Aula #11 - Hidrólise Ácida e Enzimática do Amido

o Olá pessoal tudo bem na aula passada nós vimos a composição polissacarídica daquilo que a gente chama de amido Nós também temos formas de identificar o amido através de reações de coloração E também como realizar a precipitação desses polissacarídeos na aula de hoje nós vamos continuar falando sobre o amido e nós vamos ver duas formas de degradação do amido uma química e uma enzimática vocês vão ver que existem diferenças importantes na forma como esses dois métodos de degradação funciona e também nos produtos finais que eles produzem Os experimentos que nós vamos realizar hoje vão utilizar

vários tubos de ensaio em diferentes condições de Hidrólise em diferentes tempos portanto para que você consiga acompanhar e entender todas as etapas Não deixe de fazer as suas anotações e acompanha o protocolo nos experimentos através do material disponibilizado então podemos começar a aula de hoje uma boa aula a todos e como vocês já viram na aula anterior O amido é composto por uma mistura de dois homopolissacarideos duas glucanas amilose linear e amilopectina ramificada existem enzimas que são especializadas na degradação desse tipo de polissacarídeos especificamente para o amido existe uma classe de enzimas chamadas de amilases

as amilases são encontradas na natureza em diversos subtipos nós por exemplo temos duas formas de alfa-amilase uma salivar e uma pancreática as alfamilase são endoglucanases ou seja degrada o amido a partir da quebra das ligações glicosidicas no meio da molécula outros subtipos de amilases como as beta-amilase e as Gamas amilases que podem ser encontradas em outros organismos são ex enzimas ou seja degrada o amido a partir dos terminais não-redutores de cada um dos polissacarídeos nós vamos falar hoje especificamente o alfa amilase salivar já isso forma da enzima encontrada na nossa saliva responsável pelo início da

digestão dos carboidratos no nosso corpo e que vai ser utilizada em um dos nossos experimentos mais para frente essa enzima em um sítio ativo que reconhece como substrato 6 unidades de glicose ligadas por ligações glicosidicas do tipo Alfa 14 ou seja ela reconhece uma sequência repetitiva de 6 unidades de glicose presente na amilose e também na amilopectina no sítio ativo da alfamilase uma vez reconhecida essa sequência de seis unidades de glicose ocorre a clivagem das ligações glicosídica sacada duas unidades ou seja o produto da atividade da amilase sobre o amido vai gerar com o produto

final a maltose que é um dissacarídeo formado por duas unidades de glicose ligadas aos 14 e que tem agora uma unidade redutora Aonde a ligação glicosídica foi hidrolisada se nós considerarmos por exemplo que a alfa-amilase está atuando sobre uma molécula de amilose que contém 1000 unidades de gu o dado fato de Camelôs é um homopolissacarídeo linear nós podemos considerar que nós teremos como produto final dessa reação 500 unidades de maltose ou 500 dissacarídeos redutores já que o nome lá se estiver atuando sobre as moléculas de amilopectina ela realizará a clivagem das ligações glicosídica onde houverem

6 unidades de glicose ligadas aos 14 mas será impossibilitada de crie várias ligações do tipo seis uma vez que seu sítio ativo não reconhece esse tipo de ligação o produto final da Hidrólise enzimática da Lilo pectina apresentar a portanto além da maltose outros olhos sacarídeos também redutores mas de estruturas variadas que nós chamamos genericamente de Dexter mas a alfa-amilase reconhece a portanto especificamente ligações glicosidicas do tipo Alfa 14 desde que estejam numa sequência compostas por seis unidades de glicose aonde serão hidrolisado as duas a duas lembrando quê Porque é uma enzima presente na nossa saliva

a temperatura na qual esse processo se desenvolve é de aproximadamente 37 graus Celsius há também uma outra forma de nós degradarmos completamente o amido utilizando uma Hidrólise ácida ou uma Hidrólise química utilizando um ácido forte como reagente nesse caso a reação precisa ocorrer em alta temperatura para que possa se processar de maneira eficiente Além disso o excesso de prótons que realizará a Hidrólise das ligações glicolíticas não fará distinção entre ligações do tipo Alfa 14 ou 16 presentes na amilose ou na amilopectina a Hidrólise dessas ligações será portanto realizado de forma aleatória e passado o tempo

necessário para que a Hidrólise seja completa todas as ligações glicolíticas de ambos os polissacarídeos serão indenizadas gerando que o meu produto final portanto glucose livre novamente que nós consideramos uma cadeia de amilose contendo 1.000 unidades de glicose ligados por ligações do tipo aos 14 transcorrido a Hidrólise ácida completa dessa molécula o que nós teremos como produto final serão mil unidades de glicose livre na solução Lembrando que cada uma dessas unidades é uma unidade redutora uma vez que seu carbono Oi livre nos experimentos que nós vamos realizar hoje nós vamos testar essas duas metodologias de degradação

do amido para acompanhar o processo de Hidrólise tanto ácido acontecer mágica nós vamos utilizar duas reações de coloração que você já conhecem das aulas anteriores uma delas vai ser a reação do Google que vai nos mostrar a presença ou não de amido na solução e a outra vai ser a reação do 35 de nitro salicilato do DNS que vai nos indicar a presença de açúcares redutores no meio se você não lembra do princípio de funcionamento dessas duas reações dá uma olhadinha na aula anterior sobre a extração e caracterização do amido e também na primeira parte

da aula sobre cinética enzimática Mais Uma Vez É bom avisar aqui para esse experimento ser utilizados vários tubos diferentes com coletas em diferentes tempos de reação e que serão analisados para a presença de amido e açúcares redutores nas duas condições de drogas portanto serão muitas amostras e várias etapas até a gente chegar no final da nosso experimento então não esqueça de acompanhar com bastante atenção e fazer as suas anotações é a primeira coisa que nós vamos fazer é construir uma curva de calibração para determinação da concentração de açúcares redutores para isso nós vamos usar soluções

de glucose de concentração conhecida submetidas ao método colorimétrico do DNS e posteriormente analisadas as Abstrações no espectrofotômetro Então vamos começar a fazendo essa curva de calibração bom então como vocês já sabem para determinar a absorbância basta a gente primeira coisa que a gente tem que fazer é calibrar o equipamento como tudo branco É nesse tubo que na nossa curva de calibração só tinha água e DNS portanto concentração zero de açúcares redutores nos dizer por equipamento que a concentração que absorbância deste título é igual a zero ah ah não esqueçam de verificar se o comprimento de

onda necessário no protocolo Está correto né eu tava selecionado aqui 540 - a absorbância do tubo branco é igual a zero nós vamos fazer a leitura e da nossa curva de calibração não esqueçam de limpar bem a cubeta há entre uma leitura e outra Ah e não esquece de anotar os resultados estão absorbância do nosso tubo 2 0,107 e tu 3 a 0,2 63 e tu 4 E aí E aí 10 580 Olá tudo 5 E aí E aí é um, 129 o YouTube 6 G1 é um, 300e a 15 é um, 315 só variação

na última casa não importa é é muito bem pessoal Então essas são as leituras das absorbâncias da nossa curva de calibração Praça os redutores eu nossas soluções padrão de glucose basta agora a gente fazer a o gráfico de relação concentração por absorbância se você já sabe como fazer isso determinadas as absorbâncias dos nossos tubos que vão compor a curva de calibração bastante plotar um gráfico de correlação entre a concentração conhecida de glicose em cada um dos tubos e absorbância determinada em cada um deles fazendo isso nós podemos extrair a linha de tendência e obter a

equação da reta que vai nos ajudar a calcular a concentração de glicose nossas amostras desconhecidos no próximo experimento tô veja aqui para nossa curva de calibração foi esse o resultado obtido e a equação dessa reta vai ser y = 0,68 x - 0,00 14 Lembrando que o X é o valor da nossa concentração de glicose que nós vamos querer achar quando nós tivermos o valor de y que vai ser a nossa absorbância Então vamos agora voltar para bancada para fazer Os experimentos de Hidrólise ácida e enzimática do amido para depois a gente conseguir interpretar os

resultados é muito bem pessoal então para realizar esse experimento nós vamos utilizar duas condições de Hidrólise diferentes uma para Hidrólise ácida e uma para Hidrólise enzimática Nós também vamos utilizar vários tubos de ensaio aonde a gente vai fazer os testes de detecção de amido e detecção de açúcares redutores em cada uma das reações em diferentes tempos portanto prestem atenção porque vai ser vão ser várias etapas vão ser várias coletas e é muito fácil Se perder nesse experimento então façam suas anotações e prestem atenção no que que vai acontecer bom então nós já temos aqui dois

banho-maria um banho maria a 100 graus e outro banho-maria a 37° no banho de 100 graus nós vamos fazer o nosso experimento da Hidrólise ácida e no banho de 37 graus nós vamos fazer o experimento da Hidrólise enzimática dentro de cada um desses banhos Eu já coloquei um tubo de ensaio com 5 ml de solução de amido a um por cento ele já estão aqui dentro a uns cinco minutinhos simplesmente para homogenizar a temperatura ou seja nós queremos que a Hidrólise aconteça né começa a acontecer já com a temperatura certa em cada uma das condições

a única coisa que eles estão fazendo aqui por enquanto é se aclimatando a deixando a temperatura homogênea 100 graus peça solução 37 para solução da Hidrólise enzimática e o que nós vamos fazer agora para começar a Hidrólise é no tubo que vai ser feita a Hidrólise ácida nós vamos colocar 0,2 ml de ácido clorídrico concentrado o YouTube que vai ser feita a Hidrólise enzimática nós vamos colocar 0,2 ml de uma solução que contém saliva que é a origem da nossa enzima Alfa amilase salivar diluída em um tampão imidazol Então ela foi diluída dois para um

no tampão imidazol de PH 7,2 nós vamos colocar 0,2 ml de ácido clorídrico aqui 0,2 ml da nossa em cima né da Alfa amilase naquele outro tubo e imediatamente Nós já vamos coletar 0,2 ml para fazer o teste do Google em cada um deles e 0,2 ml para fazer o teste do DNS também em cada um deles Esse vai ser o nosso tempo zero ou seja assim que a gente colocar a tanto ácido contou em cima a gente já vai retirar uma alíquota para fazer os testes Então vamos ver como é que vai ser feito

isso o Tom E aí E aí E aí G1 a 0,2 ml de ácido clorídrico vamos agitar o tubo só para homogenizar ó e aqui a gente já vai tirar a 0,2 ml e dessa solução e para fazer o teste do Google quem quiser, 2 ml para fazer o teste do DNS e o nosso tempo Zé a própria ação da amilase mesma coisa você quiser pode sair daqui a transação vai milagre Então vamos usar Nossa solução de amido de amilase dissolvido em campainha Gasol 102 Mr E aí e vamos agitar e para Como organizar solução

E aí já vamos retirar a 0,2 ml e vai fazer o teste do Google a 0,2 ml e para fazer o teste do DNS tô de volta para o banho maria e E aí se você já pode sair daqui agora pessoal a interromper cada uma das reações né mesmo eles não podem temperatura ainda estão em meio ácido e ainda tá aqui sobre ação da amilase eu já vou colocar aqui então três gotas de lugol a 3 gotas de lugol é um protesto do DNS eu já vou colocar um ml e do DNS e nos tubos

que foram recolhidas as alíquotas e o tempo zero lembre que o DNS é feito uma solução alcalina né então ele já ajuda a neutralizar o ácido e interrompe a reação e prontinho e agora vamos esperar 15 minutos e mais uma realizar esse mesmo procedimento coletar uma alíquota de 0,2 ml pelo Google para o nosso Hidrólise ácida e 0,2 ml para medir o DNS a mesma coisa daqui 5 minutos 0,2 ml para testar o lugol na Hidrólise enzimática 0,2 ml para testar a presença de açúcares redutores pela reação do DNS nós vamos fazer isso a cada

5 minutos até um tempo total de Hidrólise de 20 minutos bom então vamos aguardar é muito bem chegando nos primeiros cinco minutos vamos tirar as alíquotas e do rápido da Hidrólise ácida I e II e para fazer o teste do Google e para fazer o teste do DNS ah e também as alíquotas da nossa Hidrólise se exima tica o teste do Google E aí o teste do DNS 0,2 ml cada alíquota estudos voltam para manter a temperatura e continua a reação e as alíquotas que a gente pegou e já vamos colocar do Gol e os

tubos correspondentes E aí ah e também jogando colocar o DNS e os dois todos é uma ml de DNS um. e vamos aguardar agora o tempo de 10 minutos o Tom tá dando tempo da nossa próxima coleta das alíquotas 10 minutos 10 2 ml a Hidrólise ácida para teste Google 02 ml da Hidrólise ácida tudo teste do DNS 10 2 ml do teste da amilase Oi tudo bom e 02 ml do teste da amilase o clube MS a próxima coleta 15 minutos e não podemos esquecer de colocar o Google né cada um deles ah e

também DNS e os dois estudos E aí E aí E aí o cantinho Estamos chegando nos nossos 15 minutos são nós vamos pegar as alíquotas 02 ml Olá tudo Gol 02 ml Olá tudo bem né Se a nossa Hidrólise ácida 10 2 ml e o Google 10 2 ml Oi para o bns e da nossa enzima e jogando colocar o Google E aí e jogando colocar também o DNS é E aí eu botei mais cinco minutos nós coletamos o nosso últimas alíquotas no tempo total de 20 minutos e não só aguardar é muito bem Estamos

chegando nos nossos 20 minutos hora de coletar as últimas alíquotas para análise de Google 02 ml o teste do Google 10 2 ml e peste do DNS da nossa Hidrólise ácida ah e também 0,2 ml o protesto ligou 10 2 ml e o teste do DNS para nossa Hidrólise enzimática e nós vamos colocar o Google e três gotinhas hoje e vamos colocar o DNS E aí é um ml de DNS bom Então esse foi o nosso processo de Hidrólise ácida e enzimática e de coleta de todas as alíquotas em diferentes tempos de 0 a 20

minutos tanto para Hidrólise ácida quanto para Hidrólise enzimática e tanto para o teste do Google que vai detectar a presença de amido quanto Proteste do DNS Google DNS que o DNS vai detectar a presença de açúcares redutores agora nós precisamos tratar esses tubos aqui para que a gente possa verificar a eficiência desse processo tão vão mudar aqui um pouquinho a organização da bancada e vamos ver o que que vai fazer o ok pessoal então nós temos aqui de volta as nossas alíquotas coletadas do experimento de Hidrólise ácida Hidrólise enzimática O que nós vamos fazer agora

é colocar nos tubos do teste do lugol 10 ml de água destilada para gente conseguir visualizar mais facilmente o resultado Então vamos lá E aí e Prontinho vamos homogenizar todos os tubos é aquele fiquem com uma coloração homogênea né Igual E aí o junto então você já Podem perceber aqui pela coloração dos tubos que conforme o tempo de Hidrólise vai passando a coloração da reação do Google vai diminuindo tanto para Hidrólise ácida quanto o pai Hidrólise enzimática significa que tinha mais amido no começo e o Google detecta e menos amido no final né reação menos

intensa no final mesma coisa na reação da Hidrólise enzimática mais escuro no começo ou seja que tinha mais amido na forma de polissacarídeos né e bem mais clara no final os polissacarídeos os amigos já foi hidrolisada para gente ver agora o que vai acontecer com relação a presença de açúcares redutores nós temos que fazer o teste a reação do DNS que você já viram na outra aula precisa de temperatura Então antes disso nós vamos colocar em todos os tubos agora Duda é um, 3 ml de água destilada e depois nós vamos colocar esses tubos a

100 graus por cinco minutos então vamos colocar a água primeiro E aí E aí é muito bem 1,3 ml de água destilada em todos os tubos e agora eles vão a 100 graus por cinco minutos então eu vou colocar as suas referentes a Hidrólise ácida na frente o YouTube da Hidrólise enzimática eu vou colocar atrás E aí e vamos contar aqui cinco minutos E aí a gente já vai tirar para ver o resultado é muito bem chegado cinco minutos para a reação o DNS podemos tirar os todos os nossos tubos do a Hidrólise ácida o

que os tubos da Hidrólise enzimática e Prontinho a cada um desses tubos agora pessoal nós temos que adicionar 7,5 ml de água para depois poder fazer a leitura da absorbância no espectrofotômetro nós vamos colocar água no produto E aí eu sempre homogene Zando estudos E aí E aí E aí eu tô como vocês podem perceber visualmente né pessoal conforme o tempo de Hidrólise vai passando a intensidade da reação do DNS vai aumentando significa que vai aumentando a concentração de açúcares redutores na solução né Ó tem 10 tempo de 20 minutos quer exatamente o oposto do

que acontece com a reação do Google vai diminuindo a quantidade de amido O amido crescendo hidrolisado o Google vai dando mais fraco e consequentemente a quantidade de açúcares redutores vai ficando mais intensa mais forte e o que nós vamos fazer agora é fazer a leitura dos tubos relativos ao DNS no espectrofotômetro para a gente poder comparar com a nossa curva de calibração que a gente usou padrão de glucose para realizar e poder calcular a quantidade de açúcares redutores em cada um desses tubos em comparação com a curva de calibração Então vamos fazer isso daí É

só para fazer leitura da absorbância dos nossos tubos de alíquotas recolhidas da Hidrólise ácida e da Hidrólise enzimática da análise do DNS Mas vamos usar que o espectrofotômetro ele já estava calibrado com o tubo branco que a gente utilizou para fazer a curva de calibração então ele já tava Zerado com o tubo Branco basta a gente fazer a leitura das absorbâncias no primeiro eu vou fazer a leitura das absorbâncias relativas a Hidrólise ácida Ok então não esqueçam de fazer as suas e Anotando os resultados aí então o tempo zero da Hidrólise ácida o tubo do

tempo zero vai ter absorbância igual a 0,430 o tempo de 5 minutos e da Hidrólise ácida absorvência de 0,8 36 o tempo de 10 minutos é um, zero 39 1,0 1,0 4 há 15 minutos a Hidrólise ácida E aí é um, um a 40 [Música] há 20 minutos a nossa última alíquota da Hidrólise ácida do amido 1,260 e 6 o OK agora então vamos fazer a leitura das alíquotas recolhidas da nossa Hidrólise enzimática tão tempo 0 a reação do DNS para Hidrólise enzimática no tempo zero absorbância a 0,6 13 o DNS cinco minutos E aí

é um, zero 1,100 Dona Redonda 1,100 tenta de dez minutos Hidrólise enzimática E aí é um, 290 E aí há 15 minutos é um, 30 4306 Olá eu sou a última líquida de 20 minutos E aí é um 1,40 6 já entregou a 40 61 é muito bem feitas as leituras podemos agora interpretar os resultados e como vocês viram nós fizemos ao mesmo tempo o experimento de Hidrólise ácida e enzimática do amido coletando alíquotas ao longo do tempo para realizar a determinação da quantidade de amido através da reação do lugol e de açúcares redutores através

da reação do DNS você já puderam perceber visualmente que em ambas as situações tanto na Hidrólise ácida quanto na enzimática conforme o tempo de Hidrólise vai se transcorrendo a quantidade de amido vai diminuindo o que foi visto pela diminuição da cor da reação do lugol em paralelo também nos dois casos a quantidade de açúcares redutores vai subindo nós podemos expressar isso no gráfico genérico sem levar em consideração valores de absorbância e nem de concentrações apenas para mostrar que a intensidade da cor do lugol diminui ao longo do tempo de reação uma vez que o amigo

está sendo degradado em detrimento do aumento da intensidade da cor observada para a reação do DNS uma vez que quanto maior o tempo de Hidrólise maior vai ser a quantidade de açúcares redutores naquele meio percebo aqui transcorrido um tempo Oi gente para hidrólise completa do amido tanto ácida quanto enzimática a intensidade da reação do Google vai se estabilizar 10 ou seja todo o amido vai ter sido consumido as moléculas de iodo presente no reagente de lugol não quero mais as hélices do amido para serem aprisionados e a reação portanto vai ter a mínima intensidade possível

Em contrapartida nesse mesmo tempo Aonde a reação do Gol se estabilizou no mínimo a reação do DNS vai se estabilizar no máximo uma vez que transcorrido toda a Hidrólise do amido tanto a Cida com temática a maior quantidade de açúcares redutores possível vai ser observada no solução nós podemos agora utilizar os valores das absorbâncias determinadas para a reação do DNS tanto na Hidrólise ácida quanto melhores enzimática e transformá-las em concentração de açúcares redutores presentes em cada um dos tubos em cada um dos tempos de reação para fazer isso nós vamos precisar utilizar a equação que

nós obtivemos da nossa curva de calibração feita no primeiro experimento você já sabe como isso é feito que você sabe absorbant é só substituir pelo ipd o chefe da Fórmula 1 e assim você terá concentração de açúcares redutores naquele tubo de concentração desconhecida se nós fizermos isso para todos os tubos de 0 a 20 minutos tanto da Hidrólise ácida quanto da Hidrólise enzimática nós podemos cortar esse gráfico que relaciona o tempo da reação com a concentração de açúcares redutores produzidos em cada um desses tempos percebam que em azul nós temos a curva que mostra a

quantidade de açúcares redutores produzidos ao longo da Hidrólise ácida repare que essas concentrações são sempre maiores para todos os tempos em relação aos açúcares redutores produzidos na Hidrólise enzimática isso se deve em parte pela inespecificidade do ácido clorídrico em quebrar as ligações glicosídica ou seja as ligações glicosidicas estão sendo quebradas de forma mais rápida e aleatória e a partir dos 10 minutos de ração nós praticamente já chegamos no protetor na Hidrólise Total das moléculas de amido uma vez que a concentração de açúcares redutores está praticamente estabilizada após esse tempo significa portanto que todas as unidades

de glucose e obrigados na forma de polissacarídeos agora estão livres na solução após determinado tempo a Hidrólise enzimática também vai atingir um platô em relação a concentração de açúcares redutores mas lembrem-se que os açúcares redutores presentes nesta reação são na forma de oligossacarídeos ou seja para cada unidade redutora que está sendo detectada nesse método nós temos pelo menos duas ou mais unidades de glicose uma vez que os produtos finais da reações enzimáticas são maltose e Dextrina Mas isso também explica em parte por que que a concentração de açúcares redutores na Hidrólise enzimática é sempre menor

do que a da Hidrólise ácida quando comparados os mesmos tempos de reação bom então por hoje era isso pessoal eu espero que vocês tenham entendido e gostado da aula espero vocês na próxima Até lá E aí E aí