento de ureia Oi e a terceira solução é a solução tampão fosfato PH 7 com um por cento de ti ureia É o que então as três soluções tampão são diferentes uma só tem solução tampão a outra tem ureia um por cento de ureia e a outra tem um por cento de tio ureia como é que nós vamos preparar os tubos nós pegamos aqui quatro tubos tubo c d e e f o que nós vamos fazer aqui a colocar tampão contendo ureia contendo

tiouréia ou sem nenhum dos dois não é só o tampão Vamos colocar na presença da enzima urease e nós vamos colocar uma gotinha do indicador de PH vermelho de fenol para acompanhar a variação do PH então novamente preste muita atenção no que que vai em cada um dos tubos para gente conseguir interpretar os resultados de maneira eficiente daqui a pouco então vamos lá a primeira coisa que eu vou fazer é colocar 3 ml da solução-tampão como ureia no tubo C E no tubo e tão essa aqui é a minha solução tampão PH 7 com ureia

a 3 ML no tubo 103ml no tubo e um. E aí e agora no tubo de eu vou colocar tampão fosfato PH 7 sem ureia ou seja o nosso tubo de a gente não vai ter o substrato da nossa enzima o Tom 3 ml de tampão sem ureia no tubo de e pronto Ah e por sim no nosso tubo F nós vamos colocar 3 ml de tampão PH 7 conte ureia e Prontinho um E aí e o que pessoal então não esqueçam no tubo C E no tubo e eu tenho tampão com ureia no tubo

de eu tenho só tampão sem a ureia e no tubo efe eu tenho tampão com o tio ureia uma coisa importante que Eu Preciso Dizer para vocês com relação aos tampões que nós estamos utilizando aqui eles estão na concentração de um millimolar ou seja são tampões fosfato bastante diluídos essa é uma informação bastante importante para essa aula pessoal então vou repetir para vocês que o tampão fosfato que nós estamos utilizando está na concentração de um millimolar Ou seja é um tampão bastante diluído bom agora que nós temos nossos tampões com ureia sem ureia ou com

tio ureia nós vamos adicionar a enzima nós vamos adicionar urease a esses tubos aqui então cada um desses tubos vão duas gotas de urease é muito bem vamos ajudar E aí Ah e por último nós vamos utilizar uma gota do indicador de PH vermelho de fenol em cada um desses estudos e vamos agitar E aí E aí E lembrando que o vermelho de fenol em meio Ácido é amarelo e-mail básico ele fica vermelho esses quatro tubos agora vamos ficar incubados a 37 graus por cinco minutos então vamos colocar eles lá para incubar é muito bem

então vamos colocar os tubos para incubar aqui E aí e eles vão ficar cinco minutinhos daqui 5 minutos a gente tira esse 15 minutos depois vamos tirar eles aqui hoje e vamos voltar para bancada para ver os resultados é muito bem pessoal depois da incubação dessas amostras a 37 graus nós temos aqui os resultados para interpretar então percebo no tubo C E no tubo E você tem uma coloração bastante característica vermelha não é um rosa bastante forte uma característica vermelha Isso significa que o PH nesses tubos aqui o fundo vermelho de fenol que é um

indicador de PH que em meio alcalino fica vermelho em meio ácido ele é amarelo tô nós sabemos que o PH nesses dois tubos aqui subiu Isso significa que é urease foi capaz de transformar o substrato que a ureia em CO2 e amônia que consequentemente viraram ácido carbônico e hidróxido de amônio e consequentemente formaram carbonato de amônio que é um saúde caráter básico que quando presente deixa o meio alcalino tão esses dois tubos lembrem-se da composição deles nós tínhamos tampão fosfato PH 7 com ureia o tanto no cê quanto no e tínhamos também embreagem e colocamos

ele as a 37 graus por cinco minutos significa que a reação se professor de maneira efetiva e vamos ver o que aconteceu no tubo b o que que nós tinhamos no tubo de no tubo de Nós já tínhamos tampão fosfato PH 7 sem ureia colocamos a urease e colocamos a 37 graus por cinco minutos o que que tá faltando nessa solução para que ela desce uma reação positiva tá faltando o substrato né então só urease sem o substrato lembre-se que esse tampão não tinha ureia só oragem não é capaz de processar nenhuma reação portanto não

houve a formação de CO2 e amônia consequentemente não houve todo aquele processo de formação de carbonato de amônio o PH não subiu continua o ácido e portanto a solução fica amarela por causa do indicador de PH do vermelho de fenol que Amarelo em condições ácidas e agora vamos ver o que aconteceu com o tubo F pessoal o tubo F é um tubo bastante importante para nós entendermos O que significa a especificidade em cima lembre-se que no tubo F nós tínhamos tampão PH 7 e tiouréia em vez de ureia então ativo ureia apesar de ter apenas

um átomo de diferença em relação à estrutura da ureia não é capaz de ser reconhecido pelo sítio ativo da urease dessa forma a reação não se processa ou seja não existe informação dos produtos CO2 e amônia e portanto também não existe a formação do carbonato de amônio que aquele saúde caráter básico o meio permanece ácido e a coloração do tubo fica amarela por conta do vermelho de fenol o que pessoal então para entender esse experimento é muito importante lembrar da composição dos tampões que foram utilizados em cada um dos tubos lembrem-se aqui para que a

reações enzimáticas se processe de maneira efetiva você precisa ter aqueles quatro parâmetros que nós falamos anteriormente a enzima tem que estar ativo substrato tem que estar presente o PH tem que estar correto e a Natura tem que estar adequada se todos esses quatro parâmetros estiver incorreto a reação vai acontecer caso um deles não seja respeitado a reação pode ser prejudicada ou simplesmente não acontecer muito bem pessoal então pro nosso último experimento nós vamos ver qual é o efeito do calor sobre o efeito da urease e também sobre os sais de metais pesados nós vamos usar

um sal de mercúrio cloreto de mercúrio bastante diluído e ver o que que isso faz com atividade da enzima para isso antes de preparar os tubos eu peguei dois ml de uma solução de urease e fervia ela a 100 graus por cinco minutos então essa enzima que eu vou pegar desse tudo aqui está fervida durante cinco minutos a 100 graus ó e aqui nesses dois tubos o tubo que a gente vai fazer o teste da urease ser vida e o tubo que a gente vai fazer o teste da urease na presença de cloreto de mercúrio

Eu já coloquei 3 ml de solução tampão PH 7 com ureia ou seja nesses dois tubos o substrato da embreagem está presente o que nós vamos fazer com o teste do calor é pegar um ml dessa solução de urease que está fervida e colocar na presença e no substrato vamos agitar e uma gota de vermelho de fenol uma gotinha de vermelho de fenol o nosso tubo onde a gente vai realizar o teste da urease na presença de um metal pesado nós vamos colocar uma gotinha de uma solução de cloreto de mercúrio na concentração de 0,01

por cento o Tom cloreto de mercúrio 001 por cento vamos agitar e aqui nesse tubo nós vamos colocar a urease funcionando ou seja nós vamos colocar or ease a mesma que a gente usou no experimento anterior que a gente sabe que está funcionando duas gotinhas é ah e também vamos colocar uma gota de o vermelho de fenol E aí hoje e vamos agitar eu não lembro ainda composição Vamos colocar eles dois a 37 graus por cinco minutos e ver o que acontece no resultado final muito bem pessoal depois da incubação a 37 graus por cinco

minutos nós temos aqui o resultado dos nossos dois tubos de experimento Então vamos ver primeiro esse tubo aqui ó pela por vocês podem ver que o PH continua ácido ou seja não houve a formação do carbonato de amônio portanto não houve a reação da urease em cima da ureia que eu sou substrato Qual é o parâmetro que está errado nesse tubo para que a reação não se processasse lembrem-se que para esse tubo aqui nós usamos a enzima fervida ou seja nós pegamos a breagem fervemos por três minutos a 100 graus e foi essa enzima fervida

que nós colocamos na presença do substrato na presença da ureia como vocês já sabem nós já vimos nas aulas passadas o calor é um a gente E durante de todas as proteínas como enzima é uma proteína o que nós fizemos quando nós fervemos enzima foi desnaturar essa enzima consequentemente ela perde a sua função então a reação aqui não se processou porque a enzima não estava funcional Ok Ok mas se nesse outro tubo aqui nesse tubo a gente tinha tampão PH 7 com ureia ou seja tinha um substrato nós colocamos a enzima funcionando enzima em Natura

como a gente tinha feito no experimento anterior o PH Está ok a temperatura de incubação estava Ok mas mesmo assim o resultado deu negativo ou seja o meio continuar ácido portanto isto nos indica que a reação não se processou e o que que está acontecendo aqui lembrem-se que junto com enzima e que o substrato nós colocamos nesse tudo aqui uma gota de cloreto de mercúrio na concentração de 0,01 por cento portanto esse cloreto de mercúrio deve ser o responsável que está afetando a atividade da enzima para gente ver como é que esse efeito dos metais

pesados em baixo a concentração na atividade das enzimas vamos voltar para quadro então vocês viram no nosso experimento aqui nós podemos acompanhar a ação da enzima urease sobre o seu substrato observando a variação do PH do Meio como vocês perceberam nós usamos o vermelho de fenol que é um indicador que é amarelo em meio ácido e que fica vermelho em meio alcalino e como vocês viram no tubo ser e no tubo e que nós podemos chamar de controle positivo uma vez que têm todos os parâmetros necessários para que a reação aconteça o PH do meio

ao final do experimento ficou alcalino Ou seja a urease reconhecer o seu substrato a ureia gerou os produtos CO2 é amor e Por conseguinte gerar um o carbonato de amônio que fez com que o PH subir se tornando a solução portanto vermelha já no nosso tudo de que nós podemos chamar de controle negativo a gente usou uma solução tampão sem ureia ou seja estava ausente no substrato da enzima como nós vimos a presença de substrato um dos parâmetros fundamentais para que a reação se processa o resultado foi que sem substrato não a geração dos produtos

consequentemente não há geração de carbonato de amônia e consequentemente o pH Não vai subir portanto tudo ficou amarelo e no tubo F é onde a gente utilizou no substrato modificado que nós chamamos de tio ureia nós conseguimos verificar a especificidade da enzima para o seu substrato nativo ou seja para a ureia mesmo ativo ureia sendo uma molécula que tem apenas um átomo de diferença em relação a ureia isso faz com que enzimas já não seja capaz de reconhecê-la como substrato portanto a reação não se processa ou seja não há a formação dos produtos como eu

ouvi informação a amônia também não houve formação de carbonato de amônio o pH Não alterou YouTube ficou Amarelo nos vimos também que o efeito do calor sobre a enzima urease faz com que ela seja Deus naturada e você já viram que uma encima quando desnaturada' perde a sua atividade biológica portanto quando nós colocamos a urease e Fingida na presença do tampão contendo ureia e DH 75 bancos a 37 graus nós verificamos que a reação não se Professor Porque o PH ficou inalterado isso se dá porque uns parâmetros fundamentais para o funcionamento de uma reação enzimática

não está sendo cumprido O que é a presença da enzima funcional uma vez que ensina estado desnaturado ela não é capaz de converter a ureia em CO2 e amônia Você já viu na nossa aula anterior de caracterização de proteínas que a presença de grandes concentrações de metais pesados junto à proteínas faz com que sejam formados os proteínato de metais pesados o que acarreta na desnaturação e precipitação dessas proteínas Entretanto a presença de metais pesados em concentrações pequenas não é e para que sejam desnaturadas ne precipitadas as proteínas o que aconteceu no nosso tudo teste aonde

a gente colocou uma gota de uma solução de cloreto de mercúrio na concentração de 0,01 por cento na presença da enzima funcional e do tampão contendo ureia é que os íons de metais pesados nesse caso os vimos de mercúrio de Valentes são capazes de se ligar aos grupos sulfidrila presentes nas cadeias laterais dos resíduos de cisteína uma vez que o sítio ativo da uriage Contém esses grupos sulfidrila que são necessários para promover a catálise a ligação do mercúrio com esses grupos sulfidrila impede com que o substrato entre no sítio ativo impedindo portanto a realização da

quebra da ureia pela urease esses rios de mercúrio estão portanto agindo como uma espécie de inibidores da reação enzimática uma vez que a reação não se processa os produtos não são formados e o PH do Meio não é alterado portanto esse tubo que nós testamos na presença de cloreto de mercúrio ficou com cor amarela o que a gente finalizar aula pessoal um questionamento dos mais importantes com relação ao conteúdo que vocês viram hoje a pergunta que vocês tem que fazer é a seguinte hora nós vimos nas aulas passadas que uma solução que contém tampão impede

a variação do PH mesmo Com Adição de ácidos ou bases correto Mas percebo que eu mostrei para vocês que a concentração do tampão fosfato que nós utilizamos no nosso experimento era igual a um millimolar Ou seja é um tampão bastante diluído no tampão bastante fraco por quê que nós temos que usar um tampão nessa diluição para poder fazer Os experimentos justamente para que a gente consiga acompanhar a variação do PH se o tampão fosse muito concentrado mesmo com o processamento da reação com a formação dos produtos e com formação do carbonato de amônio não seria

possível observar a variação do PH uma vez que o tampão iria manter o PH inalterado consumindo toda a base formada bom então por hoje era isso Pessoal espero que vocês tenham entendido e até a próxima a