o Olá pessoal tudo bem nessa aula nós vamos tratar do fracionamento das proteínas do leite e da quantificação de proteínas utilizando o método do biureto e espectrofotometria portanto se você ainda não viu as aulas sobre caracterização de proteínas e quantificação de proteínas por espectrofotometria dá uma olhadinha nos outros vídeos antes de prosseguir como sempre Não esqueça de fazer as suas anotações e seguir os protocolos dos experimentos que estão disponíveis no livro didático ou no material que o seu professor entregar pra vocês então vamos começar uma boa aula a todos E aí E aí é bom
pessoal antes da gente começar Os experimentos propriamente ditos nós precisamos falar um pouquinho sobre a composição química do leite como vocês já sabem o leite é composto de vários nutrientes importantes entre eles proteínas carboidratos na forma de óleo sacaria de os principalmente na forma de lactose e também gorduras na forma de triglicerídeos de composição variada o que nos interessa hoje é falar sobre as proteínas presentes no Leite São três as principais proteínas que encontramos o leite a principal delas é a cafeína também temos a Lacto Albumina EA lactoglobulina dessas três proteínas a quantidade de cafeína
encontrada no leite de bovinos do leite comum de vaca é em média de 85 porcento esse número pode variar obviamente dependendo do lote já no leite humano a porcentagem de caseína é de aproximadamente quarenta por cento a caseína é uma proteína que apresenta um aminoácido modificado chamado fosfoserina esse aminoácido que a carregado negativamente em PH fisiológico é o responsável pela ligação dos rios de caos e no leite como vocês já viram nas nossas aulas anteriores sobre PH quando nós aumentamos as concentrações de prótons uma solução Ou seja quando nós diminuímos o PH aqueles grupamentos ácidos
que em BH próximo de sete eram carregados negativamente passam a ser protonadas e portanto perdem a sua carga portanto se a gente pegar um pouco de leite e de alguma forma diminui o PH ou seja aumentar a concentração de prótons isso vai acarretar na neutralização das cargas negativas presente nas for serenas que formam a caseína com a neutralização dessas cargas negativas a casa ainda vai se aproximar do seu ponto isoelétrico e isso vai fazer com que a interação proteína-proteína seja favorecida fazendo com que as micelas de caseína se juntem em precipitem no processo que nós
podemos chamar de coagulação do leite esse processo é amplamente utilizado na fabricação de queijos coalhadas iogurtes nesses casos os micro-organismos que metabolismo dos açúcares presentes no leite vão formar ácido lático que consequentemente vai abaixar o PH e portanto promover a a ação da cafeína dito isso agora que vocês sabem o princípio de coagulação das proteínas do Leite em especial da cafeína Vamos partir direto para o nosso primeiro experimento e ver como é que isso acontece muito bem pessoal então nós vamos preparar as amostras que nós vamos utilizar posteriormente para fazer a quantificação de proteínas é
a primeira coisa que nós vamos fazer é a precipitação isoelétrica da caseína do leite então para isso nós vamos utilizar 10 ml de leite leite de vaca normal então eu vou pegar aqui 10ml um beijo ml de leite e nós vamos adicionar a esses 10 ml de leite outros 10 ml de água destilada essa água destilada ela tá morna tá mais ou menos na temperatura de um 50 graus Celsius mais ou menos isso vai ajudar no nosso processo de precipitação o Tom 50 ml 10 ml de água com 10 ml de leite nós vamos deixar
essa mostra sob agitação O que nós vamos fazer agora é adicionar gotas de uma solução de ácido clorídrico na concentração de dois por cento Então tá aqui a solução de ácido clorídrico bom e nós vamos adicionar gota-gota até que a gente observe a precipitação das proteínas ou a coagulação do leite então eu vou adicionando devagarzinho e vocês vão acompanhando aí esse processo pode demorar um pouquinho é mas vale a pena ver como é que acontece então sempre sob agitação e colocar mais um pouquinho E aí E aí E aí é muito bem pessoal nós colocamos
aqui então um total de 2 ml gota gota de ácido clorídrico dois por cento agora nós vamos parar agitação e aguardar para esperar a coagulação do leite como eu falei esse processo demora um pouquinho bom então vamos aguardar alguns minutinhos o ok pessoal passado mais ou menos uns 15 minutinhos já dá para ver que o leite está coagulado se consegue observar consegue ver que eu os flocos que foram formados ele Talvez que o fundo preto fica mais fácil E aí o ok então esse Leite agora está coagulado essas proteínas que foram precipitadas nós vamos filtrar
e tirar essas proteínas da solução vão botar esse aqui é um pouquinho para trás Oi e esse Leite coagulado nós vamos filtrar e na nossa mostra que nós vamos chamar dpf que são as proteínas do filtrado aqui nada mais é do que um papel filtro é um funil e nós vamos deixar nós vamos deixar essa a solução filtrar eu tô vendo aqui embaixo bom então essa aqui vai ser a nossa amostra chamada dpf proteínas do filtrado é a segunda mostra que nós vamos utilizar para quantificar proteínas vai ser relativa a porção total de proteínas do
leite então nós vamos chamar essa mostra DPT proteínas totais só que nós vamos diluir essa mostra como fator de diluição igual a 20 vezes então para fazer isso eu vou utilizar meio ml de leite a 0,5 ml de leite ó e vou solubilizar esse 0,5 ml de leite em 9,5 ml é de água a 9,5 ml de água e se vocês lembrarem lá da fórmula de como determinar o fator de diluição o que a gente viu na aula passada vocês vão ver que essa diluição vai ser igual a 20 vezes um fator de diluição igual
a 20 vezes vamos homogenizar amostra Olá tudo bem então Aqui nós temos as duas amostras que nós vamos dar prosseguimento na próxima parte proteínas do filtrado ou seja todas as proteínas que tinham no leite menos a parte que foi coagulado que ficou no filtro e proteínas totais que são todas as proteínas do leite sem nenhum tipo de separação só que diluído 20 vezes bom então vamos continuar para ver que que a gente vai fazer com essas amostras é muito bem pessoal então vocês viram que nós preparamos duas amostras para realizar os nossos próximos experimentos aonde
a gente quer saber a concentração de proteínas em cada uma dessas amostras numa das amostras nós realizamos a coagulação do leite ou seja fizemos a precipitação isoelétrica da cafeína e removemos essas proteínas da solução através da filtração então nós temos aqui a nossa fração que é chamada de PF a nossa fração de proteínas do filtrado é muito importante lembrar o seguinte pessoal nessa fração nós colocamos 10 ml de leite adicionamos 10 ml de água e depois colocamos mais 2 ml de solução de ácido clorídrico a dois por cento gota a gota ou seja essa mostra
de proteínas o filtrado está diluída num fator de diluição igual a 2,2 lembra como é que faz o fator de diluição se você não lembra dá uma olhadinha na aula anterior já a nossa segunda mostra que nós chamamos de proteínas totais nada mais é do que a l de leite diluído em 9 ml e meio de água ou seja essa mostra não tem nenhuma das suas proteínas removidas o leite Foi simplesmente diluído em um fator de diluição igual a 20 vezes conhecer o fator de diluição em cada uma das amostras vai ser bastante importante para
que a gente possa calcular a quantidade de cafeína presente nessa mostra de leite agora para fazer a quantificação de proteínas presentes nessas amostras nós vamos utilizar a reação que vocês já conhecem do biureto e vamos medir a absorbância de cada uma dessas amostras utilizando o espectrofotômetro Preparadas essas duas amostras nós vamos agora fazer a reação do biureto para determinar a concentração de proteínas em cada uma dessas amostras para fazer isso eu vou utilizar quatro tubos de ensaio sendo que o tubo um vai ser o meu tubo branco ou seja vai conter apenas água e livreto
que eu vou usar para zerar o equipamento será o espectrofotômetro o último dois vai ser o nosso padrão de proteínas com concentração conhecido YouTube PF vai ser relativo à proteínas o filtrado YouTube PT vai ser relativo às proteínas totais do leite bom então vamos preparar os tubos e E aí E aí E aí é muito bem pessoal agora todos os tubos tem um volume de 1ml sendo que o tubo um tem um ml de água o tubo 2 tem 0,6 ml de uma solução de proteínas de concentração padrão 5 mg por ml a mesma que
a gente usou na aula passada mas 0,4 ml de água destilada Então você já sabem como fazer para calcular a concentração de proteínas nesse tubo o último PF tem 1 ml da solução de proteínas filtradas e o tubo PT tem 1 ml da solução de proteínas totais do leite o que falta a gente fazer agora é colocar em cada um dos tubos 5 ml de solução de biureto E aí e prontinho e não se esqueçam de sempre agitar os tubos para homogenizar suas Soluções E aí E aí bom então presta reason fica completa nós temos
que aguardar 10 minutinhos para cor se estabilizar e daí a gente vai fazer a leitura lá no espectrofotômetro bom então vamos lá pessoal já passou os dez minutinhos as cores os nossos tubos aqui já estabilizaram o que a gente precisa fazer é fazer as leituras as absorbâncias Então como sempre em espectrofotometria primeira coisa que vocês têm conferir é ver se o comprimento de onda que está selecionado no equipamento é o que o nosso protocolo Pede então novamente a nossa técnica do biureto pede comprimento de onda de 540 alunos segunda coisa é zerar o equipamento ou
dizer para o equipamento que concentração de proteínas igual a zero vai ter absorbant Igual a zero nós fazemos isso utilizando o nosso tubo branco então subo branco é o nosso tubo 1 o que só tem água direto nós colocamos ele na cubeta e vai lá no equipamento e dizendo que o equipamento que esse essa mostra tem absorbância igual a zero é gerado a partir de agora que a gente precisa fazer é simplesmente e anotar as leituras das demais amostras Então vamos limpar tira a coberta você já viram isso na aula passada o nosso tubo 2
é o nosso tubo de referência ou seja é o tubo de concentração de proteínas conhecido Lu a absorbância dele vai ser igual a zero, 118 o e as nossas duas amostras que nos interessam hoje o tubo da proteínas do filtrado a absorbância desse povo vai ser igual a zero, zero 7877 0,077 a e por último e o nosso tubo de as proteínas totais a absorbância desse tubo vai ser 10, 109 é muito bem medidos medidas absorventes e vamos voltar para fazer umas continhas agora Oi Tia a senhora é importante da aula então vamos voltar lá
para quadro bom então vamo lá para só agora que nós determinamos absorbância de cada uma das nossas amostras nós podemos calcular a concentração de proteína em cada um dos nossos tubos como vocês já sabem o nosso tubo 2 ao nosso tubo de referência nesse tubo nós adicionamos 0,6 ml de uma solução de proteínas que estava na concentração de 5 mg por ml e depois adicionamos 0,4 ml de água para completar um ml de volume Total Você já viu como calcular a concentração de proteínas nesse tubo que você não se lembra Dá uma olhadinha no vídeo
anterior Basta fazer uma regra de três simples e nós podemos determinar que a concentração de proteínas desse tubo = 3 MG por ml e nós chegamos uma absorbância igual a zero, 118 para esse tubo de referência é esse tubo que nós vamos utilizar para calcular a concentração de proteínas nos outros dois tubos do PT em outubro PF você também poderia utilizar a curva de calibração tem nós fizemos na aula passada mas para fins de simplificação dessa aula nós vamos utilizar só esse tubo de referência então quando nós analisamos o nosso tubo O que contém as
proteínas os filtrados ou seja todas as proteínas - O que foi coagulado menos a cafeína que foi precipitada e ficou retido no filtro nós obtivemos um absorbância igual a 0,77 fazendo uma regra de três bem simples em comparação com o tubo 2 que nós sabemos a concentração de proteínas nós podemos determinar que a concentração de proteínas no tubo p f = 1,96 MG por ml já no nosso tubo de proteínas totais nosso tubo PT teve um absorbância igual a 0,109 novamente fazendo uma regra de três simples utilizando o tubo 2 que a nossa referência nós
podemos determinar que a concentração de proteínas no tubo PT = 2,77 MG por ml e lembre-se contudo que o tubo PF está diluído duas, duas vezes ou seja tem um fator de diluição igual a 2,2 já que nós pegamos 10 ml de leite 10 ml de água e mais 2 ml do ácido clorídrico para fazer essa solução EA concentração de proteínas que nós determinamos nesse tubo é dessa mostra que está diluída duas, duas vezes para achar concentração de proteínas que seriam filtradas na amostra original ou seja na mostra sem diminuição nós precisamos multiplicar esse valor
encontrado pelo fator de diluição Portanto o valor de proteínas que serão filtradas ou seja todas as proteínas do leite menos a cafeína numa amostra original de leite sem diluir seria igual a 4,31 MG por ml já para o nosso tubo de proteínas totais que nós determinamos uma concentração de proteínas igual a 2,77 não podemos esquecer que este tubo está diluído 20 vezes já que nós pegamos meio ml de leite em Natura e diluímos em 9 ml de água destilada e para determinar a concentração de proteínas totais no leite In Natura sem diluição nós temos que
multiplicar o valor encontrado por 20 dessa forma a concentração de proteínas totais no leite In Natura sem diluição incluindo a cafeína Lacto bovina e lactoglobulinas vai ser igual a 55,4 MG por ml muito bem pessoal sabendo então a concentração de proteínas presentes no leite Total um nas proteínas o fio Prado tendo sido esses valores reajustados de acordo com a diluição nós podemos fazer algumas continhas básicas para determinar a porcentagem de caseína nessa mostra de leite então perceba não quis se nós considerarmos todas as proteínas presentes no leite ou seja a nossa mostra que nós chamamos
de PT nós podemos dizer que as proteínas totais do leite serão iguais às proteínas que estavam no filtrado mais a cafeína que foi coagulada e separada da Morte interiormente correto se nós sabemos que a concentração de proteínas totais = 55,4 MG por ml e a os temas presentes no filtrado é igual a 4,31 MG por ml nós podemos calcular Quantos miligramas por ml de casa aí nós temos nessa mostra de leite esse valor portanto vai ser igual a 51 1,09 miligramas de cafeína por ml de leite nós podemos expressar esse valor em gramas por cento
ou seja Quantos gramas de caseína existem em 100 ml de leite para isso basta multiplicar esse volume encontrado por sem referente a 100 ml nós vamos ter portanto que nessa mostra de leite nós temos 5109 miligramas de cafeína por 100 ml de leite ou 5,1 gramas de cafeína em 100 ml de leite que nós também chamamos de gramas por cento por fim se a gente quiser calcular a porcentagem de caseína em relação às demais proteínas presente nesse Leite bastante pegar o valor obtido pelas proteínas totais que é igual a 55,4 MG por ml = a
sem por cento e pegar a concentração é igual a 51 1,09 miligramas por ml = a x uma regra de três bem simples vai nos dizer que de todas as proteínas presentes nessa morte de leite a casa ainda corresponde a 92,2 por cento essa foi a nossa aula de hoje Pessoal espero que vocês tenham gostado e entendido até a próxima E aí E aí
