Aula #5 - Determinação da Concentração de Proteínas

o Olá pessoal na hora de hoje nós vamos ver como é possível determinar a concentração de proteínas utilizando a reação do biureto mais importante do que isso nós vamos ver uma técnica que é fundamental na maioria dos laboratórios de bioquímica que a espectrofotometria ou fotocolorimetria então como sempre Não esqueça de acompanhar Os experimentos com os protocolos disponíveis no livro didático ou com o material disponibilizado pelo seu professor sempre faça suas anotações e uma boa aula E aí é muito bem gente vai frente começar a falar como a gente faz para determinar a concentração de proteínas

ou de qualquer outra substância numa solução nós precisamos ver como é que é o funcionamento do equipamento que nos permite realizar essas medições para técnica de espectrofotometria nós utilizamos o equipamento chamado de espectrofotômetro também conhecido como fotocolorímetro existem vários modelos de fotocolorímetro ou espectrofotômetro alguns por exemplo tem mostradores analógicos enquanto outros bastante mais avançados são totalmente digitais em qualquer um dos casos de funcionamento básico desses equipamentos é o mesmo todos eles consistem de uma fonte de luz que vai emitir uma luz que vai ser concentrada por um colimador que nada mais é do que uma

lente essa luz concentrada vai atingir um monocromador ou um prisma e como vocês já sabem quando uma luz atinge um prisma ela é decomposta em todos os seus diferentes comprimentos de onda os comprimentos de onda de luz visível o mais ou menos entre 290 até 700 nanometros sendo que os comprimentos de onda abaixo de e são considerados ultra-violeta não visíveis e os comprimentos de onda acima de 700 nanometros São os infravermelho também não são visíveis ao nosso olho existem espectrofotômetros que trabalham na luz do espectro não visível como por exemplo ultra-violeta no nosso caso nós

vamos focar apenas no espectro de luz visível e portanto depois de ter composta pelo Prisma do espectrofotômetro nós podemos selecionar um único comprimento de onda através de um seletor de comprimento de onda esse feixe de luz de comprimento de onda selecionado é o que vai atingir a nossa mostra que vai ficar em uma cubeta a luz que atingirá a mostra pode ser parcialmente absorvida de uma maneira que nós iremos um pouco mais adiante e a luz que não é absorvida ou seja aquela luz que a transmitida pela mostra será detectada por uma célula fotoelétrica o

equipamento Então faz a diferença entre a luz que foi absorvido e a luz que foi transmitida e nos Dá Um Valor esse valor é um valor adimensional que nós podemos chamar de absorbância e antes de falar de absorbância propriamente dito nós precisamos ver duas leis que regem esse fenômeno eu estou falando da lei de Lambert que diz que um feixe de luz ao atingir uma amostra será absorvido e da lei de vir que diz que a quantidade de luz absorvida depende da concentração dessa mostra juntas essas duas leis formam que nós chamamos de lei de

lambert-beer a lei de lambert-beer pode ser expressa pela equação absorbância igual a e x e XL aonde é representa o coeficiente de extinção molar se representa a concentração da amostra e ele representa a distância que a luz percorrer a pela mostra ou seja o caminho óptico dentro da mostra como vocês vão ver logo mais numa análise de espectrofotometria para que as amostras possam ser comparadas entre si todas as nossas terão os mesmos componentes em concentrações que podem variar mas isso significa que o coeficiente de extinção molar de todas as amostras será o mesmo portanto nós

podemos considerar esse valor em constante da mesma forma todas as amostras precisam ser analisadas no mesmo equipamento utilizando o mesmo tipo de cubeta O que significa que o caminho ótico que a luz vai passar em todas as amostras esperar a mesma distância portanto mas podemos considerar que essa distância também uma constante Isso significa que absorbância de uma amostra vai depender diretamente da concentração da fa mostra uma relação linear portanto se a concentração de uma amostra dobra em relação a outra absorbância também vai dobrar esse a concentração de uma amostra é metade em relação a outra

mostra absorbância também será a metade independentemente do tipo de análise de espectrofotometria que você esteja fazendo em todas elas você sempre vai ter que fazer o que a gente chama de curva de calibração Ou seja você vai precisar ter soluções com concentrações conhecidas do que você tá querendo medir para poder determinar absorbância dessas amostras se então comparar com a absorbância de amostras de concentrações desconhecidas a curva de calibração é fundamental para que você tem uma análise precisa e geralmente para curva de calibração são utilizados pelo menos quatro ou cinco amostras de soluções de concentração conhecida

do seu analito quanto mais amostras você tiver na sua curva de calibração melhor será a resolução do seu experimento existe uma mostra entretanto que é de fundamental importância para a gente realizar a curva de calibração nós geralmente chamamos essa mostra de branco ou tubo Branco a nossa branco ou tubo Branco será a mostra que ter a concentração igual a zero daquele que você está querendo me dizer ou seja se nós quisermos detectar a concentração de proteínas nós temos que ter um tubo branco que não tenha nada de proteína ou cuja concentração de proteínas seja zero

o tubo branco vai conter todos os reagentes que estarão presentes nos outros tubos reagente de cor a água qualquer outro soluto que você precisa para realizar algum tipo de reação menos a substância que você quer medir o nosso caso menos proteínas Vamos partir então para o nosso primeiro experimento que vai ser a construção a curva de calibração para determinação da concentração de proteínas acompanha muito bem gente a primeira coisa que nós vamos fazer hoje é a nossa curva de calibração de concentração de proteínas para isso nós vamos utilizar 6 tubos de ensaio já estão aqui

numerados de 1 a 36 eu vou adicionar esses tubos diferentes volumes de uma solução de proteínas padrão na concentração de 5 mg por ml que tá aqui ó então cada um desses todos vai ter diferente o volume dessa solução padrão que está na concentração de 5 mg por ml nós vamos usar como tubo branco o nosso tubo 1 ou seja o nosso tubo branco não vai ter proteína aqui só vai ter água e biureto mais para frente do tubo 2 eu vou adicionar 0,2 ml dessa solução no tubo 3 0,4 no tubo 4 0,6 no

tubo cinco 0,8 minuto 61 ml dessa solução padrão de proteínas Então vamos lá tá prontinha então aqui agora eu tenho diferentes volumes de uma solução padrão de proteína do tubo 2 até outubro seis Lembrando que eu tô Boom não tem proteína porque esse vai ser o nosso tubo branco o que nós temos que fazer agora é completar o volume desses tubos para um ml utilizando água destilada Ou seja aquele tubo que não tem nada de proteína nós vamos colocar um ml de água destilada nesse aqui que tem 02 de proteína nós vamos colocar 08 de

água nesse que tem 04 de proteína nos colocar 06 de água e assim por diante o último tudo que já tem um ml de proteína nós vamos colocar nada de água tô todos os tubos vão ficar com um ml no total e como colocar água para completar uma ml de cada tubo 1 E aí é muito bem todos os tubos agora tem um ml de volume total e diferentes concentrações de proteína para finalizar todos os tubos agora vamos colocar o reagente que vai dar cor que o nosso regente do biureto seja viram como é que

funciona a reação do biureto nós vamos utilizar ela para detectar a concentração de proteínas aqui hoje então em cada um dos tubos agora nós vamos colocar 5 ml do reativo de boleto o quê E aí e prontinho e é sempre importante agitar todos os tubos para homogenizar a Soluções ó e esses tubos pessoal agora precisão ficar mais ou menos dez minutos em repouso para que a reação de cores se estabilize você já estão vendo que eles já estão com uma cor diferente um do outro mas é importante deixar uns 10 minutinhos ele eles em repouso

para estabilizar a reação então vamos esperar dez minutinhos a gente já volto muito bem passados 10 minutos as cores já estão estabilizadas antes da gente fazer a leitura das absorbâncias no espectrofotômetro eu queria dizer uma coisa para vocês percebam que o volume total dos tubos é igual todos os todos tem seis ml e o volume do reativo de cor em todos os tubos também é igual todos os tubos tem 5 ml de biureto o que está variando entre o tubo o YouTube seis é a quantidade de água e a quantidade de solução de proteína padrão

que nós adicionamos portanto nós temos concentrações diferentes de proteína nesses estudos como vocês podem ver e os tubos Mais Escuros tem mais proteína nós vamos calcular a concentração já já e os tubos mais claros tem menos proteína Ok então isso é uma coisa importante em toda trabalho de espectrofotometria manter os parâmetros iguais para todas as amostras né tanto nos tubos de da curva de calibração quanto nas amostras que nós vamos fazer mais para frente mesmo volume final em todos mesma quantidade de reativo de cor em todos e por fim eu queria mostrar para vocês esse

tubo aqui que é o tubo branco então como vocês sabem o tudo branco vai ser o tubo que vai ser utilizado para calibrar o espectrofotômetro ele é chamado de tubo branco não porque ele é branco como vocês podem ver ele é azulzinho né Por causa do sulfato de cobre do biureto tá ele é chamado de tubo Branco Porque ele é o tubo que tem zero de concentração daquilo que você quer medir então no nosso caso o tubo branco que é o nosso tubo um só a água destilada e biureto não tem nada de proteína portanto

se a concentração de proteínas aqui a zero absorbância desse tubo tem que zero e é isso que nós vamos dizer o espectrofotômetro Quando nós vamos fazer essas análises aqui a primeira coisa que nós temos que fazer é determinar a concentração de proteínas em cada um desses todos vocês viram que com exceção do tubo branco que tem apenas água e cloreto para todos os outros tubos nós usamos volumes diferentes de uma solução de proteínas a 5 mg por ml reparem que o volume total de todos os tubos a nossa curva de calibração ou mesmo volume total

de 6 ml e reparem também que o volume de biureto em todos os tubos = 5 ml portanto a única variável entre os tubos é a quantidade de água e a quantidade de solução de proteínas que nós colocamos já que todos os tubos tem a mesma quantidade de violento nós podemos eliminar esse 5ml para facilitar nossas contas então nosso tubo branco tem 10 ml de solução de proteína portanto a o esporte na mesa tudo é igual a zero no tubo dois nós colocamos 0,2 ml de uma solução de proteínas a 5 mg por ml e

depois adicionamos 0,8 ml de água fazendo uma regra de três simples significa que para cada ml de água nós teremos um MG por ml de proteína neste tubo a mesma relação vale para os demais tubos Basta fazer uma regra de três simples na determinar a concentração de proteínas em cada um dos tubos por exemplo do tubo 6 nós pegamos um ml de uma solução de proteínas a 5 mg por ml portanto nós temos 5 mg de proteína naquele tubo é muito bem gente então nós estamos aqui com o equipamento que a gente vai aprender a

utilizar agora que é o espectrofotômetro vocês viram que a gente fez aqui há soluções padrão de concentrações de proteína e nós precisamos determinar agora a absorbância de cada uma dessas soluções antes da gente começar a medir as absorvâncias tem algumas coisas importantes Vocês precisam prestar atenção quando forem fazer qualquer técnica de espectrofotometria a primeira coisa que vocês precisam verificar é o comprimento de onda do equipamento ele precisa ser compatível com o que pede o protocolo então para nós que estamos determinando a concentração de proteínas utilizando o método do biureto o protocolo pede que o comprimento

de onda seja de 540 nanômetros torrent verifica aqui E se o comprimento de onda está certo e se não tiver certo a gente coloca em 540 nanômetros é a primeira coisa que vocês tem que fazer em qualquer análise de espectrofotometria a leitura das amostras é realizada utilizando as cubetas são as cobertas são esses recipientes que podem ser para alguns casos redondos ou nesse caso aqui quadrado atende vários tamanhos também tem vários materiais podem ser de acrílico como esse aqui podem ser de quartzo e toda a cubeta vocês vão perceber Elas têm Duas Faces que são

opacas e Duas Faces que são lisas transparentes ou seja se eu nossa intenção é fazer com que o feixe de luz no comprimento de onda selecionado atravesse a mostra é óbvio que nós temos que posicionar essa cubeta de forma que o feixe de luz passe pela porção Lisa da cubeta e a maioria dos cometas tem uma marquinha eu não sei se conseguem enxergar aqui ó tem uma marquinha essa flechinha indica o lado que a luz pode incidir tá então como padrão nós sempre posicionamos essa marquinha para o mesmo lado na hora de fazer análises no

nosso caso aqui a o feixe de luz tá vindo dessa direção para essa direção Então nós vamos posicionar a seta sempre para um desses dois lados né tanto para lá quanto para cá tanto faz vocês também têm que perceber sempre se a coberta está limpa Você não tem nenhuma sujeira nenhuma marca de dedo Aonde a luz vai passar porque isso interfere né se a luz bater ali em alguns Skin alguma sujeirinha vai interferir na leitura da absorbância bom então sempre bom dar uma limpadinha com papel e deixar secar bem se usar muito bem a segunda

coisa importantíssima que nós temos que fazer é dizer para o equipamento que o nosso tubo branco que é aquele tubo que tem concentração zero do que a gente está medindo no nosso caso concentração zero de proteína tem que ter absorbância Igual a zero Como já disse para vocês o equipamento não sabe disso automaticamente então nós é que vamos dizer pra equipamento que o nosso tubo branco que neste caso é o nosso tubo um vai ter absorbância Igual a zero Então vamos colocar à mostra na cubeta e não precisa encher muito a coberta um pouco para

cima da metade já tá bom colocar a amostra no equipamento bom e nós vamos apertar esse botão aqui ó que disse que a absorbância vai ser zerada então nós estamos dizendo que o equipamento que essa mostra que está aqui dentro que o nosso tubo branco vai ter absorbância Igual a zero eu não vejo que ele está calibrando e ver o equipamento agora a absorbância do Turbo Branco tá zerado a partir desse momento a gente não mexe em nenhum outro parâmetro do equipamento a única coisa que a gente faz é trocar as amostras e anotar a

absorbância de cada um todas vamos devolver a mostra aqui para o branco é importante sempre tentar tirar o máximo possível da mostra que resta aqui para que ela não interfiram na leitura que você vai fazer posteriormente então te pego um papelzinho dá uma batidinha bem de leve é só para tirar o excesso e já podemos fazer a leitura do tubo 2 então a partir de agora a gente só coloca as amostras e a nota os valores bom então tudo dois deu absorbância igual a zero, zero 42 E aí a limpar a coberta o tubo 3

a absorbância do tubo 30, zero 85 E aí E aí a absorbância do tubo 4 E não esqueça um dia anotando esses valores o tubo 4 0,128 E aí Olá tudo 5 E aí E aí 10, 172 E aí Ah e por último e o tubo 6 E aí o tubo 6 absorvência de 0,210 bom então essa Essas são as absorbâncias das nossas amostras da curva de calibração é de proteínas usando a o reativo de biureto um ok a gente vai ver o que fazer com esses valores de absorbância agora e depois nós vamos fazer

o nosso segundo experimento o ok pessoal então com os dados de absorbância de cada um dos tubos a nossa curva de calibração nós temos agora duas informações sobre cada um desses todos a concentração de proteínas e absorbância isso nos permite fazer uma relação entre a absorvância e concentração de proteínas que nós devemos votar no gráfico Então veja como é que fica o gráfico da relação entre a absorvância e concentração de proteínas para esses nossos tubos da curva de calibração é importante dizer pessoal que em espectrofotometria quando você for plotar um gráfico de absorbância por concentração

os valores de concentração sempre tem que ficar no eixo X no eixo das abscissas enquanto que os valores de absorbância sempre tem que ficar no eixo Y no eixo das ordenadas é muito comum as pessoas inverterem os eixos e isso atrapalha nas nossas análises outra coisa que tem que ser levado em consideração é a escala dos gráficos é para em que nesse caso nós temos concentrações de proteína que só vem de 1 em 1 MG por ml entretanto Você pode encontrar a curva de calibrações aonde a concentração padrão o Monstros não varia de forma tão

regular é importante que você coloque os valores dentro da escala do gráfico se você não respeita a escala a sua análise vai dar errado a mesma coisa vale para o eixo onde vão os valores de absorbância então nós podemos ver aqui que as seis concentrações padrão de proteína que nós temos agora correspondem aos seus respectivos valores de absorbância Lembrando que o tubo branco que tinha concentração de proteínas é igual a zero é o tubo que nós utilizamos para calibrar o equipamento em absorbância igual a zero portanto esse ponto é o ponto de interseção do gráfico

fica muito nítido observar que essas variações de concentração seguem um padrão linear'' em relação à variação da absorbância isso já era esperado uma vez que vocês conhecem o que diz a lei de lambert-beer nós podemos portanto traçar uma linha dependência entre esses pontos quando você faz isso no computador também é possível pedir para que seja mostrada a fórmula que representa esse gráfico por se tratar de uma reta a equação que vai ser dada a equação que representa essa reta especificamente e essa equação vai ser dada na forma de Y e a x mais B onde

Y representa os valores de absorbância e x representam os valores de concentração dessa forma nós temos agora uma relação de absorbância e concentração de proteínas para qualquer ponto do gráfico entre 0 e 5 mg por ml ou seja para qualquer uma das concentrações nessa faixa nós podemos determinar a absorbância e vice-versa para qualquer absorbância nós podemos determinar a concentração e isso significa que se você tiver agora uma amostra de concentração desconhecida de proteínas você pode determinar absorbância e utilizando a curva de calibração determinar a concentração fazendo Portanto o caminho é o inverso do que foi

feito na curva de calibração Então é isso que nós vamos fazer agora pessoal nós vamos pegar uma mostra que tem proteínas uma concentração desconhecida vamos aplicar o método do violento nas mesmas condições que foram feitas as curvas de calibração e vamos determinar a absorbância para então determinar a concentração de proteínas acompanha aí o segundo experimento bom então vamos lá gens agora no nosso segundo experimento O que nós vamos fazer é pegar amostras de concentração desconhecida de proteínas e tentar analisá-los por espectrofotometria para determinar a concentração Então o que eu tenho aqui agora é uma mostra

que eu não sei a concentração de proteínas que tem é o que a gente quer descobrir e eu vou pegar diferentes quantidades dessa mostro e vou colocar nesse estudos junto com diferentes quantidades de água Lembrando que todos eles tem que ter um ml de amostra no total e depois vou adicionar 5 ml de solução de biureto para que a reação aconteça e a gente possa determinar a absorbância Então quais vão ser as proporções aqui já mostra o tubo a vai ser o nosso tubo Branco dessa vez tão como vocês sabem hotuba não vai proteína só

vai a água e cloreto no tubo B eu vou colocar um ml dessa solução de concentração desconhecida no tubos e meio ML no tubo de 0,4 ml e no tubo e tem um tubo Extra que não não tem no livrinho de vocês mas eu vou fazer aqui porque eu acho que vai ser um Insight importante o tubo e vou colocar 0,1 ml dessa solução de concentração desconhecida de proteínas Então vamos lá lá a pontinha então um ml no tubo B meio né Lindo tubos e 0,4 ML no tubo de 0,1 ML no Twi é da

mesma forma que foi feito no na curva de calibração a gente precisa completar para um ml todas essas amostras então no tubo a eu vou colocar um ml de água no tubo eu não preciso colocar nada porque já tem um ml no tubo sei eu vou botar no meio ml de água eu já tenho meio ml da amostra no tubo de eu vou botar 0,6 ml de água porque já tem 04 da mostra e no tubo e eu vou colocar a 0,9 ml de água porque tem 0,1 de amostra vamos completar todos os tubos com

um ml de água destilada e e Prontinho tão todos os tubos sem volume total até agora de 1ml diferentes quantidades de amostra desconhecida diferente quantidade de água então é exatamente o mesmo tratamento que foi da duplo para curva de calibração tem que ser dado para as amostras que você analisar para você poder comparar as amostras com a curva de calibração portanto agora que que nós temos que fazer colocar 5 ml de solução de biureto em todas as amostras Então vamos lá E aí e prontinho e lembrando sempre de agitar os tubos é homogenizar Soluções é

sempre importante deixar os tubos bem homogêneos E aí o bom da mesma forma Esse estudo tem que ficar mais ou menos uns dez minutinhos aqui até ele se estabilizarem a cor antes da gente fazer a leitura lá no espectrofotômetro vamos esperar dez minutos e daí já vamos direto fazer a leitura lá no equipamento bom então como sempre temos que verificar se o comprimento de ondas Tá certo 540 alunos já estava certo então verificado E como sempre temos que zerar o equipamento novamente Toda vez que você for começar uma sequência de leitura no espectrofotômetro você tem

que zerar o equipamento com o tubo Branco nesse caso nós estamos usando o tubo a que é o nosso novo tubo branco que era igual ao nosso tubo um do experimento anterior da curva de calibração Então vamos ver o equipamento em outubro branco nosso lá a mesma coisa que você já viu no experimento anterior o disco equipamento que o tubo branco tem absorbância igual a zero e pronto e a partir de agora é só a fazer a leitura da absorbância Doce Demais todos sempre lembrando de limpar a cubeta o melhor possível entre uma leitura e

outro nós vamos fazer a leitura da absorbância do tubo B B e tu bebeu 0,105 106/107 essa variação na última casa não tem problema Vamos considerar 0,106 E aí E aí Olá tudo certo G1 a 0,0 a 51 o tubo dele E aí a 0,0 e 39 0,041 considera 0,04 e por último aquele tubo Extra e eu passei para vocês que não tá no livrinho que o nosso tubo e é O que vai ter um absorbância bem baixo aqui é igual a zero, zero 19 0,091 é muito bem pessoal feita as nossas leituras E Agora

Nós podemos utilizar a nossa curva de calibração para efeitos de comparação e determinação da concentração de proteínas em cada uma dessas amostras desconhecidas Então vamos lá ver como é que esse efeito é muito bem agora que nós temos os valores de absorbância para aqueles tubos que tem proteína em concentrações desconhecidas nós podemos determinar a concentração de proteína nas soluções presentes em cada um desses estudos utilizando a nossa fórmula que foi obtida quando a gente construiu a curva de calibração Então vamos ver aqui no tubo b o tubo B ele absorbância igual a 0,106 lembrando aqui

na fórmula o y representa o eixo das ordenadas Ou seja a absorbância eo x representa o eixo das abscissas ou seja das concentrações então se a absorbância do nosso tubo B foi igual a 0,106 nós podemos substituir um Y da Fórmula Por esse valor se nós isolamos o x que a concentração que nós queremos descobrir nós vamos ter que a concentração de proteínas dentro do tubo B = 2,5 MG por ml determinar a concentração de proteínas presentes no tudo B é realizado de forma direta uma vez que essa mostra não encontra-se diminuída ou seja nós

temos apenas 1 ml da solução desconhecida sem que tivesse sido adicionado nada de água bom demais tubos tubos fertubo de e tudo é além de um determinado volume da nossa amostra desconhecida foram adicionados também determinados volumes de água isso nos diz que a nossa nossa original nesses três tubos estava diluída para que a gente consiga determinar a concentração de proteínas na mostra original ou seja sem que ela esteja diluída nós precisamos determinar Qual é o fator de diluição de cada um desses tubos então para determinar o fator de diluição de uma amostra existe uma fórmula

muito simples o fator de diluição vai ser igual a o volume da amostra mais o volume de água sobre o volume da amostra dessa forma para determinar o fator de diluição do nosso tubos e bastante pegar o volume da amostra que é igual a zero cinco mais o volume de água que também a 05 dividido pelo volume da amostra que também é 05 isso vai dar um / 05 q = 2 amostra no tubos e portanto tem um fator de diluição igual a 2 ou seja a nossa está diluída duas vezes para determinar o fator

de diluição do tubo de é a mesma coisa o volume da amostra o volume de água sobre o volume da massa portanto nós vamos ter que 04 mai 06 / 04 vai ser igual a dois e meio e um fator de diluição do tubo e vai ser o volume da amostra e q = 0,1 mais o volume de água que é igual a 0,9 dividido pelo volume da mostra que é igual a 0,1 um / 0,1 vai ser igual a 10 Portanto o nosso tubo E que esse tubo Extra que eu estou mostrando para vocês

que vai ter um fator de diluição igual a 10 ou seja a solução está diluída 10 vezes em relação a solução original muito bem então para que a gente precisa saber o fator de diluição de cada uma dessas amostras porque normalmente nós não queremos saber qual é a concentração de proteínas da amostra diluída o que nós queremos saber EA concentração de proteínas na nossa amostra original para a gente determinar a concentração de proteínas na mostra original nós temos que pegar a concentração de proteínas calculada no tubo diluído e multiplicar pelo fator de diluição Então vamos

ver o exemplo do túmulos e no tubos e nós o turbante é igual a 0,05 um se nós jogarmos esse valor na fórmula da curva de calibração isolando x nós vamos ter que a concentração de proteínas nesse tumo vai ser igual a 1,2 MG por ml Só que essa é a concentração de proteínas que está diluída uma vez que essa amostra foi diluída duas vezes o fator de diluição igual a 2 e nós fizemos determinar a concentração da solução original nós temos que pegar a concentração de proteínas calculado e multiplicar pelo fator de diluição portanto

1,2 x 2 que o fator de diluição vai ser igual a 2,4 MG por ml aqui uma coisa muito importante você sempre tem que multiplicar o fator de diluição pela concentração calculada você nunca vai multiplicar a absorbância pelo fator de diluição então primeiro você calcula a concentração de proteínas no tubo um dessa concentração que é diluído você Multiplica pelo fator de diluição E aí você tem a concentração da amostra original vamos fazer a mesma coisa é de um tubo de teve uma absorbância de 0,040 colocando novamente esse valor na fórmula da curva de calibração e

isolando x nós vamos ter que a concentração de proteínas nesse tubo de = 0,94 MG por ml acontece que o tubo de está diluído duas vezes e meia ou seja esse valor de 0,94 MG por ml é da amostra diluída que nós quisermos determinar a concentração da amostra original nós temos que multiplicar esse valor pelo fator de diluição então 0,94 x 2 e meio vai dar uma concentração igual a 2,35 MG por ml e por último o tubo e o tubo e tem uma absorbância bastante baixa de 0,009 isso porque essa solução está bastante diluída

você já viram que o fator de diluição deste túmulo = 10 bom colocando 0,009 na nossa fórmula da curva de calibração isolando x nós vamos ter que a concentração de proteínas no tubo e é igual Oi, 21 MG por ml Lembrando que essa é a concentração da amostra diluída 10 vezes para achar a concentração da amostra original nós multiplicamos pelo fator de diluição portanto 0,21 x 10 vai dar uma Concentração da amostra original = 2,1 MG por ml e como vocês viram todas as amostras apresentaram valores próximos de concentração da amostra original apesar de ter

havido alguma variação nos valores isso se dá pelo erro experimental ou seja cada vez que você dilui uma mostra você está adicionando erros experimentais ao seu protocolo seja por uma pipetagem precisa seja por um equipamento mal calibrado Mas isso é bastante normal a melhor forma da gente prevenir os erros experimentais durante as análises é realizar pelo menos triplicatas de cada um dos materiais ou seja para cada um dos tubos da curva de calibração seria ideal não estivéssemos três réplicas ou seja o mesmo turno tem que ser feito três vezes para que fosse utilizada a média

dos valores no nosso experimento o mesmo vale para os tubos no nosso segundo experimento aonde nós temos os tubos com concentrações de proteína desconhecido o ideal seria que cada um dos tubos fosse feito três vezes e que dos valores de absorbância obtidos fosse feita uma média isso certamente diminui bastante o erro experimental e é uma prática utilizada rotineiramente nos Laboratórios de bioquímica e antes da gente finalizar essa aula eu gostaria de falar para vocês sobre as limitações do método de espectrofotometria cada protocolo para determinação de concentração de qualquer substância tem um limite de detecção ou

seja conforme a concentração de determinada substância aumenta a reação de cloração para detecção dessa substância vai ficando mais intensa em outubro vai ficando com uma cor mais forte significa que absorvância de se tu vai aumentando gradativamente entretanto todo o protocolo colorimétrico para análise espectrofotométrica Tem um limite de detecção Ou seja a partir de determinado a concentração da substância que você está analisando absorbância não varia mais de forma linear e ela acaba atingindo um platô ou seja absorbância não varia mais mesmo com o aumento de concentração e aí que entra a importância da diluição para que

elas amostras que estejam muito concentradas ou seja que saiam do limite de detecção do método é necessário que você faça diluições para que na hora que você determinado ser mancha a concentração calculada o Dilo Lda cae a dentro da faixa de detecção do método aí você pode com essa concentração da amostra de Luiza já calculada multiplicar pelo fator de diluição e determinar a concentração da amostra original no caso da reação do biureto para detecção de proteínas a faixa de detecção é de 0,5 até 5 mg por ml portanto qualquer solução que tem a concentração de

proteínas menores do que 05 MG por ml ou maior do que 5 mg por ml está fora da faixa de detecção e portanto pode dar resultados incorretos quando você for fazer a análise de espectrofotometria é o que aconteceu Por exemplo com o nosso túmulo e quando nós calculamos a concentração de proteínas nesse tubo que estava diluído 10 vezes nós verificamos que a concentração deu igual a 0,21 MG por ml ou seja menor do que 0,5 MG por ml é por isso que mesmo depois multiplicando pelo fator de diluição o resultado final deu bastante di é

daquele esperado que era o valor de 2,5 MG por ml relativo a concentração da amostra original qualquer solução de proteínas que vocês peguem que tenham concentração maior do que 5 mg por ml precisará ser diluída antes de ser analisada pela reação do biureto e feita a leitura no espectrofotômetro esse mesmo princípio é válido para qualquer protocolo de análise em espectrofotometria para qualquer substância que vocês queiram determinar a concentração todos eles têm uma faixa de detecção e um limite de detecção muito bem pessoal Essa foi a aula de hoje espero que vocês tenham gostado até a

próxima E aí