Semana da Extração e Purificação de DNA e RNA

O olá seja muito bem-vindo ao universo da biologia molecular eu sou eduardo castán e na aula de hoje você vai aprender tudo o que você precisa saber para fazer extração de dna ou de rh não importa o que você esteja trabalhando da maneira adequada eu vou ensinar para você o que você precisa saber as informações que você precisa ter para tomar decisão correta e escolher a metodologia o kit o que quer que seja Correto adequado para os seus experimentos para o seu caso então se liga aí que a aula está show de bola não se

esqueça por favor você e se inscrever aqui no nosso canal dessa maneira a gente consegue atingir mais pessoas a gente vai fazer com que mais pessoas tenham acesso tipo de conteúdo e assim a gente ajuda nem que seja um pouquinho com a pesquisa nesse brasilzão de meu deus beleza então a gente se vê e já já é E aí bom então vamos lá vamos falar então de extração e purificação de dna e rna vamos saber o que é melhor para você qual é o kit empresa protocolo o que quer que seja que você tem que

escolher para acertar a mão para ter uma chance de ter o seu experimento concluído com sucesso como uma olhada aqui a gente começar dois lembretes bem rápido aqui se você não me segue ainda lá no instagram não se esquece se inscrever lá Me seguir no instagram também arroba universo da biomol porque lá eu ponho pedacinhos da aula assim um conteúdo mais enxuto pega os raciocínios os conceitos mais importantes em chuva que o negócio ficou ali é jogo rápido um vídeos mais curtos de 235 no máximo 10 minutos lá no máximo no geral não passa de

5 minutos e eu coloco lá então são raciocínios mais enxuto se você quer saber além disso a gente vai ter uma a interação um pouco mais próxima mais Íntima e a gente pode falar também ali discutir quais são os temas que vocês querem aprender nas próximas aulas e você saber um pouco mais sobre mim e aí uma interação um pouco lá então não esquece escrever lá se você também ainda não entrou lá no www universo é do mal pontocom faça isso agora deixa seu e-mail lá se você vai deixar o seu e-mail não vou te

mandar spam eu não vou ficar mandando por querer para você porque se você deixa eu ir lá eu vou Saber que você tá interessado nesse conteúdo primeira coisa segunda coisa eu vou te mandar quando uma nova aula tiver no ar então essa agora por exemplo está começando daqui a pouquinho assim que eu terminar de gravar e editar eu já vou mandar um e-mail para o pessoal tá na minha lista e avisa tem aula nova no ar sobre extração e purificação de dna e rna além disso eu vou fazer alguns convites para vocês vou perguntar algumas

coisas por lá e fazer alguns Convites para vocês também via e-mail algumas coisas vão ser exclusivas e que tá tem que tá cadastrado lá no site tá bom então vamos começar e chega de enrolação né sala aqui você vai aprender vai prender extrair dna e rna sabe a gente também mas você sabe que esse é o ponto final você extrair e purificar de dna rna é só o caminho para você chegar um lugar você não quer torrar dinheiro qual de hoje você vai aprender a não torrar dinheiro você vai Aprender a não perder tempo eu

vou começar seu tempo vou te dar algumas informações aqui que você vai poder passar mais rápido uma decisão mais rápido e tempo dinheiro não repetir seu experimento se você escolhe o método errado para fazer estação agente você tem que repetir tudo aquilo que você já fez aquela trabalheira toda que é fazer um experimento sem lá uso cremes demoram anos para ser concluído imagine você tem que fazer os viram então vamos resolver O problema aqui e não perder suas preciosas amostras também é você escolher o método correto adequado e tendo conhecimento de como fazer isso você

tem menor chance de fazer uma bobeira lá e perder isso e no meio do caminho então vamos começar a agenda dessa aula tá assim ó dividir como de costume em quatro partes a primeira parte são as coisas que você deve saber antes de começar a fazer o seu experimento antes de pensar em Extrair dna rna são algumas informações fundamentais você tem que saber isso daqui se você não soubesse aqui você pular essa etapa tem grande chance você fazer uma bobeira lá na frente então muito importante essa primeira parte segunda parte nós vamos falar de coleta

e distração coleta mais rápido porque isso é muito é particular de cada situação de casa experimento de cada condição experimental tem que passar mais rápido e depois ele vai falar dos Três métodos principais de extração depois a gente passa para purificação que também tem três métodos ali principais que eu vou abordar com vocês e por último controle de qualidade que também são três passos são três passos fundamentais que você provavelmente vai ter que fazer no seu caso para ter uma hora informação do que vem pela frente se você não tem conhecimento e nenhum sobre biologia

molecular e eu recomendo que você acesse a playlist Completa de aulas completas a pé inicia aulas completas e procure lá a semana começa por aqui porque ali eu começo a falar de biomal do basicão para quem não sabe nada do zero para quem quer aprender do zero entra lá procura vou deixar aqui ó eu vou deixar aqui em algum lugar tem um like aí para você assistir essa aula se você precisar se você não precisar de conceitos iniciais segue aqui comigo lá também eu faço um resumo de cada uma das principais Técnicas de biologia molecular

a é legal que você tem o conhecimento sobre eletroforese pelo menos pelo menos a parte básica de eletroforese porque a gente vai mencionar ela qual for é celular no finalzinho quando a gente falar sobre análise de integridade de dna e rna aí mencionar eletrobras vamos subir essa hashtag hashtag biomol não é difícil é um dos objetivos desse canal é de o que ficar essa complexidade aí esse Pavor que dá a z para algumas pessoas fazer técnicas de biologia molecular e a sala de hoje cara é sábado ele vai ajudar muitas pessoas que tem esse medo

que vão começar a fazer que não sabe direito como começar é que vai pôr a mão na massa pela primeira vez ou por a mão na massa sem ajuda de alguém que já fez essa aula que vai te trazer tranquilidade estão me ajuda a subir essa hashtag aí hashtag biomol não é difícil conversar com a primeira parte Então o que você precisa saber são seis coisas que você deve levar em consideração antes de começar pensar em extrair seu material as duas primeiras são aqui só pra gente organizar melhor nosso raciocínio as duas primeiras são porque

que as pessoas porque pesquisadores porque eu porque você é analisam porque as pessoas estranham dna e rna aquelas fazer isso elas fazem isso basicamente por dois motivos que esses dois motivos eles estão bem explicados Lá na aula completa na a anna comece por aqui procura a playlist semana começa por aqui e lá eu falo muito bem sobre esses dois motivos aqui mas são basicamente com esses dois motivos ou obter informação funcional as pessoas vão analisar dna e rna por exemplo para analisar a expressão gênica para tentar obter alguma informação genética como a probabilidade de uma

hora propensão a desenvolver doenças hereditárias como alguns tipos de câncer Por exemplo também têm pesquisador que analisa o dna e rna também por exemplo para descobrir se aquele indivíduo lá relacionado ao agronegócio ele tem maior probabilidade a ser mais produtivo ou seja resistente a parasita ou se resistente à seca então obter informações funcionais a outra coisa segundo motivo é para fazer identificação de coisas então você pode utilizando a molécula de dna identificar espécies identificar organismos Identifica a patógenos identificar é sexo identificar pessoas tu a fazer através da molécula de dna e esse então é o

segundo motivo porque as pessoas analizam beme arranhar importante para fazer isso as pessoas trair e muitas vezes nem sempre mas muitas vezes preciso unificar estão os dois primeiro as coisas que você precisa saber se faz a terceira coisa o seguinte dna rna ou ambos que tipo de ácido nucleico que você vai trabalhar isso Parece ser um negócio besta né parece uma coisa boba eu vou trabalhar depressão dia que tem que sair a renata é muito bem tem que sair arranhar mas se você tem que ter na sua cabeça seguinte você e o seu experimento vai

trabalhar só com renato ou vai trabalhar só com o dna se você for trabalhar com dna o seu dna é plasmidial é dna genômico se você tiver trabalhando com rna você tá trabalhando com rna mensageiro você quiser de rna total você precisa de rna Sei lá transportadora ou micro-rna o rna não-codificante tão tudo isso você tem que ter na cabeça porque isso vai interferir um método de extração e purificação que você vai escolher lá na frente era só vem aqui comer fala assim comigo as pessoas de modo geral todo mundo quando vai fazer um negócio

aqui tem medo a gente você tá inseguro e biologia molecular que tais muito está insegurança medo não entendi que tá fazendo está misturando negocinho Ali uma mostra ela é muito rara ela é muito e valiosa para você tem um orientador que tá aqui na cabeça ou patrão que tá aí na cabeça então às vezes fazer biología molecular não é negócio fácil e o primeiro passo quando vai começar o experimento lá na mão na massa mesmo é coletar e extrair e purificar a morte de dna e que as pessoas fazem quando elas estão seguras que elas

fazem elas vão buscar ajuda elas vão ou elas pedem ajuda para alguém Talvez a pessoa saiba que tá falando talvez não saiba que tá falando ou elas vão copiar o que vizinho está fazendo ela vem uma pessoa que fez ali mais ou menos o que ela vai fazer e ela tenta copiar atende nesse caso aqui especificamente por exemplo a usar o mesmo kit de extração e purificação que o colega tá usando e muitas vezes pode acontecer aquele kit extração purificação serviu para ele mas não vai servir para você então com essa aula Aqui com esse

f é da e mesmo essas coisas que parecem básicas eu vou te ajudar você ficar mais tranquila você tomar decisão com sabedoria então é besta saber falar vou trabalhar dna aí né tem isso na cabeça tenha essas informações todas que eu vou te falar agora na sua cabeça porque é isso aqui que vai te ajudar a tomar decisão e é isso aqui que você vai falar com o vendedor o especialista com representante lá o seu fornecedor é são Essas seis informações aqui que você vai passar para ele que vai ajudar você junto com ele escolher

qual é o kit de extração que você vai utilizar qual é o método que é mais indicado para suas amostras então considera isso aqui com muito cuidado com muita atenção porque é isso vai fazer a diferença de um resultado que funciona de uma falha lá na frente então no terceiro motivo é saiba tenha consciência qual é o tipo de assunto clico que você vai extrair Muitas vezes você precisa extrair mais do que um às vezes você precisa trair proteínas e no plex isso tudo você deve saber sabe informar quem você tem que formar e informar

ou se considerasse as informações na hora de decidir qual kit você vai comprar e se você for um site algumas empresas por exemplo você pode procurar lá algumas empresas têm alguns algumas árvores de decisão então sim você é faz Várias perguntas para você lá no final das coisas lá esse kit aqui é o mais indicado para sua situação e são essas perguntas aqui que você vai ter responder para tomar decisão correta então quarta coisa você tem que saber tipo de amostra você vai partir da onde você vai partir de tecido sólido vai partir por exemplo

de músculo e fígado coração ou você vai parte um tecido like vai sair partir de sangue por exemplo você trabalha com cultivo celular Trabalho com bactéria trabalha com amostras duras tipo semente folha raiz trabalha com bactéria trabalha com amostra clínica nossa quinta geralmente ela é degradada ela tem pouquíssima quantidade lá tá em alta em parafina é os trabalhos com a mostra ambiental também geralmente bem degradada bem suja né então todas as informações aqui você deve considerar também tipo de amostra aí a gente vai para quinta o controle de qualidade você tem que Saber quanto de

dna rna você precisa obter para conseguir começar e finalizar o seu experimentos para você vai começar com uma quantidade x você vai ter perda e no meio do caminho que você pode ter que repetir parte desse processo o quanto você tá estranhando é o suficiente é isso vai te garantir que você começa em um experimento ou você pretende utilizar essa amostra de dna rna e mais de uma situação e mais um experimento isso tudo você tem que ter Na cabeça antes de tomar a decisão mais uma vez além da quantidade a pureza qual é a

aplicação que você vai fazer lá na frente ela está diretamente relacionada com o nível de pureza que você precisa só mostra então você vai se você vai trabalhar com a genotipagem eventualmente você pode trabalhar com almoço mais suja você às vezes nem precisa purificar nossa mas você nem extrair amostra se consegue trabalhar direto com célula você vai vai romper a Sala mas sem fazer um processo o mal um processo químico ali de extração às vezes não vai precisar fazer na estação mas nem purificação mas se você vai trabalhar com ali expressão gênica por tempo real

por exemplo você precisa ter a sua mostra além de integrar super pura tem uma pureza outra coisa e aí essa terceira coisa é a integridade já fala integridade tem aplicação que não demanda integridade se você vai fazer um sequenciamento por Exemplo de fragmentos pequenos talvez a integridade não seja importante agora se você pretende fazer um sequenciamento de um gênio' completo a integridade é fundamental ela fala assim tá muito a sua vida e aí a última coisa tem que saber a justamente a aplicação dependendo da aplicação ou das aplicações que você vai fazer isso vai interferir

diretamente aí no seu processo de escolha então são esses seis passos que você deve considerar na hora De escolher ou informar o seu fornecedor para comprar o kit correto ou se a gente correto para a suíça a educação além disso dá uma olhada nesse slide aqui porque ele é importantíssimo um terço do seu sucesso lá na frente na realização do processo extração e purificação dos seus ferimentos como todo ele está diretamente relacionado com a limpeza lugar que você trabalha com a organização o seu tipo de pessoa que Trabalha nessa situação aqui é muito provável ou

você tem maior não muito provável mas você tem mais chance de se ferrar na frente de fazer alguma bobeira de perder amostra ou se perder no meio do processo de um protocolo por exemplo então eu te recomendo fortemente que você mantém a sua bancada organizada e isso é mais importante ainda durante o processo extração purificação por quê porque ela ia sou ponto de partida se você rack se você perder a mostra aqui Você perdeu os seus ferimentos você pode perder tudo que você fez até agora se você era lá na frente durante uma pcr por

exemplo não você está usando só uma alíquota da sua mostra um pouco e aqui não propriamente você tá trabalhando com tudo que você fez até agora tão mantém a organização a limpeza nesse todo o processo mas agora com muito mais atenção com muito mais cuidado e não é só por frescura não eu vou dar um exemplo aqui para vocês se Você trabalha com a bancada organizada se você sabe tudo que você vai precisar para começar e terminar aquele processo que você tá fazendo naquele momento você não tem por exemplo que parar tirar a luva mexer

gaveta encher caixinha de ponteira você tem tudo na sua mão pegar reagente para diluição vai passar fazer nada disso que está ali você se organizou seu planejou tá na sua frente tá ali pronto para você utilizar agora imagina você começa um processo às vezes Delicada trabalhando com a n a amostra que degrada com facilidade é que tá em nitrogênio líquido que não pode descongelar e você tem que parar um processo para fazer alguma coisa para corrigir alguma bobeira que você deixou passar pode ser pode ser é só a morte além do stress que causa além

disso cara coisas simples como se você manter a sua caixinha de ponteira ali toda bonitinha toda organizada e sempre retirar as ponteiras Uma determinada olha isso pode salvar sua vida quando a gente está trabalhando com biomol e trabalhando com várias amostras em algum momento aquele processo ele vai ficar mecânico o negócio que você vai fazer por repetição e que demanda muita atenção apesar de ser mecânico e repetitivo você precisa fazer com atenção só que todo mundo se distrai você vai se distrair o momento imagine chegou um passo fundamental que você não sabe se aquela só

mostra a Única já tem eu não tenho o reagente que você precisa colocar eu tenho certeza que se você já fez bemol você chegou na situação papo disse coloquei ou não coloquei o reagente aqui às vezes é uma coisa cidade muito pequena que você não consegue olhar no tubo e às vezes porém simplesmente por você ter uma caixinha de ponteira organizada você consegue deduzir se aquele a gente tá leu não você tem controle maior sobre o que você tá fazendo porque você sabe aonde você Tirar as ponteiras da sua caixinha você sabe como se interessa

sua caixinha você sabe quantas ponteiras você precisa para fazer esse processo que você consegue a se organizar de uma maneira melhor de trás um pouco mais de segurança fazendo assim ai eduardo que frescura fazer isso é pode ser frescura mas isso já salvou a minha pele mais uma vez seguindo segunda coisa que você tem que fazer antes de começar isso você vai fazer todos os Dias antes de começar a 5 de preferência em todos os períodos antes é de manhãzinha e depois do almoço se você vai trabalhar na bancada que é além da organização fazer

a limpeza da bancada e você vai fazer essa limpeza de duas ou três maneiras se você tiver trabalhando com dna duas maneiras que você vai pegar limpar a bancada e todos os produtos reagentes equipamentos que podem ter contato direto ou indireto com a sua mosta você vai limpar tudo isso com Álcool 70 porcento então vai pegar um álcool para diluir álcool absoluto setenta por cento e coloca um sprayzinho coloca numa onde você quiser passa limpa sua bancada ali para seus os seus equipamentos limpa as pipetas todas elas as caixinhas se for necessário limpar essa entre

ficou se você for usar centrífugo banho secos vou usar pode ser que vai nem para tudo quanto que 70 assim você vai eliminar microorganismos vai fazer uma Desinfecção geral ali naquele ambiente segunda coisa aí dentro do passo 2 você vai fazer a limpeza também com hipoclorito a 10 por cento é hipoclorito de mercado não vai comprar candila dilui 10% deixa uma concentração 10 por cento e passa na bancada passa nos reagentes se a gente não passa no nas caixas passa na pipetas sem trigo com etc por que que você faz isso que ir para o

coreto porque o hipoclorito bom o álcool 70 porcento vai eliminar microorganismos Para fazer uma infecção de ar ela limpeza geral o hipoclorito ele tem a capacidade de degradar moléculas de dna e rna o vídeo livro um fragmentos menores isso é importante que você trabalha com amplificação e provavelmente você trabalha com que ficassem algum momento se você faz pcr algum momento é interessantíssimo que você faça limpeza que o hipoclorito porque a maior fonte de contaminação em laboratório de Biologia molecular não é com r nascer não é com não sei lá com o microrganismo é com produto

de pcr e fazendo isso você em mina produto de pcr daquele ambiente você tem menor chance de contaminar a sua mostra só que tem um cuidado aqui para tomar a primeira coisa passa hipoclorito deixa ele agindo por alguns minutinhos é o tempo você tomar um cafezinho e depois você retire hipoclorito passa um pano limpo ali passa um papel limpo autoclavado e Retire pouco lento porque ele pode ele pode danificar a bancada equipamento a pepeta mesmo então que faça uma limpeza depois do hipoclorito mas ele agindo ele agiu por um tempo já o suficiente e aí

se você trabalha e aí é interessante que você faça uma limpeza também com produtos como esse daqui ó como esse rn até o e tem vários produtos aqui eu não sei nem nem vou falar uma das empresas mas tem um monte de toda empresa com as eventos daqui são Produtos que eliminam é real a gente vai falar de arranhar daqui a pouco mas é realizei para quem trabalha com a renda é fatal se tiver contaminação tiver com uns almoça e vai contato com a realize ela vai degradado é rna degrada com facilidade então faz as

terceiro passo limpa bancada pipeta equipamento também com rn al e ou produtos semelhantes para evitar a contaminação por rms e aí falando aqui um pouco mais para quem trabalha com rené se você não trabalha Com a reinar até algumas coisas são interessantes mas se quiser passa para frente aí que talvez seja interessante mas você que trabalha com rna você tem que saber se aqui trabalhar com a reinar não é a mesma coisa quem trabalha condenar quem começa quem aprende fazendo manipulação de dna e depois para ganhar tá fadado a fase é porque dna não demanda

tanto cuidado rn a demanda você trabalha com essa molécula se você trabalha com esse ácido Nucleico você tem que ter muito mais cuidado para não degradar suas amostras para não manter para manter o ambiente descontaminar por quê por quê que dna é tão delicadas obrigado coisa não entendi pânico eu conheço várias pessoas que entram em pânico quando vão começar a trabalhar com a reação vamos manipulado calma se você fizer as coisas que eu te falar aqui você não vai ter problema mas você deve levar em consideração primeira coisa rma da rna ele degrada com Facilidade

porque existe uma enzima um conjunto de enzimas chamado rn as só justamente justamente as enzimas que degradam o dna e essa praga ela tá em todo lugar rn as está em todo lugar é realize ela está presente no organismo então é bactéria eu você todo mundo produz é reais é um mecanismo de defesa contra conta bom então tem essa molécula aí em todos os lugares então se você tá trabalhando uma mesa essa mesa ela tem a reação Porque porque cai bactérias esporos de bactérias aqui tem de outros sei lá micro-organismos que importa é tem rma

seu presente aqui então tem na maçaneta tem na centrífuga tem na sua pipeta tem na sua bancada tem na sua mão você secreta em casa que tem no seu suor é só saliva a sua lágrima em todo lugar tem a reação então se você possa algum lugar depois encosta a sua mostra você tá levando a ns para lá por isso tem que tomar muito cuidado além disso além das Rn as que estão presentes aí no meio existe a crm as que estão presentes da própria mostra porque a nossa ela tem realiza também um tecido que

você coletou se ela trabalha com fígado tem a reação da própria o próprio fígado as próprias células do fígado produzem as é também como é que nesse proteção e aí a reanálise da própria mostra pode degradar o próprio mostra então se você tiver com tecido você coletou um tecido ele ficar Em temperatura ambiente mesmo que ele não esteja encostando em nada contaminado a rna seu presente na amostra vai degradar o rna que você vai extrair lá na frente e ela vai extrair todo todo carregado lá na frente além disso essa enzima amara360 relativamente pequena e

ela se ela for de naturada elas têm a possibilidade de ser renaturar então ela não é de fácil eliminação se você pegar um sei lá uma vidraria e autoclavar você até degrada Que ela enzima no processo de autocarro mas depois por conta da estrutura que ela tenha de um jeito que ela é formado aquela proteína pelo tamanho também ela se vê natura novamente volto a ser funcional então tem que tomar cuidado inclusive com isso porque ela é muito resistente então o negócio é preto e é muito melhor você prevenir aqui não é hora de economizar

dinheiro você não vai com o nome e o lu você não vai conomizar com os Reagentes limpeza você não vai conomizar comprando plásticos e consumíveis porcaria não é a hora de economizar dinheiro é a que você vai economizar lá na frente escolhendo as coisas corretas fazendo o experimento bem planejado mas aqui não aqui se você tiver que trocar de luva troca se encostam a maçaneta troca de luva se mexer no cabelo troca de novo a limpa a pepeta limpar bancada faz o que eu te falei e você vai evitar contaminação por rms se você é

não Compra água já dos seus fornecedores água ultrapura livro de reais livre não sei o que acha você não compra essa água você utilizado no laboratório que você mesmo purifica e você trabalha com aí na você precisa tratar essa água ou uma outra solução com digite operou carbonato dietilpirocarbonato tem essa capacidade de destruir as enzimas inativar as enzimas e aí sim aquela água aquela solução do hospital utilizando ela fica livre dessa enzimas para isso Você vai e a incubação de pyrocarbonate na sua solução nas água a 01 por cento trouxeram por cento de tiro carbonato

na concentração final vai deixar isso overnight é deixar ali uma noite inteira mexendo e depois dessa dessa noite inteira mexendo e você vai autoclavar para eliminar objetivo piorou carbonato porque ele é um produto tóxico torcer para eliminar e depois que o autoclave você eliminar o primeiro você aí na Ativa a análise com dietilpirocarbonato durante uma noite incubação e depois você e nativo de o time o carbonato por autoclave aí essa água solução chamada de depp que o de pct canal chama de mito bom e quando você tiver trabalhando com a mostra em se pegou a

seu tecido a sua moto não pode que seja seja rápido trabalha com ela o mais rápido possível você tem que manter essa mostra sempre refrigerada se tiver trabalhando com tecido seu trabalho não importa tem que Manter ela de preferência e hidrogênio líquido se não der para mandar em nitrogênio líquido seja algo muito rápido no que você tá fazendo e joga com nitrogênio líquido e congela imediatamente eventualmente você não tem acesso a nitrogênio líquido você precisa manipular essa mostra em algum lugar que não te permite transportar nitrogênio o link da você não tem como congelar a

amostra imediatamente nesse caso você pode utilizar uma solução de preservação De rna que eu vou falar lá na frente e aí sim a gente entra no fluxo de trabalho propriamente dito da estações da purificação e eu dividi aqui em quatro passos a coleta da amostra a extração a purificação e o controle de qualidade vamos subir aqui em ordem cronológica como você faria a preparar ou você já fez isso em algum momento primeira coisa é a coleta da amostra depois que você fez os seus experimentos seja lá o que você tenha Feito não sei se você

trabalha com células você tem arte no seu laboratório agora nunca mudou isso você está em tecido de algum lugar com plano importa fez um experimento agora você vai retirar sua mostra e para depois seguir com os próximos passos aqui esse primeiro passo né que a coleta não tem muito que falar para vocês porque varia de experimento experimento às vezes está trabalhando com a mostra fácil saliva de pessoas ou trabalhando com o swab bucal É fácil acesso talvez esteja trabalhando aí com músculo que é isso aí eu trabalho com peixe trabalhou com boi vai coletar um

pedacinho de músculo ou com folha raiz semente pode ser bactérias em cultivos célula em cultivo amostra de sangue e a isso varia de caso a caso não tem como eu falar de todos aqui cada um vai coletar um jeito que que precisa ser conectado aqui no problema não é eu tô aqui na onde que tem a grande parte dos problemas não contanto que Você seja rápido no processo de coleta e armazenamento da mostra você não vai ter grandes problemas e é só que depois que você coleta você precisa processar essa mostra e você tem aí

então três opções você coletou as amostras e você tem três opções do que você vai fazer logo me seguir a primeira opção é processar amostra imediatamente você vai começar aqui direto com o processo de extração geralmente não é isso que acontece as pessoas elas coleta E várias na nossa elas guardam aquilo para depois de processar armazenar para depois processar mas eventualmente alguns casos você pode já processar imediatamente e nesse caso você tem que trabalhar o rápido o suficiente para inativar as nucleares e evitar a degradação da sua mostra então só pessoa que ela não é

muito comum mas a segunda opção que acha que é mais comum de todas essa daqui você vai armazenar sua mostro você coletou e você tem que guardar se Algum jeito geralmente é refrigerado dependendo do ácido nucleico que você trabalha ou você vai simplesmente refrigerar ou vai colocar um freezer e a -20 ou se tiver trabalhando com rn eu congelei números 80 mas antes congelar com nitrogênio líquido é eventualmente também você não pode congelar e vai fazer uma análise histológica e não pode encontrar em uma vez cada caso é um caso mas você vai ter que

adiar encontrar o jeito de congelar De armazenar essa mostra o mais rápido possível a fim de tal maneira que você não tenha atividade enzimática acontecendo dentro dela porque você não quer possivelmente você não quer seu dna ou seu reinado agradar aqui no caso é como a renner é mais sensível a minha recomendação é trabalhou no tecido sólido e pega sua mostra e congela entrou gênio líquido imediatamente e depois armazena em freezer - 80 Oi e a terceira opção se você às vezes não pode processar nós imediatamente e não tem como congelar a amostra você vai

armazenar só mostra uma solução de preservação presentemente os trabalha com rna que é uma solução de soluções é vendidas comercialmente ou você pode pegar só mostra o tecido por exemplo só a rayssa folhas ela não importa você pegou o seu tecido e você vai manter esse tecido imerso em bebido essa solução de preservação desse jeito você Não precisa congelada imediatamente amostra em bebida nessa solução você consegue transportar temperatura ambiente às vezes e lá as pessoas têm necessidade de fazer uma coleta no meio do mato no lugar mais remoto ou tá no centro cirúrgico não pode

entrar com o botijão de nitrogênio líquido ali é você pode utilizar uma solução de preservação como essa começa as disponíveis comercialmente você coloca o nosso ali e fica tranquilão a nossa embebida na Solução de preservação ela não vai as rm ases as dna o criado elas não vão ser ativada elas vão manter ali quietinhas e você pode deixar lá massa por alguns dias em temperatura várias semanas refrigerada e meses indefinidamente se ela tiver congelada - 21 - 80 dança uma ótima opção para quem não pode processar nem armazenar mostra imediatamente solução de preservação principalmente quem

trabalha com rn a Ah então beleza vamos lá vamos falar então de extração extração de dna rna o que é citação você sonhou bem simples quando você vai trabalhar com essas moléculas com ácido nucleico você precisa expor esses ácidos nucleicos para depois ou purificar ou trabalha sem purificação mesmas de qualquer maneira dificilmente você vai analisar esses ácidos nucleicos dentro da dentro da célula tem quem faça isso tem que faça isso mas não é o nosso caso aqui na Maioria das vezes quando se fala de biologia molecular a gente vai extrair a gente tem que tirar

o ácido nucleico de dentro da célula e aí depois purificar ou não esse ácido nucleico tá ok o primeiro passo é justamente a exposição do seu ácido nucleico por meio de rompimento da membrana celular e ou da da apareceu lá se tiver trabalhando com planta por exemplo e é por isso que chama extra são tão processo distrair e não tem a ver diretamente com a Purificação cês vão entender porque nós vamos separar aqui ó é o método de extração em três tipos principais os três métodos mais utilizados na verdade nem sei se tem outra não

acho talvez não talvez tem mais um certo que não tenham é são três metros principais alise mecânica a lise enzimática e alise e alise química aalise eu tô achando deles aqui porque a lise da membrana ela parece celular tá tão liso e extração aqui no caso vai ser A mesma coisa nesse contexto ele vai ter o mesmo sentido então nós vamos pegar as lembranças celulares elas são rompidas por esse nesse método aqui o força mecânica eu tô mostrando aqui do lado cadinho e pistilo nessa foto tem um carinho que estilo porque eu um método talvez

o mais tradicional usam aí é o talvez mais utilizados está mais utilizados mas é o mais barato mais tradicional e você faz uma força mecânica em cima do seu tecido da sua Célula da sua mostra e através de força física mesmo você vai com p a membranas celulares por tudo que tiver dentro e ela é o dna rna proteínas o que tiver acidente ou se ela vai ser rompida e vai ser exposto né gente vai fazer isso e força mecânica e quando eu faço força mesmo falo força mecânica deixa eu ver aqui se dá para

enxergar isso agora agora é é força mecânica mesmo você vai pegar aqui ó o cadinho que tá aqui o estilo e fazer força mas será aquela Mostra ali né no exemplo do cadinho cristino você vai fazer isso aqui para ela se romper em outros métodos são outras maneiras mas vamo lá pensando em mecânica vou falar eu vou dar alguns exemplos deles mecânica ali na frente mas pensando na nos tipos de liso mecânica call qual que é a vantagem quais são as vantagens primeiro que é um método eficiente porque como você faz a força mesmo que

vai lá braçalmente você que vai comprar célula você faz isso com Muita eficiência boa parte senão todas as células que você tenha limpos com todos né mas boa parte das suas células elas vão ser rompidas e fato expondo os seus atos nucleicos proteínas outras coisas também e é que mais é um processo que leva pouco tempo por amostra por que que você vai fazer esse rompimento você não tem que incubar você não tem que deixar à mostra em tempo real e ainda nade você faz e acabou é pura mostra quando você Considera só o ato

de romper a célula mesmo é um processo bem rápido só que o processo como um todo desde você preparar o material e você é finalizar esse processo ele é bem demorado então um pimentense a exposição das no clipe é rapidinho por amostra só que quando você trabalha com várias amostras vai trabalhar com o material que vai ser sujado vai ficar sujo um bocadinho com estilo no liquidificador vai ter que lavar vai ter que trocar entre uma Mostre outra eventualmente você vai precisar resfriar essa mostra no processo em então não de um modo geral dos três

talvez não mais demorado mas é um dos mais de um dos processos mais demoradas para fazer a lise é é a mecânica por amostra rapidinho e um total e esse tipo de pênis é indicado para amostras difíceis então a mostra dura tipo folha é semente raiz fungo é a mostra que é difícil de alisar você pode Fazer este maneira mecânica que tende a funcionar muito bem então por ser rápido por amostra ele é interessante para quem trabalha com rna pode ser interessante porque o rna vocês vocês não sei se vocês viram as aulas passadas se

não dá uma olhada lá mas o r a ele integrada com muita facilidade por conta das rma asus que estão presentes aí no meio e então o ideal não só que está presente no meio tá presente na própria mostra também né e no caso aqui é mais Importante o rna a ameaça que está presente na torta na própria mostra a análise endógena então a gente não quer ativar essas enzimas e quer deixá-los inativadas um máximo possível então o fato de ser rápido ajude porque você faz o processo e congela amostra imediatamente qualquer desvantagem processo é

e então todos eles mesmo que você utiliza um equipamento eu vou mostrar na frente o processo é manual não dá para Automatizar e aí como eu disse para vocês quando você trabalha com muitas amostras o processo tudo ele é lento ele é bem demorado como eu disse também pode gerar calor porque você tá fazendo uma força mecânica ali então eventualmente você vai ter que parar aquele processo resfriar amostra continuar o processo de mim se resfriar amostra e assim por diante o que mais demanda equipamentos específicos aqui no caso cadinho estilo Um equipamento né simples mas

em outros métodos ou talvez metros até mais eficiente aí ele você vai precisar de equipamento ó e aqui ó são exemplos de equipamentos que vocês podem utilizar para fazer a lise mecânica cara liquidificador é liquidificador pode fazer utilizar liquidificador caseiro mesmo para fazer esse processo aí olha é indicado quando você tenha nossas muito fibrosas músculo fígado levedura mostra difícil de Manusear que forma a grumo então você pode utilizar liquidificador fazer todo o processo de lins e com liquidificador existe outro negócio aqui ó chamado prensa francesa indicado para planta fungo é fungos filamentosos a prensa francesa

você vai fazer amostra passar por um espaço muito reduzido esse prêmio mostra um buraquinho e quando você faz isso é a célula alisado aí vocês põe o daniel arranhar dessa maneira estou em canoas vou utilizar uma ultrassom a Velocidade são muito muito rápida que vai degradar vai lizar a membrana celular e esse aqui pode utilizar todo tipo de amostra mas demanda né um sonicador tem um outro equipamento que eu não coloquei aqui que ele até parecido mas estrutura dele tá parecido com seu mercador que aí tem vários nomes tem um politron é uma é uma

marca famosa que ele parece ele parece um walita mix é parece que o saquinho mesmo único notificador Invertido sabe que vocês para fazer vitamina que negócio que você coloca tem uma lâmina e você aperta e ele pede uma batedeira vai tipo uma batedeira só que são duas peças de metal girando muito próximas a outra alguns com lâmina e esse processo faz a amostra ser rompida se ela se rompe não é extremamente eficiente só que gera calor também tem que fazer isso no gelo ou aquilo que eu disse para vocês faz um pouco volta por gelo

aguardar alguns segundos faz de Novo mais uma rodada vai para o gelo e assim por diante o iasb diz as bison bolinhas metálicas que quando você utiliza nesse equipamento aquela se movimenta uma velocidade muito grande absurda e amostras ali misturada com ela então a vida ela vai destruindo a membrana celular utilizado em planta mamífero microrganismo tem esses homogeneizadores aqui ó é isso que eu tô mostrando é para curtir o celular você coloca só mostra Nessa parte aqui do meio e insere esse como se fosse o estilo né lá nessa parte e faz força mecânica aqui

na mão mas vai apertando esse negócio com as muitas vezes já tá com a solução de lise para ajudar de algum kit que você vai utilizar distração e aí nesse processo você rompe a cela mas existe um que a parecido com esse daqui não sei se vocês já viram é um que você utiliza direto no tubinho no tubinho de um e-mail que ontem tá mostra a geralmente você Trabalha com tubinho de e-mail né um ml e meio e e você coloca amostra ali dentro você coloca uma solução deles e que vem não bom e você

utiliza tipo um textinho bem pequenininho parecido com esse daqui ou com esse outro aqui só que ele é bem pequenininho ele se encaixa certinho no fundo desse pocinho desse tubinho aí você faz a força mecânica eu já usei funcionou muito bem para trabalhar com músculo e extrair rna fazendo isso e Funcionou muito bem foi mas não aos homens nem o cadinho estilo para várias coisas né planta fungo fungos filamentosos e aí a gente vai para o segundo tipo que a license marca talvez seja aqui a a menos utilizada não sei talvez sim ali sem se

machucar vou só tinhas a enzima que vai reagir ali com a parede celular e vai degradar só que interessante dalise você consegue fazer a alice enzimática você consegue fazer um ali cê selecionada e falar sobre isso Qual que é a vantagem primeiro que não demanda equipamento né você compra você comprar as enzimas e não somente são baratas mas pelo menos você não sou de equipamento você compra enzima a injeção da sua moto com as enzimas a e aí você consegue fazer a remoção seletiva isso que eu tava falando da parede celular o conhecimento tudo que

você consegue fazer é selecionar ácido nucleico de organela por exemplo se você tiver Trabalhando com o cloroplasto por exemplo trabalhando com mitocôndrias com esse tipo de 15 você consegue fazer a seleção e aí e aí trabalhar com o ácido nucleico alvo de maneira mais adequada e você pode combinar alise enzimática com a mecânica pode navegar de todas elas você pode combinar tá mas aqui alise com a lisinha se machuca com a com a lise química ela pode ser combinada também qualquer desvantagem pode ser Demorado que o samuel só vai ficar lá no processo de reação

de digestão por um tempo pode ser mais de uma hora pode demorar bastante as enzimas não são baratos de comprar também oi e aí se você tiver trabalhando com expressão gênica também não é indicado porque quando você faz na expressão gênica animal geral que você quer tirar uma fotografia do que tá acontecendo em termos expressão gênica dentro daquelas ela daquele tecido é isso que você quer Você coletou só mostra você quer parar o que está acontecendo em relação a expressão gênica ali naquele momento naquele tecido ou célula e fazer uma análise expressão gênica né tirar

uma foto da expressão dos genes quando você faz a lise por enzima você pode gerar um viés expressão gênica que alguns genes serem influenciados ativados ou desativados ou mudar o nível de expressão deles por conta das enzimas então não é indicado para quem vai fazer Na expressão dele e aqui alguns exemplos nesse tem nada aí não alguns exemplos de dizimar que são as enzimas você pode comprar e lisostafina que tem como a vulcano a actina da parede celular e essa especialmente utilizada staphylococcus alguns canais que tinha nas também o mesmo os mesmos alvos mas pode

ser para leveduras fungos filamentosos celulares e para quebra de celulose e assim vai então são exemplos de enzimas aqui para Você fazer a lise por enzimas e aí vem a química química que é muito utilizada também aqui a o negócio é utilizado detergente e sais caotropicos quando você utiliza o detergente você vai romper o que você vai quebrar os lipídeos da membrana celular o junto em ação junto com faz caotropicos com por exemplo guanidina ou ureia aí você utiliza esse site caltrops para desestabilizar os nuclear então você utiliza é você utiliza a química Que no

caso o detergente para quebrar célula e os sais caotropicos para inativar desestabilizar as nucleares como a rê as e dna qual que é a vantagem baixo custo e talvez seja um método do mais barato que geralmente a lise química ela já vem em seguida do processo de purificação né e você compra um kit que vem para os dois meios os reagentes para a extração que acho que a gente tá falando agora e também para purificação que eu vou falar Depois então é um custo mais baixo e rápido de fazer é fácil qualquer desvantagem detergente ele

pode romper todos organelas aí se você tiver seu interesse vou trabalhar ficou organelas específicas ou ácidos nucleicos presentes no organismo específicas talvez esse não seja o melhor método não é suficiente para bactérias gram-positivas plantas e fungos pode tornar o processo que nação dna plasmidial do dna genômico mais complexo Também vocês vão ver eu vou falar um pouco sobre diferenciar como selecionar um dna do outro lá na frente e é tóxico olindina é tóxico sem não pode encostar na sua pele você não pode respirar esse negócio tem que trabalhar em em capelas ano máscara e assim

por diante essa desvantagem oi e aí vamos ver aqui tudo bem acho que tá tudo bem né eu vou parar de vez em quando porque eu a primeira vez estou fazendo beleza Temos 7 pessoas sejam todos muito bem vindos aí não falei com todo mundo mas isso aí legal vamos lá então já que a gente falou da estação e foi rápido a gente pode seguir forma de purificação também que acho que a parte mais interessante no fim porque coleta e coleta armazenamento não é não é difícil a extração a estação ela por si só ela

sozinha quase ela não acontece gente faz a extração seguida da purificação em alguns casos não deixa eu voltar aqui Quando a gente faz tem algumas aplicações que você não precisa fazer purificação você para fazer na estação suficiente por exemplo quem trabalha com genotipagem genotipagem por pcr hoje eu te passo porque pcr até fenotipagem por sequenciamento de nova geração eventualmente você consegue trabalhar com a mostra suja você faz o processo deles isso acabei de mostrar geralmente ela não é mecânico e ela é feito de maneira é química você Faz se processo denise e após o processo

juízo você segue direto para sua aplicação vai direto para o tempo real por exemplo vai direto para o sequenciamento a dieta pcr nesses casos são aplicações específicas como a genotipagem que você não demanda tem muito controle de amplificação o que interessa mais amplificar ou não amplificar então não te interessa muito saber como ela não que ficou então nesses casos como genotipagem é isso e Também mais importante tudo lá na frente quando você faz esse processo seja utilizando o tempo real hoje estamos em condições de nova geração você vai utilizar mastermix você vai tirar utilizar reagentes

que estejam compatíveis com a mostra suja então não é com qualquer um qualquer reagente que você faz isso não se consegue trabalhar com a nossa suja um célula alisada direto da boca por exemplo do sangue ou da saliva vai direto para pensar em Tempo real mas tem que utilizar kits que sejam compatíveis com amor as polimerases que funcionam que estejam um tampão estão ali aquelas funciona em elas amplifique mesmo a mesmo em bebida ali e inibidores mas isso é exceção na maioria das vezes se faz a extração e segue para purificação e é o que

eu vou falar agora e a gente vai dividir a purificação em 3 m também é fenol clorofórmio mais utilizado de todos aí de longe as colônias de centrifugação e Às vezes magnéticas ah tá depois que você extrai você extrair o dna de uma célula que que você tem que fazer você menina tudo o que não é dna rna você vai ter ali no meio dele celular pedaço de cela organela vai ter proteína vai ter todos os reagentes químicos que você utilizou monte porcalhada lá você não quer nada disso no processo de purificação você retirar tudo

e mantém somente o dna eo rna certo então a participação no pleito isolado é Isolado de tudo que não interessa seja ele compõe o seu lar proteína outros reagentes e concentrado em água concentrada e armazenado em água ou um tampão de preservação de armazenamento e é por isso que então se chama a purificação esse passo vamos começar com o fenol clorofórmio galera se estiver em dúvida manda aí manda aí tá se tiver rápido vai falando é comigo vamos começar então com fenol clorofórmio porque esse é o método mais utilizada Mais barato ele é muito eficiente

e e vocês vão ver no final das contas que o raciocínio os três amigos é o mesmo vocês vão ver que o processo a metodologia para purificar diferente mas o raciocínio ele é o mesmo para as três vocês vão entender que eu tô falando então aqui ó mais tração ela é manual na causa da morte são expostas a fenol e clorofórmio e o fenol clorofórmio eles estão e uma proporção entre eles controlada uma Proporção que você controla para você conseguir um maior desempenho do processo e uma e um ph específico também quanto mais básico é

o ph do fenol quanto mais básico é operado senol você tende a extrair dna de quanto mais ácido você tem distrair é real na extrair e purificar vão entender que eu tô falando já já vamos ver aqui ó então primeiro passo é você pegasse almoço então não se esqueça que nós estamos falando de amostra que já está avisada ela já foi Passou pelo processo de extração então agora a gente vai purificar então almoça já está rompida ali no você tem o seu tubo seja o que for se tem um monte de célula ele todo estourada

você tem dna expulso você tem aí na esposa você tem proteína você tem agora reagente químico gente tá colocando ou reagente químico que utilizou no passo anterior tá tudo misturado aí você vai adicionar também o fenol e o clorofórmio e uma determinada concentração na Proporção entre eles bem conhecida também isso varia de caso a caso e o que que você vai fazer misturar isso tudo de uma maneira extremamente vigorosa você pode fazer isso por volta ax ou você pode fazer na mão mesmo e chacoalhar mas trabalhar com força e por bom segundos aí é o

primeiro a dica que eu dou para vocês se vocês forem trabalhar com esse método esse passo passo de mistura do fenômeno clorofórmio com essas amostras ele tem que ser vigoroso tá isso vai Fazer diferença lá na frente vai aumentar o rendimento lá na frente e aí depois que você faz isso misturou muito bem você vai centrifugar em alta velocidade e quando você centrifuge alta velocidade você vai separar essa solução aqui por densidade né e funções mais densas vão para o fundo do tubo as intermediárias vão ficar no meio do caminho e as menos denso vão

ficar na superfície e olha só que está o pulo do gato que é o seguinte proteína É de abrir celular outra porcaria dentro das células organelas um monte de coisa tá dentro da célula elas são solúveis em fenol dna e rna é solúvel em água bom então quando você faz esse processo de centrifugação separa por densidade você vai colocar o que é mais denso lá no fundo e o que é mais densa é fenol e quem tá solution infernal proteína que aqui no nosso caso não te interessa e na superfície aqui na parte de cima

na camada superior nós temos que é menos Denso água e água quem está solúvel em água dna e rna com dependendo da do ph que você utiliza no fenol você pode separar você pode nessa camada superior aqui e só dna ou ter só rna ou teus dois dna e rna aqui no meu exemplo eu tô mostrando três camadas a camada superior tem solução é na fase aquosa nós temos rna é o geralmente que fica na parte superior é realmente não sempre a intermediária é o dna e lá no final é proteína e o legal desse

método aqui que Você pode fazer o seguinte e é você pode tanto trabalhar com rma trabalhar com dna e com proteína é só você selecionar é só você pescar aqui desse sobrinho que te interessa às vezes ter essas três aí você trabalha com os três a gente era só dna tá olha só tudo isso aí na trabalho só que no final você consegue puxando com a pipeta é retirado te interessa e aqui vem a segunda dica que eu dou para vocês se vocês forem trabalhar com esse método onde está a Maior fonte de contaminação desse

método aqui é no momento que você separa nessas três fases e você vai lá com a sua pipeta coloca a ponteira lá dentro e você puxa a fase que te interessa quanto você puxa a fase que te interessa ostentam a muito cuidado para você não movimentar as outras fases você não puxar as outras fases imagine você e vem com a pipeta aqui a ponteira encosta aqui nessa solução onde tem uma remavam supor que você queira ou rna você vai Puxar isso bem devagarzinho com muito cuidado e se movimentar dna e sem movimentar proteína para você

não puxar o que não te interessa aí está o segredo tão centrifugou não mexe nesse tubo mais tira ele com cuidado das entre fica coloca com cuidado no gelo e puxa a fase que te interessa com muito cuidado também ele é esse a segunda dica então eu vi tem uma pergunta já vou responder aí tá deixa terminar que eu vacino eu já Volto aí a separação em prestação anime depois que você faz isso você vai lavar esse rma né vamos supor que a gente queira rna mais fácil sim ao menos para de miar tá você

vai lavar e se alinhar com álcool absoluto provavelmente aí álcool isopropílico bom e você vai centrifugar depois que você lavar coloca álcool aqui e centrífuga o que que você o que acontece como lá com de dna ou rna ela fica toda Concentrada lá no fundo do tubo forma um pallet e quando você forma esse pele se ela fica toda concentrada toda a princípio aqui no fundo você consegue tirar o álcool que você utilizou nesse processo você vai lá com a ponteira capeta e puxa também retira o álcool que tá lá dentro e você vai ficar

com seu pezinho de rna dna seco lá no fundo aí você vai fazer vai funcionar etanol nacional uma solução que geralmente utiliza etanol parte adicionar etanol Vai desfazer esse pênis vai solubilizar ser com ele de novo né tal vai mexer bastante vai centrifugar de novo por um tempo depois centrifugar vai formato pede aí você vai repetir esse processo mais uma ou duas vezes e no final das contas pela e pela última vez que você fizer isso você tirou etanol depois que você tiver canal você vai recuperar vai ressuspender esse dna ou rna oi e aí

vem nos amigos a terceira dica essa dica quase ninguém fala em pega Aqui seguinte quando você tira o etanol daqui de dentro você não quer você não quer nada além de dna rna e já falou sobre isso né você está purificando você não quer nem o etanol que você utilizou no processo de preparação então você vai vai fazer o pet depois centrifugar vem com a pipeta aqui retira o etanol depois que você retira esse etanol você tem que deixar ele secar deixa secando mesmo abrisse turbo deixa ele viradinho além temperatura no gelo não não não

Temperatura ambiente que já tá purificado pode ficar um tempinho mais na temperatura ambiente deixa nem temperatura ambiente um pouquinho e esse etanol que que tá aqui dentro que tá na parede do tubo que está misturado um pouco esse pet aqui ele vai evaporar oi e o pulo do gato é você não quer deixar resíduo de etanol porque se você deixar resíduo de etanol sabe o que pode acontecer lá na frente se você for fazer uma eletroforese esse dna esse rn aqui Ele pode sair do pocinho você vai colocar uma pocinha eletroforese e esse dna ele

pode subir ele pode sair do pocinho e você vai perder eficiência da sua reação de eletroforese essa é a primeira coisa segunda coisa que depende da aplicação que você vai fazer se você demanda muita sensibilidade por exemplo análise expressão gênica por pcr em tempo real você pode ter interferência do etanol lá na frente também então você não quer deixar resíduo de etanol mas Você é o mesmo tempo não quer que cetanol que é se pet aqui ele segue por muito tempo você não quer que essa mostra fique ressecada no durante esse processo de evaporação de

etanol então no final das contas ao meio termo você não vai deixar etanol ali dentro mas você não quer ressecar essa mostra também porque se você resseca essa e na hora de ressuspender você perde eficiência a hora que você colocar água o tampão você perde eficiência e aí você Porta o rendimento menor da sua estação principalmente se você tiver trabalhando lá na frente quando eu falar com o vídeo magnética que você não vê que o processo que vai ser igualzinho muito parecido pelo mesmo então eu conselho vocês deixarem esse tubo aberto já com o etanol

retirado daqui uns 3 4 minutos não deixa não deixa esse pezinho craquelar formar uma senha e o bracinho assim se começar a craquelar segue para o processo de ressuspensão que é esse Último passa aqui você pegou esse pele deixou ele secar tirou o etanol por três quatro minutos você vai adicionar água ou tampão em tampão de preservação geralmente utiliza tampão ter tá você pode colocar água aqui você só mostra estiver realmente pura você confio no seu processo você sabe que o seu kit funcionar bem você pode ressuspender só amostra em água mas você pode também

o ipe que é uma sigla de da combinação de duas dois produtos o cris que a Solução tampão cotrisel que vai manter o ph estável e o edc a que é uma um produto que a quelante de magnésio o magnésio ele o cofator de enzimas que degradam dna rna e quando você coloca edc a na solução a solução tampão ele vai quela magnésio ea quelante e magnésio ele ele vai fazer a esse processo você evita que as no crianças que estão ali possivelmente contaminadas sua reação degrada em sua morte então é interessante deixar ele tá

também só Cuidado tá ele tá como ele aqui dentro de magnésio se você utilizar ele em uma concentração acima do indicado do que o seu fornecedor indicar por exemplo você vai quela magnésio da dna polimerase uma futura pcr que você que você for fazer por exemplo tá então utiliza o eu aconselho vocês utilizar o até que vem no kit se vocês trabalham com kit multiuso que vem e agora se vocês forem fazer caseiro procura aí a quantidade de leite a ideal Para você não inibir reações lá na frente vamos ver que eu tenho que perguntar

aqui como pegar a ideal desse a gente para extração de rna eu tenho essa informação aqui mas é próximo de eu pego já para você anderson pera aí que eu já eu tenho aqui no slide tem exatamente essa informação e é mas eu acho fala uma coisa se você for fazer caseiro aí você ajuda pegar se você for comprar aqui de pronto ele já vem você não tem que fazer nada aí a Recomendação caso você tem de vocês têm mínimo dinheiro um mínimo de verbo possível compra kit de vista sempre fazer caseiro você precisa fazer

caseiro faz um tem problema faz com cuidado tá se você trabalha no laboratório é privado que faz teste de dna e rna mas geralmente a dominar é a em alta escala aí tudo bem fazer caseiro porque você vai dormir bastante o custo mas se você tá fazendo pesquisa e você tem uma verba azinha para comprar um kit contra o kit Esse processo tudo que eu mostrei aqui para você só vamos bem foto tá não vem foto aqui como é que funciona então o primeiro lembra aqui né quando você vai misturar o final e o clorofórmio

com a sua amostra analisada é isso aqui que você vai ter um toque tem um final clorofórmio estourada com a sua mostra depois que você centrifugar você vai gerar as três fases a que eu tô mostrando três fases porque eu utilizei é um ph ácido então Ele vai ter na camada superior aqui na camada aquosa bem transparente aqui o rna essa branquinha aqui ó intermediária é dna e aqui embaixo a proteína tá e aí você vai tirar muito porque caçar o rna você vai tirar fase aquosa vai puxar com a pipeta com muito cuidado passar

por um tubo novo e adicionar um álcool isopropílico por exemplo aqui para fazer a lavagem aí você vai adicionar os óculos oprofile e para precisar também né você vai utilizar o álcool colocar o Álcool isopropílico e centrifugar e altíssima velocidade quando você faz isso você gera o pelezinho de dna ou de rna esse pé gente pode está escuro também tá eventualmente ele é mais escuro aqui tá branquinho fica em saber de perto uma foto mais de perto então um tubinho lá com a o pedaço o pênis dna rna e aí você vai tirar esse álcool

daqui vai colocar alto aqui de novo misturar muito bem com esse pele e eventualmente até vou ter que sair um Pouco aí tira de novo coloca de novo faz duas três vezes isso centrífuga na última centrifugação você tira todo o álcool deixe secar por três quatro minutos e aí você adiciona o seu tampão a água e tá pronto para seguir para a próxima fase ou vai congelar ou você segue aí para o seu celular que você vai fazer para sua aplicação o pablo henrique boa tarde bem-vindo fábio depois você olha lá vou deixar essa live

aqui depois você assistir do Começo então final clorofórmio aqui ó tá aqui a informação que você queria alisson tá aqui carol então preciso sair ganhar mas tem namorado o que nesse caso para rna quatro ponto 5 e 5.5 e para dna é mas é bem mais básico é neutro na verdade ele vai próximo do neutro está para ganhar neutro para rna aí um pouco mais aço 4.5.5 vantagem é um processo muito eficiente cara esse processo é o que mais rende dna rna assim no final das contas ele dá bastante micrograma Por três depende da nossa

claro mas ele é o que rende melhor é ele é compatível com a estação de dna de grande peso molecular vocês vão ver lá na frente que eu falo de colônia nem todo da coloninha ela é compatível com moléculas muito grandes então tô trabalhando com dna genômico se você vai analisar o dna genômico vai fazer um sequenciamento aí é legal você pode ser uma indicação trabalhar com final clorofórmio algum colônia E a as proteínas presentes na fase orgânica que é a fase aqui rosinha elas podem ser purificada só você pode utilizar proteína daqui também e

seguir com o processo de purificação se o seu experimento não tiver proteína também a estava gelada para caramba desvantagem troca telefone pode causar intoxicação ele é tóxico negócio é corrosivo e também então cuidado se vocês forem trabalhar trabalho capela luva máscara é não cheira esse negócio Aqui o fenol clorofórmio mas eu falo até cheiro mas o diluir um pouco trabalhoso e demorado trabalho de morrer nada porque porque esse processo é sempre sempre manual você não vai automatizar isso daqui não não dá para automatizar muita manipulação de líquido demais para conseguir automatizar então vai ter que

fazer na mão mesmo vai ter que tirar aquela fase aquosa aqui com bastante cuidado né não deixar essas essas fases se misturarem nessa nesse momento é Resquícios de fenol clorofórmio na nossa pode inibir ração então se você fez esse processo aqui contaminou um processo de retirada da face que te interessa e você coletou um pouco de fenol ou não centrifugou direito ou sei lá o que você pode levar se nosso uniforme para os próximos passos e aí você vai necessariamente t oi gente mas provavelmente ter a inibição das suas reações a coleta da fase aquosa

demanda certa prática né Porque você vai vir com a pipeta puxar aqui toma muito cuidado uma dica que outra dica se você pensa aqui tá puxando ali o r na fase aquosa e veio outra fase para tudo de volta para o tubo de centrífuga de novo tem problema nenhum fazer isso mas não segue se você ficou na dúvida que você puxou a fase aqui não é adequada para centrífuga e começa de novo melhor do que você chegar lá na frente tá tudo contaminado fechado vamos ver se tem perguntas aqui O alisson tá rindo está rindo

clorofórmio né cara de certeza ou no café de la la coluna de centrifugação matriz sólida de sílica de vidro fica vidro outra resina geralmente essa resina que ela é proprietária das empresas com capacidade de peças nucleico alto então filtro cara é um filtro que você vai fazer aqui é um processo de filtração basicamente a ideia mesmo só que o que fica preso no filtro que te interessa a gente filtra Água em casa o que fica preso no filtro não é o que interessa a gente quer que passa pelo filtro aqui é a mesma ideia só

que o que fica peso no filtro ao que interessa pode ser o dna ou rna um plasmídeo micro renaux o produto que se é felipe machado quando trabalhei com esse protocolo ea melhor parte era do hahaha cara todos fora cara que pariu sabia que era bom essa live eita ferro olá a todos vai fazer ó essa aqui é coluninha isso aqui você compra um kit Se você compra esse daqui as empresas vendem você vai fazer isso em laboratórios e compra kit que já vem com tudo que você precisa e aí essa colônia aqui aqui embaixo

você tem um filtro uma resina né verdade uma matriz sólida que é de vidro ou de outra resina proprietária não importa o que importa é que aqui tem um negócio que vai reter seu denilson renata você pega a sua mostra que acabou de ser visado então volto né a gente fez o clorofórmio o Protocolo do final clorofórmio esquece ele passando por ele volta lá para lhe cê pega nem para falar de outro método então você mesmo acabou de lizara mostra por metro pelo método que for agora você tá vindo para cá você vai colocar sua

amostra analisada aqui dentro ó você vai lá e pétala que idêntico colocou almoça ali dentro aí você vai fazer colocar essa coloninha desde o dia um tudo no tubinho começa aqui que eu tô mostrando tá vendo lá encaixa ela feito para Encaixar no tubinho que vem no kit e aí você centrífuga fecha ela e centrífuga e é a sua mostra no processo centrifugar e vai passar pelo filtro pela sílica pela matriz e quando ela passa pela matriz tudo que não interessa tão proteína de brim celular que a gente químico ele passa e passa reto por

essa matriz não fica retido e o seu alvo seja ele dna rna para atingir o que você tiver trabalhando ele vai ficar retido nessa matriz ele vai ficar retido ele Vai ficar preso então o que te interessa o seu dna o seu arranhar ele tá preso aqui dentro o que não te interessa tá aqui em baixo tá aqui fora tá aqui nesse no tubinho que você coletou amostras durante o processo de furação acontece isso amostra passa pelo pela matriz o dna ficar preso aqui e o kit não te interessa fica fora e aí o que

você vai fazer você vai pegar esse tubo que não tem tudo que não te interessa e jogar fora vai lá no lixinho E joga fora e sabe o que você vai sentir nessa hora você vai sentir um cagaço você vai sentir um cagaço porque tudo que você fez até agora bem lado sei lá que você faz o mestrado doutorado se você sei lá o que você faz tudo que você fez ele está concentrado neste momento aqui nesse sobrinho e você está confiando que a sua morte de mr ela ficou retido aqui e o resto não

ficou e o resto passou reto então você vai pegar essa tinha jogar no lixo com muito Cadarço não tenho agora vai cagar sair você vai fazer esse processo de novo só que agora você vai colocar soluções de lavagem aqui para você vai lavar essa amostra de dna e renato tá preso você vem aqui com uma solução de lavagem que vem no kit e peça a sua solução aqui dentro centrifuga de novo mesmo processo vai acontecer sua mostra vai continuar que presa na matriz só que agora ela tá sendo mais purificado ainda está ruim o outro

resíduo que não interessa vai Repetir esse processo mais duas ou três vezes depende de você tiver fazendo e aí por último você vai eloir essa mostra então você jogou fora um monte por criado umas duas três vezes nesse processo centrifugação na última vez que você fizesse processo você não vai adicionar algo aqui você não vai adicionar etanol você não vai adicionar a solução de lavagem que vem no kit você vai adicionar a solução tampão ou água e a solução tampão ou água agora que a sua Moto está lavadinha com a solução de lavar junto com

etanol diz era eles ela pode ser o sub solubilizada em água de novo ela pode ser reidratada e quando isso acontece ela se desprende dessa matriz e vai lá para o fundo do tubo no processo centrifugação agora se você não vai jogar essa aqui fora é isso aqui que você vai guardar né um tubo novo né você não vai usar o mesmo tudo que estava usando aqui para porcaria ela todo você pega um tubo novo e aí você louis Amostra amostra se desprende aqui desse dessa colônia é uma dica que eu dou para vocês aqui

é o seguinte se você tiver trabalhando com uma uma mostra que tem pouco dna ou pouco rma você pode fazer esse processo de eleição mais de uma vez tá porque você tem cada vez que você centrífuga você tem a possibilidade maior de retirar qualquer resíduo de dna renata ter ficado a quinta você fez a o processo de eluição com água com tampão E só vem aqui para o fundo você tira essa mostra aqui do fundo e joga lá de novo aqui dentro de centrífuga de novo e aí você tende a aumentar um pouco a eficiência

desse processo de purificação por que que eu tô falando isso porque esse processo aqui em termos de quantidade ele é bem mais limitado que final clorofórmio aqui você você tem uma uma limitação física da matriz com a limitação de capacidade de retenção dos faço nucleico alvo é que a individual de Cada matriz então você tem uma alimentação de quanto que você extrai apesar do processo de purificação ser oi gente o rendimento em termos de quantidade é um pouco pior vamos ver aqui eu vi que chegou uma coisa na priscila forma pet aqui não foi uma

pele outra dica já que você não consegue ver pele aqui é jogar a sua solução tanto de lavar ge ou a solução de diluição bem no meio da colônia você pega alumínio lá olha lá de cima e pétala bem no meio Assim que isso ajuda porque não forma a pele tá aqui não você não você não faz uma centrifugação forte o suficiente para gerar pallet que o seu processo a ideia é só passar pela coluna oi e essa aqui é a foto né daquilo que eu acabei de mostrar então essa aqui é a coluna é

aqui que você joga mostra a atriz essa parte branquinha aqui ó tá vendo você consegue pipetar aqui no meio sem encostar pipeta aqui tá não encosta pipeta pipeta aqui bem no centro mas sem Encostar aí coloca essa coluna aqui em cima e centrífuga de qualquer forma está trabalhando coluna de sílica é não é opção mais cara a bíblia mais cara também não é mais barata porque o final clorofórmio tende a ser mais barato é muito eficiente na purificação então você aqui provavelmente vai ser um dna ou rna bem por mim quando você terminar é confiável

porque é muito utilizado muito utilizada é rápido é mais rápido que final Clorofórmio é menos rápido que a babidi mas é mais rápido que final tô fora qual é a desvantagem você tende a ter menos dna rna porque essa matriz aquela tem uma limitação física mesmo de estrutura de superfície de capacidade de reter o alvo então você tende a ter menos dna rna pode entupir se eu tiver trabalhando com a morte é difícil amostra fibrosa algumas plantas aí pode entupir quando um top é um saca então cuidado com a moça ficou nem tupia e o

processo também Manual né ele é menos manual usando que o final curou formas ele é manual em há uns belos que eu vi perguntas qual a solução tampão utilizada na eleição a mesma coisa até ou água tá e até ou água os dois oi e a gente vai para o último método que é são os bits magnéticas as birds são experiências positivamente carregadas se elas são positivamente carregados elas têm afinidade a carga negativa quem tem carga negativa ácido Nucleico e elas são misturados com só nosso dna eo rna se associam suas beats e posteriormente essas

bits serão removidas por um ímã vamos ver aqui lá então de novo amostra acabou de ser usada você tá com sua mal se dna aqui dentro o rna tanto faz que eu tô colocando um dna zinho mas pode se arranhar a mesma ideia tá então você tá com a sua morte realizada aqui a bíblia ela tem afinidade diferencial para de me arranhar se você precisar de compra isso Você compra então você tem aqui é só almoça aí o seu ácido nucleico ele vai se ligar nabbed que você mistura ele elas ficam todas as ligadinhos e

aí o que que você vai fazer pegar essa esse tubinho e colocar perto de um imã uma bem forte bom e quando você faz isso essa mídia que que ela é magnética ela vai ser atraídas pelo imã e aí quando ela atrás da pelo ima fica todo mundo juntinho aqui ó todas as bíblias com um monte de Dna ou onde assinar elas ficam todas presas aqui perto do ímã aí já que tá todo mundo aqui peso do ima que você pode fazer é simplesmente com a pipeta puxar essa solução suja que tem proteína que tem

o seu produto químico que tem as ela não sei o que você vai retirar essa aqui com a pipeta e deixar só bid com dna e reali dna ou rna os dois vai ficar empresa no ima e aí o processo é o mesmo você vem com solução de lavagem tira do ímã tira do ímã tem uma solução de Lavagem mistura aberto solução de lavagem para lavar aquele dna qualidente lavar o rn está ali dentro faz esse processo mistura às vezes pode até vou te caçar e aí põe perto do imã de novo tira essa solução

de lavagem coloca uma solução de lavagem nova é mesmo esquema a lava bem passa bem mesmo mas o kendall com bastante vigor e que iphone mão de novo e faz se fosse as duas ou três vezes exatamente com os outros e a última vez que você fizer você vai Adicionar a sua solução de eluição que também pode ser a água também pode ser uma solução até ou uma outra solução tampão você vai vai misturar sua solução de eluição aqui e quando você faz isso as moléculas alves ela se desprendem da beach ela se desprende da

bíblia assim como desenhar se desprende lá do da matriz e se liga mesa mesmo raciocínio vai respondendo a vídeo mais abid continua presa que não irmã é que você vai fazer você vai retirar essa solução E passar para o tubo novo e aí você tem seu dna purificado eu vou passar um vídeo aqui eu não sei como é que ele vai passar na live tá mas aí depois da aula a aula gravada vocês conseguem ver é um vídeo w rádio e eu peguei aqui porque ele mostra muito bem esse processo aqui é brilhante o vídeo

é muito bom é da do kit de libid e aí fica evidente como é que funciona deixa eu tirar o áudio que eu não quero o espaço o áudio que não precisa eu vou Falando aqui para vocês a antes antes do vídeo se vocês nunca viram isso na vida porque acho que dos três métodos é um menos utilizar não sinta mais utilizados mas aqui no brasil pelo menos é porque ele é caro né mais barato e ele é muito muito puro e muitas vezes não precisa pureza toda não sei que vocês trabalhando com pensar em

tempo real eventualmente ou dentro do protocolo de sequenciamento de nova geração aí eu utilizar bastante olha só essa aqui são Bits são exemplos de bicho tá vendo escurinho é essa daqui seus cursos mas nem todos são escuras você vai colocar isso aqui dentro de outubro está com amostra e colocar sua mostra perto de um imã então que as raposinhas são hackers magnéticos já compra lá com imã você coloca sua mostra aqui e às vezes vão migrar para perto do ímã então aqui tem mas se você trabalha com tubinho de um e-mail por exemplo se você

trabalha com placa de 96 você consegue utilizar essa Sax como que são compatíveis com placa essa aqui com placa também essa aqui com os melhores aqui com tubo é cônico maior e assim vai e agora acho que vem o vídeo vamos ver aí vem um vídeo mesmo olha só que legal tô aqui são as bits ou se vai colocar suas tubinhos aqui nessa rack esses redondinhos aqui sozinhos são irmãos bem fortes viu é só aí no caso da bio rad minha obra de arte não tá me pagando não viu aqui o vídeo foi bom mesmo

você tinha consegue Tirar o imã mas nem todos você consegue chegar também não precisa tirar não precisa tirar ajuda para algumas coisas não precisa só amostra chupar usar aqui amostra ela tá aqui misturada com a bid por isso que tá escuro assim tá né que a mostra é suja não é que a bíblia é escura mesmo tá nesse caso aqui e aí você vai colocar perto do ima e olha que vai acontecer isso que vai aparecer agora não está acelerado tá não é um vídeo acelerado não e aí vídeo em tempo Real mesmo ele faz

nessa velocidade dá uma olhada colocou algumas vezes não migrando lá para o imã e é por isso que esse sistema de purificação excelente é muito rápido é muito eficiente essa aí é você tira a solução que não te interessa aí tem proteína tem debris celulares tem produto químico sets fora e a mostra fica ali presa no nabbed aí depois você lava aquela beach e andou até com água leal E deixa eu ver se não temos perguntas boa seguimos vantagem muito rápido e fácil acho que ele dos três eu já fiz os três metros bastante na

vida mas acho que bid foi que eu mais utilizei eu trabalhei bastante com ngs e o protocolo dns demanda bastante isso eu trabalhei vários vamos trabalho muito com isso eu não faço usar é muito facinho diminui o risco de contaminação né porque você tem não precisa puxar camadas não tem a camada de proteína lá por exemplo é bem Versátil quero dizer com isso aqui funcionar para vários tipos de amostras é passível de automatização é que tá o pulo do gato por que que essa técnica é muito utilizada o pelo menos ela tende a ser utilizado

em laboratório que tem alta demanda por que dá para automatizar você pode fazer de maneira manual como eu mostrei ali no vídeo né ou mostrando meus slides mas você pode comprar equipamento e faz isso de maneira automatizada aí é rapidão A desvantagem é caro se você for comprar o processo automatizado equipamento para automatizar bem caro mas mesmo a mídia ela não é barato não é carinho e a rake magnética também não é barato é cara você precisa da rack para fazer ó e aqui ó foi o que eu já falei para vocês ninguém não precisa

de eu deixar esse esse site aqui para quem quiser dar print depois pode dar print que é um resumão disso tudo que eu falei tá então tem lá os três métodos é qual a vantagem Dos vantagens que a gente passou e os tipos de amostras que são de casa só final clorofórmio para a nossa mais difícil difícil de macerar é muito viscosa aí vai para o final que o uniforme que funciona bem se você demanda a quantidade na sua aplicação você vai precisar usar muito dna o muito real vai utilizar aquele dna e rna em

várias aplicações lá na frente o vários experimentos lá na frente pode ser interessante final clorofórmio e aqui Você consegue extrair dna de alto peso molecular também as colunas é recomendação evitar a mostra que pode entupir tão muito viscosa ou eventualmente a mostra que você não consegue mas será ou muito bem então fica grumos ela pode ir entupir é se você tem uma demanda de pureza muito grande não o oi play a demanda de pureza muito grande colônia interessante se você não tem demanda tanto a demanda de Quantidade porque você vai vai extrair menos quantidade e

se você precisa de tamanho específico também porque a colônia legal você consegue extrair é dna você consegue extrair rna você consegue extrair aí né a minha real você consegue extrair é quase mídia então você consegue fazer uma extração diferencial aqui e as birds se você demônio da velocidade praticidade é de magnésio por eles altíssima pureza mídia tá senão o cara vai na bíblia se você Tiver dinheiro se não vai nas outras e vamos ver que chegou uma pergunta aqui para microbioma de matriz específicas como queijo o metro de brita seria recomendado cara não sei te

falar é muito eu acho que sim eu diria que sim mas o sabe qual que é melhor coisa que vocês podem fazer quando você estiver esse tipo de dúvida vai lá na primeira aula dessa série aqui a nota aquelas perguntas que vocês tem que fazer para vocês mesmos e passa informações para os Seus possíveis fornecedores porque eles ninguém melhor do que eles para falar com o método que eles têm que é mais indicado para sua mosta a ele tem um portfólio gigantesco desse tipo de coisa com a todos empresa vender aí você tá ele tem

um portfólio muito grande é de soluções extração e purificação então você chegar para os caras e e passa a responsabilidade para eles olha minha situação essa daqui que você tem que funciona para mim passa para eles a Responsabilidade eu tô falando isso porque eu trabalhei eu já estive do outro lado e de todos os lados e faz isso que ajuda a gente quer entender eles têm especialistas dentro da empresa que podem que eles podem consultar tão passa de mandar para eles nós que não vai cegamente também dá uma olhada de protocolo estudo que eles indicarem

máscara vai né deles que vai bem e se vocês forem várias empresas lá no site Delas tem árvores de decisão que você vai colocando informação sobre a sua situação ele vai perguntar se é o que deu nela e na dna é você precisa de muito pouco surgiu muito vai trabalhar com célula tecidos ela vai entrar com vocês é você vai respondendo algumas perguntas no final ele vai te dar uma lista do que a indicada para a sua situação faz isso que é melhor solução porque é muito particular de cada caso e três pontos atenção para

finalizar Aqui me primeiro caso é mais para quem trabalha com solução caseira dificilmente hoje trabalha com ela dificilmente né mas tem cada vez menos gente trabalha numa solução caseira cuidado com ph e concentração de sal tá porque isso alterado você pode alterar a carga do assunto clico que você tá selecionando e diminuir a sua capacidade de associar os a coluna se eu tiver trabalhando colônia ou com a bit for cabide ou sobre o solubilizar em fase Errada lá no final do uniforme então a gente pegar a concentração de sal é tem que ser muito cuidadosa

se você já fazendo de maneira caseira aqui ó dica legal volume de tampão volume de tampão é interessante você tomar cuidado porque quando você coloca - tampão do que você ficou rindo achando de tampão aqui é solução de mc tá solução que você utilizar lá no processo de purificação então o volume de tampão esse é o tampão final não não é de luz são é lá no Processo deles lá no processo de purificação e você coloca pouco e o pouco ou muito de acordo com cada protocolo vai ler o protocolo serve protocolo é isso que

eu te digo não sai muito protocolo não sei que você precise se você está fazendo teste beleza mas se você não tem espaço para fazer teste segue o protocolo então segue o tampão se você tiver utilizando - tampão - solução deles do que está indicado no protocolo que pode acontecer Você alisar - a célula você inativar - dna e rna 7 inativar menos as suas nucleares porque você nessa solução geralmente os sais caltrops eles vão eliminar suas proteínas hoje não tiver essas proteínas se você tá trabalhando com menor quantidade de sal tópico ou solução denise

do que você tem relação ao se assumir nucleico você posta agradasse nucleico e o contrário também não é legal se você trabalha com a solução com uma quantidade a mais Daquela daquele tampão para aquela solução deles do que é recomendado protocolo você tende a carregar os que a gente como o clorofórmio sais caotropicos lá no processo diluição e que vai inibir suas reações no futuro então cuidado com o volume só pode me gerais em completa ações e mágica para que vai degradação dna aí né a contaminação igual a feito isso contaminação por etanol lembra que

eu falei para vocês sempre o último Passo ou penúltimo passo de qualquer qualquer um dos três sistemas de purificação que você para vocês é o que lavagem com etanol ou com solução de lavagem que é basicamente etanol ele tava com outras coisas você tem que fazer aquilo que eu te falei não deixa o pallet secar demais mas não deixa ele molhado demais com etanol não deixa ele úmido demais canal se você deixar ele com muita canal você vai contaminar as suas reações lá no futuro em minha Reação de pcr pcr em tempo real seu dna

ele pode flutuar ao longo da eletroforese e perder resolução e também não seca demais que se você secar demais você pode ter dificuldade para retirar o dna dhabi o david por exemplo ou formar grumos se você tiver trabalhando com final cloroformo e render menos seu processo de eluição tão de três a quatro minutos tá ok esse modo geral tá então contaminação preta nós beleza então Vamos começar agora com os três passos de controle de qualidade que você deve ou provavelmente deve fazer prova a gente precisa fazer depois do processo de extração e purificação de sua

mostra você necessariamente vai precisar fazer isso controle de qualidade não necessariamente depende da muita sua aplicação depende o que você tá fazendo como eu disse no na aula anterior esses tá aplicações situações muito específicas que você não demanda Purificar mostra eventualmente nem extrair então nesses casos você não precisa ter um controle de qualidade mas são exceções de um modo geral a grande mas da grande maioria das vezes você vai precisar assim fazer esses três passos de controle de qualidade e se não quiser os três dois deles são altamente recomendados tá quais são você precisa fonte

ficar você precisa saber quanto de material dos próximos foi que você conseguiu extrair purificar o nome Daqueles aquele processo você precisa saber pureza será que você teve contaminação no processo será que você que tá tentando extrair dna contaminou somoscom rna ou vice-versa será que tem proteína será que tem fenol álcool você precisa saber como tu está só mostra e aí por último também integridade você conseguiu extrair você conseguir uma quantidade boa a pureza tá boa agora esse assunto só que ele tá indo será que ele não foi degradado por enzimas no Caso de remessa será

que a sua morte de a reunião foi degradado por r nazi você não consegue fazer isso não consegue mensurar isso ao longo do processo de modificação e nem de identificação da pureza você precisa de um terceiro passo o que é verificar integridade bom então esses três passos estão aqui a gente vai começar falando da quantidade na aula de amanhã a parte de integridade se você tiver assistindo aula completa então primeiro vai ser a parte Quantidade depois de integridade depois a pureza ea pureza aula sobre pureza vai ao ar na quinta-feira e diferente das outras aulas

a gente vai fazer essa aula ao vivo beleza então se você quiser assistir aula ao vivo sobre pureza que vai ao ar quinta-feira às 11 horas da manhã aqui no youtube você só precisa entrar aí na no canal da biologia molecular ações da manhã e a gente vai começar a aula se você quiser ser opção também é de que cai no botãozinho que o Youtube permite mandar um lembrete avisando que a live está no ar beleza então vamos lá vai vamos falar de quantificação a quantificação é o primeiro passo no controle de qualidade vocês tem

que fazer a quantificação e pode ser feita por 3 m eu vou falar dos três métodos ao longo dos outros passos o controle de qualidade mas o método mais adequado a técnica mais adequada para se cuide ficasse nucleico essa daqui que a fluorometry dia você Vai fazer a medição de um a gente florescente que se chama fluorometry e aqui ideia é bem simples aí talvez os três passos de controle de qualidade o mais fácil de entender esse daqui porque você vai quê que você vai fazer você tem a sua mostra você acabou de extrair e

purificar aí você vai pegar um pouquinho dessa mostra uma lhe conta dessa mostra passar por um tubo novo nesse o tubo novo você vai adicionar ali dentro um a gente fluorescente misturado com uma Solução tampão tão solução tampão junto com a gente florescente e você misturou e uma alíquota de um ou dois microlitros da sua mostra mais ou menos que que vai acontecer esse a gente fluorescente e sem solução sem estar na presença de um ácido nucleico ele emite uma fluorescência bem baixinha mas quando ele se associa um ácido nucleico seja ele denial aí né

ele então isso é proteína mas hoje aqui no caso me interessa proteína quando ele se associa O seu ácido nucleico alvo ele passa emitiu muito mais fluorescência o que limite solução então quando você mistura o seu dna ou rna com esse a gente for a gente está ali um tampão se o seu material genético tiver presente aquele fluoróforo aquele gente for a gente vai se ligar seu material genético e emite fluorescência e aí tem um equipamento ki-kafta essa florescência então que eu tô mostrando o seu bem aqui no caso não dna ou a gente for

e sente-se ligou esse Dna e ele passou a emitir muito mais flor essência tá então lembrando a gente florescente quando ele tem solução sem a presença do ácido nucleico aqui é o dna e limite uma flor essência baixinha mas quando os dois se encontram dna igual a gente florescente se encontra a fluorescência o que passa a ser muito mais forte existe um equipamento que captura essa flor essência tá mas como é que se modifica a partir daí muito simples a Ideia é quanto mais ácido nucleico você tem na sua mostra maior é a quantidade de

flor óculos se ligando a ele consequentemente maior é a fluorescência gerada o nível de florescência gerado naquele tubo portanto o nível de florescência que você gera nesse processo aqui ele é direto diretamente proporcional a quantidade do seu ácido nucleico ali naquele tubo tão quanto maior a quantidade do ácido nucleico maior é o nível de fluorescência que a Gerado é isso aqui ó aqui a gente tem aqui a gente tem uma molécula de dna uma quantidade de fluorescência que está sendo gerado no tubo por quê porque a gente tem uma quantidade flor óculos proporcional ligados a

quantidade de na na mostra aqui a gente tem mais dna amostra mais concentrada com rendimento mais a extração e purificação consequentemente a gente vai ter mais a gente fluorescentes ligando a todas Essas moléculas de dna aqui e o nível de florescência vai ser maior então de novo o nível de florescência gerado nesse processo é diretamente proporcional a quantidade que você tem disse o ácido nucleico e o equipamento vai detectar nível de fluorescence que vai colocar o aqui você vai fazer esse processo aqui tudo fazer a mistura do seu a gente fluorescente com uma solução tampão

com a sua moss brinco bali por alguns minutinhos se eu não me engano são dois Minutos eu não tenho não é mais é pouco deixa alguns minutinhos alienco bando e você vai pegar essa mostra esse tubinho colocar o equipamento equipamento vai detectar fluorescência bom então de novo a intensidade de um sinal florescente é proporcional à quantidade do ácido nucleico nosso almoço simples assim e qual que é a beleza desse negócio aqui é que você vai utilizar um a gente florescente que é específico para cada ácido nucleico Então você pode utilizar aqui no meu exemplo não

sei se é sakura não tá mas aqui no meu exemplo um a gente fluorescente verde que se associa especificamente a dna dupla fita um a gente florescente verde que se associar dna dupla fita e um a gente florescente vermelha que um outro a gente for recente que se associa especificamente a molécula de rna por que que você tem importante porque que só que é legal porque se você tiver uma amostra de dna E essa amostra de dna tiver um nível ainda que baixo de contaminação por r a que é comum se você não detecta a

presença do rna contaminante aqui e e o inverso também é verdadeiro se você tivesse trabalhando com uma molécula de rna se o objetivo é é trabalhar com rna e você tiver uma contaminação ainda que pequena por dna você não detecta você não conte fica esse é o dna contaminante na sua mostra de rna e por que que eu tô te falando Isso porque vocês vão ver lá na hora de quinta-feira e quando a gente faz a quantificação e é possível também fazer com notificação por espectrofotometria é a outra técnica que permite fazer quantificação a espectrofotometria

ela não permite ela não consegue discriminar um ácido nucleico do outro você não sabe no processo de quantificação ali se você tá quantificando o dna eo rna na sua mostra então necessariamente na maioria das vezes que você conte fica uma mostra Que o espectrofotometria por exemplo é o nó drop que é o mais utilizado você quase que necessariamente está superestimando a quantidade dos e itá por isso que a flor e mytria ela é mais indicada para quantificação porque ela só conte fica o seu alvo específico porque o seu utiliza flor óculos que tem afinidade ao

seu ácido nucleico alpha você não conte fica com camisas é assim que funciona então cuidado inflorescência proporcional à quantidade Do seu alvo ali dentro bom e como que você faz isso então você compra esses reagentes né esse tampão flor ok para você vai misturar com male-male conta de um dois três microlins saída só mostra e você vai colocar isso um equipamento que tem a capacidade de ler essa flor essência que está sendo gerado ali e transformar esse a intensidade de sinal florescente em um valor numérico em uma informação digital em quantidade cronograma por microlitro Por

exemplo e aqui eu tô e mostrando alguns exemplos de equipamentos que fazem isso tá então vocês aqui são flores metros isso aqui também é mais do que folclore muito mas ele também ler fluorometry ia então esses equipamentos e a capacidade de pegar a fluorescência gerada ali no seu tubinho e transformar-se intensidade gente não fluorescente em valor numérico beleza a flor aletria qual que é nó logia que a gente poderia fazer então aqui eu tô Mostrando para vocês holofote né se canhão de luz aqui analogia seguinte fazer determinar a quantidade de mr na o seu álbum

almoça por fluorometry há mais ou menos como se você tivesse um canhão de luz ou vários canhão canhão de luz que estão desligados apagados mas de repente você vai ligar suspeitos quanto maior quanto maior a intensidade de luz que vai ser gerada então conta um a quantidade de dna você tenha só nosso rc na sua nossa maior é a intensidade do Sinal florescente tá bom qual é a vantagem é rápido e fácil de fazer muito fácil de fazer não é mais fácil aqui espectrofotometria mas é muito rápido e fácil rapidinho você faz tudo várias a

mortes o equipamento ele tende a ser mais barato que o espectrofotômetro tal você tá confuso spector espectrofotometria espero que tá faltando que tô falando se preocupa não falei sobre isso ainda a gente vai ver na hora de quinta-feira tá Mas ele tende a ser mais barato aqui um flor immetro se é mais barato com espectrofotômetro determina dna discrimina dna de rna e proteína se você quiser e de né a ficar simples se você quiser também ele faz isso e ele pode quantificar a integridade de rna esse negócio que quase ninguém sabe mas existem soluções baseadas

em fluorometry aqui permite detectar e quantificar a integridade a sua molécula de rna que aí é um outro ponto de controle de Qualidade da mas dá para fazer por flor um metro e também é um kit específico uma situação específica se você tiver curiosidade de saber eu não vou deixar de mão beijada não deixa aí nos comentários que eu conto para vocês mas tem que me perguntar e é legal é uma é uma solução bem interessante qualquer desvantagem ele utiliza reagente diferente no espectrofotômetro que você não está comprarem a gente só de louis amostra se

tiver indo em ócio Se você precisa de não ia mostra comprar reagente que são os agentes florescentes e a solução tampão não dá para misturar pureza aqui você não sabe fazendo essa análise você tem contaminação por etanol por fenol sei lá o quê proteína não vai não vai determinar por isso é e é uma técnica menos utilizada quando se compara com spectrophotometry então é só equipamentos que tem tem de se ter menos comuns laboratórios todos você vai trabalhar um laboratório você tem mais Chance de encontrar um encontrar um espectrofotômetro do que um fury e aí

a gente vai para o segundo ponto de controle de qualidade a gente vai falar hoje que é a integridade quer saber agora o quão íntegro está o seu dna com inteiro estácio rna é isso que você vai querer saber porque você consegue mensurar a quantidade que você já mensurou a quantidade vamos supor você tenha mensurado a pobreza também nesse ao longo desses dois processos você não Consegue saber sua mostra tá integral não que você consegue quantificar ácido nucleico mas você não sabe se aquele a eu tenho tempo podem está gerando um sinal fluorescente ali está

conseguindo ver a pureza por espectrofotometria mas a integridade você não consegue saber você precisa desse método aqui para determinar a integridade que é o seguinte qual que é o raciocínio por trás se determinar a integridade imagine que você tem uma mostra integral se você Tem uma amostra de dna ou rna entendeu o que que vai acontecer ele você vai ter vários fragmentos de um mesmo tamanho vários fragmentos e o meu sua mãe você não tem não conseguiu degradação ali né fala do jeito que você saiu da sua célula o seu tecido agora se você tem

uma moça degradada degradou com o tempo degrador por enzimas não importa o que que vai acontecer as enzimas elas vão picotar o seu ácido nucleico algum diferente tamanho quanto mais tempo essa Mostra estiver sujeita a degradação maior a quantidade de tamanhos diferentes que você vai ter de fragmento da linda então a gente uma enzima degradantes não deixar lá um tempo ela vai ficar o seu alvo em a mãe se ela deixar por mais tempo ela tende a ficar mais ainda gerar fragmentos cada vez menores portanto quanto mais degradado é uma amostra maior a quantidade de

fragmentos de diferentes nações você tem nela que que Sai e que isso interessa como que eu vou descobrir por que você tá me falando isso porque existe uma técnica que permite você separar fragmentos de dna aldea reagir o tamanho diferente de peso molecular diferente que é a eletroforese eletroforese não faz isso você não consegue separar fragmentos de tamanhos diferentes ao longo do processo eletroforese um gelzinho a então se você consegue separar moleques tão diferentes fragmentos diferentes você consegue Determinar ou saber qual o íntegro estar sua mostra fazendo eletroforese olha aqui então de novo a mostra

as íntegras elas possuem muitos fragmentos de um mesmo tamanho da por exemplo se for um dna genômico vai ter um a quantidade x daqueles fragmentos todos é porque é também a janela que você saiu não está degradado nada aconteceu ali são moléculas do mesmo tamanho amostras degradados elas possuem muitos fragmentos de tamanhos diferentes alguma Enzima alguma coisa aconteceu ali picotou aquele seu dna genômico o sonhado em diferentes tamanhos em vários fragmentos de diferentes tamanhos então você vai ter uma população muito grande do seu assunto e coautor de tamanhos diferentes se você fosse pegar uma molécula

de dna genômico por exemplo você está trabalhando com o dna genômico extraiu por ele ficou como ficou tá tudo certinho agora só vem integridade e não sabe fazer vai fazer uma eletroforese Vai pegar uma alíquota daquele seu ácido nucleico alvo daquela só mostra o dna genômico que é o seu alvo nesse caso vai fazer uma eletroforese com ela vai colocar aqui no focinho do seu gel uma mostra um amostra dois amostra 3 amostra 4 quando você faz eletroforese por ser um fragmento grande porque nós vamos dei um exemplo de dna genômico essa banda nessa quantidade

o seu fragmento ao seu dna genômico alvará tende a migrar pouco nesse gel Por quê porque a genômico é uma molécula de alto peso molecular de grande peso molecular estão amostras íntegras de dna genômico elas tendem a migrar pouco né no processo eletroforese e manter uma banda bem consistente como eu tô mostrando aqui no meu esqueminha é uma banda só que bem consistente a nossa está íntegra essa mostra está íntegra essa está íntegra agora uma moça degradada como a gente gerou vários fragmentos de tamanhos diferentes que Que você tem de haver lá no processo de

eletroforese um arraste não a banda eventualmente uma banda que em cima seguida de uma raça uma banda lá embaixo ou nem tem banda aqui em cima nem banda aqui embaixo só o arraste mesmo e se arrastando vários fragmentos de dna de vários tamanhos diferentes todos os produtos da degradação de uma enzima e por exemplo se você quiser ver isso para quê que eu tô mostrando uma foto de o mar em uma foto de eletroforese uma Amostra de verdade está aqui ó tô nós temos uma duas três quatro amostras aqui é a mostra unha nossa três

e evidentemente são íntegras né uma banda só bem consistente aqui bem fácil de ver sem arraste a nossa quatro ela pode ser que esteja um pouco degradado apesar da gente não tá vendo a uma raça aqui mas não tá vindo uma banda um pouco mais fraco aqui mais é mais provável que seja uma mostra com menor quantidade mesmo então ficou uma fluorescência uma Bandinha mais fraca pode ser é provável que ela esteja integrada na verdade só que em menor quantidade de que a mostra três que mostra um e amostra dois almoçou está difícil de falar

né tem uma bandinha aqui um pouco menor e um arraste zinho não sei se vocês vão conseguir tá bem fraquinha né é possível que essa mostra além de ter pouca quantidade ela esteja degradada ou simplesmente degradada mesmo porque não foram nem banda todo o dna público E segurou a longa eletroforese tá então é isso aí ó três almoça sim tem grande uma degradada aqui provavelmente e no caso da rna eu falei deu exemplo o dna genômico ele arranhar dá para ver também na eletroforese da da porque se você trabalha com rma total você vai extrair

todo tipo de arranhada só mostra né vai distrair aí na mensageiro transportador e bolsonaro eventualmente os micrornas também os longos não pode ficar ele vai estragar tudo que ali e qual é a População de rma que a mais presente numa célula rna ribossomal ainda estão aí é grande parte do rna que você tem uma célula rna ribossomal eo rna ribossomal no caso de mamíferos você vai conseguir ver duas bandas bem específicas uma banda mais pesada um boceja de fragmentos maiores que o rna ribossomal 28s e uma banda menor de fragmentos menores que a referente à

rna ribossomal 18s e você vai conseguir ver outros rms Bolsa mas também como cinco é se eu não me engano você consegue ver outras bandas mas é evidente que você consegue ver o 28s e um 18s que são os rn as mais presente na sua morte maior quantidade e quando você faz eletroforese deles é isso aqui que você vê então aqui nós temos a mostrar uma mostra dois colocou as amostras aqui no topo fez eletroforese moléculas moléculas vão migrar a as moléculas de dna e rna ribossomal 18s tem peso molecular menor Então as amigas um

pouco mais rápido que as moléculas tu-28 ask me dá um pouco mais devagar e geralmente é realmente não o que acontece eu 28s ele tem maior quantidade que o 18s então sobre uma banda mais forte com 18 28 s em relação a 18 horas trouxe aqui é um exemplo de um duas amostras íntegras né então duas bandas do sul rs que bolsa mais bem determinados aqui forte uma raça zinho entre elas é relativamente comum e aí a outra E a banda menor embaixo referente o 18 tá isso para mamíferos estiver trabalhando com outras espécies vai

ver os rns embolsou mais também só que eles são outros tamanhos mas vezes reconhece o bolsão mas também e a nossa degradada como é que aparece parece assim ó sem as duas bandas definidas fica só um arraste as vezes teve uma bandinha mais fraca lá no final mas lá na frente eletroforese ou sol arraste mesmo que eu só mostro degradadas ou seja o que que você fala Aqui que você dedos é que cê os seus rms que o bolso mais 28 se18 essa estão degradados é possível que os outros é reação da sua reação da

sua mostra também sejam degradados necessariamente não necessariamente mas é provável então você utiliza o 28 18s como referência para ver se eles estiverem degradado existe uma grande probabilidade uma grande possibilidade dos outros r nas provavelmente seu interesse uma eu vou me internar é possível que ele Seja grato e aí o micro é minha por ser menor em sofre menos com o processo de degradação né por ser menor tende a degradar mais lentamente mas pode gravar também e provavelmente o seu rna mensageiro vai está degradado também quer ver foto real de uma eletroforese real tão tá

aqui ó nós temos uma mostra aqui a mostra uma bem evidente o 28 se18 essas duas bandinhas aqui bem determinadas amostras íntegras amostra dois ela ou tá em Pequena quantidade muito pouca quantidade gente não consegue nem ver a presença da banda mas é mais provável que ela seja degradada por que existe aqui um arraste ó bem fraquinho de uma bandinha branca de um arraste osmir branco aqui e a nossa degradada claramente degradados são essas duas aqui então até consegue ver uma banda do 2818 essa aqui né até consegue ver mas olha eu arrasto que nem

tenho vários fragmentos estão diferente totalmente Degradado almoça aqui e então qual que é a vantagem de se analisar integridade por eletroforese em gel até agora eu falei de gel né depois vocês vão ver que tem uma outra outra situação aqui qual que é a vantagem quais são as vantagens você faz uma análise visual de integridade bem simples né presente ou não aqui tá incrível ou não usar ribossomais são fáceis de serviço de um jeito geralmente é bem fácil de ver uma técnica de fácil Acesso eletroforese né do laboratório tem baixíssimo custo e permite a detecção

de contaminante por outros assim muito legal se eu quero dizer o seguinte se você tivesse aqui se objetiva a extrair purificar rna você vai ver essas duas bandas massa se você tem uma contaminação é considerável com é com dna dna genômico por exemplo você veria aquela banda de dna genômico aqui em cima né e se fosse no caso de dna você tem amostras de dna e está Contaminando a morte dna com rma você veria um dos reembolso mais aqui para baixo se consegue detectar a presença de ácidos nucleicos contaminantes qualquer desvantagem para várias aplicações não

tem vantagem nenhuma mas se você vai fazer quantificação de análise de expressão vão fazer análises expressão gênica por exemplo aí você pode ter uma grande desvantagem que é você consegue saber sua mostra degradada ou não mas Quando ela está degradada você não sabe você consegue ver se consegue fazer uma análise qualitativa mas não quantitativa da sua degradação e saber quantitativamente a degradação dos famosos no nível de degradação da sua moça pode ser fundamental porque você pode estabelecer um limiar e falar partir desse tanto de degradação eu não analiso mais não vale a pena eu seguir

com meu experimento a degradados demais posso inserir muito viés no meu Experimentos então com valor numérico você consegue tomar decisões mais acertadas e como se resolve isso você vai fazer outro tipo de lá e você vai fazer uma eletroforese conceitualmente a mesma coisa exatamente do jeito que você conhece eletroforese só que ela acontece de frente mente dentro de uma estrutura diferente que é um capilar aqui no caso cama eletroforese você vai colocar tampão polo positivo ou negativo seu amostra de N ao dr na vai ter um a gente fluorescente é só mostra vai migrar e

separar por peso molecular mesma coisa só que vai acontecer dentro de uma estrutura diferente dentro de um capilar que que no caso dentro desse chipizinho eu tô mostrando aqui a o equipamento mais utilizado para se fazer isso que é o bioanalyzer da agilent a gente tem outros equipamentos que fazem estou bem mas eu tô mostrando aqui o mais clássico e vai fazer uma eletroforese do jeito Que você conhece você vai misturar só almoça com a gente florescente ela vai migrar só que você não vai a parte que ele frente aqui você não vai visualizar a

migração no gel não vai ver banda em um gel a migração vai acontecer no capilar e o equipamento vai detectar a a missão do seu a gente florescente impregnado no seu alvo tão você vai ver resultado mais ou menos assim tão aqui no caso eu estou mostrando rna eu estou mostrando o resultado de rna rna total e Portanto do mesmo jeito que eu expliquei lá tem em grande quantidade os ribossomas mamíferos 28s 1018s então se a gente tivesse olhando para um gel de eletroforese seria uma migração aqui nesse sentido a letra ofereceria acontecendo aqui da

direita para a esquerda aqui nós teríamos a banda maior tá referente ao 28s a banda menor referente às 18 sl que eventualmente os microgenia as outras coisas aqui tá não importa agora porta que a banda do 28s 18s então deve mesma coisa que você viu lá no gel só que ela acontece um capilar o equipamento ele detecta aquele aquele aquela intensidade de sinal fluorescente e gera isso esse gráfico gera uma informação digital e aí onde está o pulo do gato até que mesma e mudou muito não acontece que esse equipamento aqui ele tem um algoritmo

que tem a capacidade de pegar a proporção do 28s em relação ao 18s e outros outras informações que ele gera Aquele considera aqui nesse gráfico e transformar isso aqui no valor numérico então não aqui no caso não basta ver só as bandas né os picos a gente está transformando isso aqui no valor numérico ele gera um score ele dá uma pontuação de integridade aqui no caso para rna que é o que geralmente interessa né saber quantificar integridade é de rna dna não não muito pelo menos mas aqui quantificar integridade do rna então de consegue Pegar

essa informação de eletroforese e transformar um valor numérico em geral esse score esses qual é chamado de ar na internet number ou simplesmente ri ó e aqui no caso né no meu exemplo é fictício aqui é uma moça inteira né tá um pico bem definido do 28s um pico bem definido 18s isso aqui não fosse definidos ali ah sei lá um pico mais aberto essa parte aqui do meio estaria mais alta né o gráfico aqui o 18s mais aberto também alguma porcaria aqui no Meio então quando você tem o resultado assim complica os bem definidos

e outras informações que o equipamento considera também ele vai dar uma pontuação aqui no caso uma pontuação alta né de 8.1 é se o rei vai de 1 a 10 se não me engano não sei se é disseram a dessas quem deu uma dessas ele vai de 1 a 10 quanto maior a integridade mais próximo de 10 conto mais degradado mais próximo de um tão amostra aceitável aqui para seguir por exemplo com quantificação de expressão Gênica 8.1 um valor hum será que eu torço aqui é feito por eletroforese também só quer um capilar e a

detecção ea geração de dados ela diferente o que permite gerar um escola valor numérico qual que é a vantagem compatível com todo tipo de ácido nucleico que pode fazer para delinear para ganhar para mim cozinhar ficar um processo automatizado você consegue fazer a quantificação da integridade então diferente do gelzinho convencional Que é qualitativa que você consegue quantificar também alta sensibilidade mais sensível que o gel que eventualmente a gente dela tá lá no exemplo né não sabia se a moça estava presente ou não às vezes é porque o sistema não detectou aqui não ele é mais

sensível então é capaz que você conseguiu detectar é detectar a amostras ainda que ela está em pequena quantidade e ele também faz quantificação o sistema permite que você conte ficar apesar de Não ser ideal que a gente viu quantificação o ideal é seguir lá para os orometria aquele também tende a superestimar um pouco tá mas dá para fazer com bife e em alguns casos interessante quantificar as vantagens é caro de equipamento caro você gasta convergente com o chip é ele é demorado né se bem que era tu for assim já também lá né dos mais

rápidos não capaz esse aqui você até mais rápido que o joão rapaz não ele É mais rápido que o joelson mas é isso é um sistema mais caro né eu vou falar de pureza então agora a gente vai com mais calma porque eu não falei nada de pureza ainda ou quase nada de novo para quem entrou agora quem quiser assistir às aulas sobre quantidade integridade com calma vai lá na playlist no youtube aí no youtube que tem essa a essas duas aulas já bem explicadinhas vamos lá para pureza você deve utilizar a espectrofotometria é a

Técnica indicada para você detectar quantificar pureza das suas amostras como é que ela funciona bom espectrofotometria você vai medir tamanhos diferentes espectros vai medir comprimento de luz tá então feixe de luz que você vai jogar na sua mostra esse feixe de luz ele vai passar por dentro da sua mostra parte dessa luz vai ser absorvida então se você tiver um dna ali dentro parte dessa luz vai ser absorvida por essa mulher que eu te desenhar e o Resto de feixe de luz que passar reto por ela vai ser é um equipamento então que eu tô

falando é o seguinte imagine que você tem só nossa aqui tá muito binho mas esquece o tubo agora por enquanto esquece o tubo ela não vai acontecer dentro de um tubo assim não na maioria das vezes pelo menos você é um tubo aqui com seu dna ali dentro você quer saber o quanto você tem de danielle dentro com policial mostra você vai jogar luz vai passar a Luz atravessa a mostra essa luz é uma luz ultra-violeta então você jogou uma quantidade x ali o equipamento faz isso parte dessa luz vai ser absorvida e parte vai

passar reto esse esse tanto de lúcia se quantidade nos que não foi absorvida vai para um detector que vai transformar essa informação e valor numérico e valor digital para a gente analisar então símbolos parte dessa luz vai ser absorvida ea gente consegue esse equipamento esse computador ele vai que Que ele vai fazer ele vai pegar ele sabe quanto foi jogado de luz aqui no começo e da reação no começo desse processo ele vai ele vai quantificar a diferença de intensidade de luz o quanto de luz foi absorvido nesse processo porque quanto mais luz é absorvido

maior é a quantidade aqui no meu exemplo de dna então conversar falar de dna mas aí dá para rir a mesma coisa então quanto maior quantidade de música e foi absorvida maior é a quantidade de dna Que eu tenho aqui dentro certo ele vai fazer a diferença dessa quantidade lustre que chegou aqui em relação a conta que foi liberado lá na outra ponta é uma quantidade de luz absorvida ela é proporcional à quantidade de dna que eu tenho na minha mostra então nós estamos fazendo aqui nada mais do que uma quantificação por isso que eu

falei lá no comecinho na hora que tá falando decodificação que algumas pessoas analisam algumas muitas pessoas analisam É quantidade de dna renata veste espectrofotometria porque a gente consegue fazer a qualificação através da quantidade de luz que é absorvida nesse processo e onde que tá o pulo do gato aqui alguns dos pulos do gato o dna eo rna os dois assumiu clix eles absorvem luz em qualquer comprimento de onda e sabes ordem luz e essa luz que eu tô almoçando aqui é qualquer luz que ele absorve absorve ali um determinado aspecto uma Faixa de absorbância mas

o dna eo rna eles absorvem luz principalmente e um comprimento de onda específico que é a 260 nanômetros tão aqui tem uma quantidade de luz está sendo gerado vários comprimentos de luz e o dna e rna eles vão sobre o parte dessa dessa luz mas eles absorvem mas mais a luz que está a 260 nanômetros de comprimento guarda essa informação que vocês vão entender porquê que a gente utiliza isso pulo do gato então a quantidade de luz Absorvida 260 nanômetros é onde dá o pico máximo de absorbância do dna e do rna é uma quantidade

de luz absorvida 250 nanômetros é proporcional à quantidade de dna eo rna que eu tenho na minha mostra beleza de seu pulo do gato agora vamos só de por isso que até agora foram decodificação finais por esse então você já sabe e essa quantidade de luz aqui é 250 nanômetros vai ser absorvida por dna mas na sua mostra eventualmente você Pode ter outras coisas como proteína que são as minhas bolinhas verdes talvez você tenha purificados amostra e alguma coisa de proteína foi junto ou você teve uma falha no processo de purificação e você trouxe proteína

junto para para sua morte de dna a oi e a proteína ela também absorve essa luz que eu tô mostrando para vocês também absorve ti só que ela não absorve a 250 nanômetros ela absorve a 280 norte é um comprimento de onda diferente Tamanho diferente o que a proteína de sorte tradicional 260 também também o dna também além disso até todo mundo absorvo tudo só que o pico de absorbância ela absorve mais a 280 nanômetros do que a 260 então quando você tem contaminação por proteína você também vai ter parte dessa luz aqui sendo absorvida

só que ela não é absorvida 260 ela absorvida a 280 o equipamento capta essa diferença aquele cata qual o comprimento de ontem tá Sendo absorvido e se você tiver contaminação por sinópolis é por carboidrato por ureia é por as pulo site caltrops com algum de guanidina que você usa lá no crisol no final que o eurofio e também absorve luz e para nossa sorte absorvidos e um outro comprimento de ontem só que eu tô mostrando um cores né azul verde vermelho mas isso não as coisas não tem nada a ver não tem nada a ver

com fluorescência tá isso aqui eu não tenho nada a ver com as cores desses Comprimentos não só só coloquei em cor diferente para discriminar que essa esse comprimento de onda que o azul é 260 o verde 281 vermelha 230 que é o comprimento de onda absorvido por fenol crise então é isso daqui ó ó e o dna e rna você já sabe absorvem blusa 260 nanômetros as proteínas a 280 e outros contaminantes como o fenol absorvem a230 então aqui negócio é bem simples agora você já sabe que quanto mais luz é absorvida a 260 maior

é a Quantidade de dna ou rna minha mostra agora você sabe que quanto mais luz é absorvida 280 nanômetros maior a quantidade de proteína que eu tenho nessa mostra e também quanto mais luz é absorvida 230 maior quantidade de outros contaminantes na minha morta então se eu pegar e fizer a proporção de luz absorvida a260 em relação a 280 eu sei o quanto tem de dna em relação a proteína eu sei o quanto de proteína eu tenho contaminando a minha amostra de dna e o Pulo do gato é exatamente isso quanto maior a absorbância a

274 metros ou seja dna e rna em relação absorbância 280 ou seja a proteína o pior é a quantidade de dna em relação a proteína em uma dada amostra então se eu fizer absorbância 260 dividido absorvância 280 e eu tenho a proporção de dna ou rna em relação a proteína então se vocês quiserem métricas de pureza é isso daqui ó para você saber se um ácido nucleico está puro em relação a Proteína vocês devem ter uma relação a 260 a-280 e para dinia entre 1.82 para rna entre 1.9 e dois ponto um só para uma

amostra de dna está pura em relação a proteína 1.8 a 2 prime na puro em relação proteína 1.9 e dois ponto um a gente vai falar sobre isso aqui já já lá na frente de novo e para outros contaminantes se você quiser saber se você contaminou a sua mostra com fenol com guanidina que é um salto ao trópico edc a que é um Tampão quelante de magnésio um carboidrato presente várias células ureia que pode ser utilizada no processo de purificação você vai fazer a relação de absorbância 260 nanômetros a230 e o valor tem que estar

entre 1.5 1.8 para você ter uma amostra por eu guardo esses números aí e são seus números de referência vão ver se tem alguma dúvida aqui era um a criança se tiverem dúvidas vai mandando aí para mim que de tempos em Tempos vou dar uma olhada aqui tá e como que a gente faz né como é que é o equipamento como é que a luz ela passa pela mostra como é que funciona esse processo você basicamente tem duas maneiras a primeira maneira é utilizando cubeta que é o método mais tradicional um pouco mais antigo que

é isso daqui ó eu você vai colocar você vai pipetar só mostra aqui diluída ou não diluído depende da sua concentração de equipamentos está utilizando mas amostra Ela fica aqui ó bem nesse vizinho tá não sei que no fundo não tem nada a ver segunda que essa pintura do da cubeta a mostra fica aqui nesse vizinho bem nesse pedacinho aqui e o feixe de luz aí você encaixa essa coberta dentro do equipamento e o feixe de luz ele vai atravessar bem aqui nessa nessa patizinha do ver vai atravessar amostra e vai sair lá do outro

lado equipamento vai captar essa intensidade de luz aqui desse lado Ah tá então é assim ou você faz utilizando uma cubeta ou você utiliza esse outro sistema minha química que você perta sua morte nesse pedestal você vale com a ponta copo de petta coloca 12 micro litros meio microlite perfeita situação e esse pedestal zinho ele tem na parte de cima um pistãozinho outra parte que encosta na sua mostra-lhe esmaga as famosas vai pegar a sua voz tá aqui que eu ver se dá para ver só nós tá aqui e você vai encostar só e pessoal

Mostra aqui no meio e você encosta esse pistão aqui e aí ele vai vai encostar ali ficar encostado só que ele dá uma levantadinha de leve bem pouquinho alguns milímetros e quando ele levanta ele forma essa coluna que vocês estão vendo aqui é a coluna de amostra aí o feixe de luz passa de um lado para o outro e aí funcionar do mesmo jeito que eu mostrei aqui na coberta só que não tem um equipamento né não tenho vidro não tenho material que da coberta ele Vai passar direto tem uma mostro e o equipamentos que

fazem isso por um ou pelo outro meta ou pelos dois tá utilizando cubeta ou sem utilizar coberta utilizando os dois são esses aqui são exemplos e como dar exemplo aqui do tipo de gráfico que vocês vão ver se você tinha utilizar em equipamentos tipo nanoblock eu tô falando raw por quê porque ele é mais conhecido mas utilizado mas não só na europa equipamentos que geram gráfico Né desses dessa absorbância vou mostrar isso aqui para vocês aqui olha só isso aqui é o gráfico que vocês podem ver né um exemplo só pode ser isso que possa

diferente aquipamento para equipamento mas isso não importa agora é isso é o resultado que vocês podem ver depois e o fim de uma de uma análise como essa e pode ser um computador ou pode direto na tela do equipamento vocês vão ver aqui ó no eixo y você nos absorbance seja a quantidade de luz que vai ser o que foi Absorvida esses 10 mm aqui é o tamanho do tamanho do fragmento me mostra então aquela colônia que eu falei para vocês dona drop que dá aquela levantadinha tem a ver com esses 10 milímetros aqui porque

isso porque esse tamanho esse comprimento aqui ele é utilizado na fórmula da classificação mas isso é irrelevante agora só para você saber porque que tem esses 10 mm aqui tá aí você ajustar esse tamanho ele então mente você consegue quantificar Amostras mais concentradas identificar pureza de amostra mais concentrado do que outros tá é isso aí realmente agora você não importa na aula de hoje pode tão aqui que a gente tá vendo eixo y a quantidade de luz que vai ser absorvida ea que os comprimentos de luz que serão detectados aqui o número da mostra é

a intensidade potência absorvida as absorbâncias 260 nanômetros a 280 nanômetros as relações 260/280 e assim por diante e a concentração aqui do Ácido nucleico em baixo onde você vai ver que se espera ver se o almoço de rna por exemplo uma curva com essa mais ou menos você tem uma curva o padrão amostra pura de rna por exemplo então vocês estão vendo o quê que a 260 que é onde o dna eo rna absorvem maior parte do comprimento de luz ea 260 tá vendo que eles absorvem outros comprimentos de luz também a 240 até 290

aqui mas o picotado 160 quem absorve mais luz a 260 dá nome é dna e rna aqui Do outro lado a 280 nós temos as proteínas e alguns compostos fenólicos também absorvem a 280 então e é esse essa parte essa porção aqui do seu gráfico ela tem que ser menor do que essa porção aqui né porque tem que tem menos proteína do que você tem que ter de arranhar e aqui desse outro lado também né quem que absorve 230 fenol alguns compostos orgânicos carboidratos é eu falei para vocês também que tem tá baixo do pico

que é o 260 o dna e real e Aí o resultado bom seria mais ou menos esse daqui ó é uma eu deixei as outras coisas em branca porque isso aqui é não é importante então importante agora ele para te dar essas medições aqui mas o que você vai olhar no final das contas é isso só a relação 260/280 em casa essa moça foi dois então tá ok muito bonito 260/230 tá 1.7 tá bom também cima de um ponto 5 né tem um pouco 5.8 tá muito bom e aqui a concentração do seu ácido Nucleico

aos ou não são ácido nucleico que você não mostra ele da concentração também dá para utilizar essa informação aqui para você fazer as suas reações nada para utilizar mas saiba que é provável que você esteja superestimando um pouco a quantidade do seu alvo é que por isso que a indicação vai fazer por fluorometry ia pensar de você pode ficar aqui também é indicado que você faça professor a minha tia porque você não vai superestimar então se você tiver Trabalhando com especial em tempo real para quantificação expressão gênica por exemplo interessante fazer flor o meu dia

ela tiver fazer um e de qualidade lá para uma pcr com que ficar um alvo por isso que os mente a gente segue com esse valor mesmo que não vai ter muita diferença 17 a beleza vamos para outro exemplo aqui ó dá uma olhada nesse gráfico vamos antes da gente ir mostrar em que tá Acontecendo aqui com esse gráfico em duas coisas que a gente pode ver de diferente aqui em relação ao outro né esse pico olha o pico de fluorescência o melhor o pico de luz absorvida a maior parte de luz absorvida aqui foi

entre 220/230 nanômetros ou seja temos contaminante essa mostra e possivelmente é fenol é um um sal caotropico algum produto que você utilizou lá no processo de purificação e ele veio junto a que hora que você louis o seu dna ou rna eu Nem veio junto por isso ficou mal criticado por alguma razão se você tiver trabalhando com o crisol com final clorofórmio quando você for mas fases lá depois eu sempre fugas são que você tem que puxar a fase aquosa você vai pipetar para fora que ela faz a coisa provavelmente aqui você puxou fenol junto

houve e ficou mal sua mostra um pouco tempo ou deixou lá na bancada por muito tempo depois da centrifugação e aí misturou um Pouco do cenol com a sua a sua mostra e outra coisa também né nós temos bom daqui a pouco falo disso vamos ver aqui esse primeiro então possivelmente sem contaminação por algum reagente que você utilizou lá no processo de purificação fino ouçam carro próprio ó e aqui ó mas a gente pode ver que a relação 260/280 um tá boa você não tem contaminação por proteína tá ok a concentração também tá boa ação

mostra tá bem concentrada só que a relação 260/230 tá baixo abaixo de 1.5 indicando contaminação aqui por esses contaminantes por esses reagentes por essas substâncias que absorvem luz entre 220/230 nanômetros ou seja provavelmente fenol e são caltrops guanidina ureia o outro exemplo vamos ver aqui que que tá acontecendo com essa moto só de novo têm uma absorção muito alta aqui a 230 em 220 e 230 então de novo contaminação aqui pro inferno ó por sal também e aqui veja aqui o pico de absorbância agora Ela não está a 260 mais olha aí está o 260

aqui ó aqui do lado ou seja essa mostra ali está contaminado com fenol com salto alto só pra está contaminado com outras coisas também absorbância a 280 tá muito alta em relação 260 provavelmente está contaminado com proteína aqui também bom então olha só o 260/280 tá o valor baixo abaixo de 1.8 tão está contaminado com proteína 260/230 muito baixo tá contaminado com Fenol aqui por exemplo a concentração tá ok sem bastante amostra de dna ou rna ali dentro mas o resto tá muito ruim em ambos os casos esse caso o caso anterior que você pode

fazer vai seguir se você precisa de pureza se você demanda só só aplicação de mandar pureza não segue você vai fazer o seguinte vai fazer mais uma rodada de purificação se você trabalhou com trizol tá trabalho o final clorofórmio e você não quiser é extrair e purificar sua mostra eu te recomendo Que você compre um kit de coloninha por exemplo que eu falei lá na aula de purificação compra um kit de colônia e repure fica essa mostra utilizando condomínio para você não ter que repetir todo o processo atração agora se você tem amostra para repetir

preferir repetir para não ter que comprar outro kit beleza segue o jogo é pet é mas saiba que essa mostra não tá perdida essa aqui que eu tô mostrando nem anterior você pode repor explicar Para eliminar esses contaminantes e esses contaminantes aqui tá então não nem tudo está perdido outra sempre e esse gráfico geralmente ele tá bem tu tá bem com ranhuras aqui sabe feio de ver que acontece tá um valor muito baixo né de absorbância aqui então é provável que você tenha pouca amostra de dna de rna quando você tem pouca amostra de dna

rna fica difícil de mensurar as relações 260/280 260/230 tão aqui os valores estão baixos mas eles não são confiáveis Eventualmente eles não são confiáveis porque você tem pouco dna ou pouco aí na sua morsa nesse caso que você pode fazer de novo e faz processo extração e purificação ou pega essa mostra aqui e seca você pode sercar existem centrífugas que permite que você segue a sua mostra sem contaminar e ela vai ficar mais concentrada se ela ficar mais concentrada você pode tentar de novo recodificar aqui e analisá-la com mais cuidado tá dá para secar mostra

A amostra não é um bicho de sete cabeças não tá então essa outra possibilidade também há 8 cuidados que você tem que ter a de forma coisa que antes se vocês forem fazer essa aqui na vida real desconsidere esses valores aqui do lado tá porque usa equipamentos eles vão eles vão mudar a escala desse gráfico de acordo com a sua mostra tá então não utilizem esses valores aqui como referência não tá aqui só meu exemplo Didático oito cuidados que você precisa ter para analisar pureza então sempre faço branco ficou branco onde você vai seja utilizar

qualquer um desses equipamentos você vai fazer uma primeira leitura sem amostras vai colocar só água ou só tampão de eluição ali quando você faz isso você fala por equipamento a equipamento todas as amostras que eu vou analisar partir de agora elas têm essa solução aqui dentro delas então desconsidera absorbância do que você tá Vendo aqui então você vai colocar água ou tampão de luz são e a dica de ouro aqui é você deve utilizar em alto fazer o branco se deve utilizar o mesmo tampão que você diluiu suas amostras ou se você louis os seus

amores com tres conta e você utiliza a mesma solução para fazer o branco porque você tá falando que o equipamento equipamentos na loja que vem a partir desse branco aqui elas são iguais esse branco só que ele de Entendendo ela também tá é isso está falando se você não viu com água passa a eluição fácil branca aqui com água mesmo tampão o terceiro faça novos brancos e tempos em tempos se você tiver trabalhando com muitas amostras aí de 10 em 10 e 12 em 12 para faz as doze amostras para faz um novo branco e

segue com as próximas amostras tá de tempos em tempos é bom refazer o branco nem pe bem a coberta se você tiver trabalhando com cubeta ou Pedestal se você tiver trabalhando com pedestal porque provavelmente você vai utilizar a mesma cubeta e com certeza o mesmo pedestal para todos amostras tão interessante que você lembre muito bem estiver trabalhando com coberta joga água na cubeta faz o o pen down lava bem retira água com papel higiênico ali bate bem no papel higiênico não sei se dá para ver bate a coberta no papel higiênico para tirar toda água

que está ali dentro dá uma secada e cega para Postar uma mostra se tiver trabalhando com pedestal tipo nanodrop passa um papel higiênico ali ou um papel bem suave retira toda a mostra do pedestal e aí põe a segunda tá para a internação cruzada por você não pode ficar errado é a que mais se misture bem amostra antes de você fazer a medição só tinha uma lhe contado só mostra mas antes de retirar-se alíquota para fazer a medição tem que misturar bem faz o ano kendall Ali de 30 50 vezes antes de você passar para

cubeta antes dele ir ou antes passar o pedestal porque imagine você pegar uma porção da sua mostra que não representa a quantidade da sua mostra não representa pureza sua nossa está gerando viesse sexto passo vocês cuidado talvez você tem que diluir ou secar mó se você tiver amostra muito concentrada talvez o equipamento não consigo detectar tem equipamento que se ajusta os equipamentos mais modernos ele se Ajustam para os nossos muito concentrados mas tiver concentrada demais é bom que você diluiu um pouco e se tiver muito diluída você rendeu um pouco seu processo de extração você

pode sercar ou rei extrair o cuidado para fazer bolha não deixa a bolha seja no pedestal ou lá na cubeta porque se tiver bolha vai ter de fração de hindus você vai inserir viés ali na quantificação e oito anote os resultados e uma ata os equipamentos mais modernos Estão ali associada a um sorte ele vai gerando as informações para vocês ele vai armazenando informação que o automático mas não confie isso vai montando te custa nada não tá ali no papelzinho na hora é o tempo que você passar uma amostra entre o almoço e outra nosso

três números que você vai ter que anotar e aí você evita perder dados se tiver algum problema com o equipamento quais são as vantagens de trabalhar com o espectrofotometria a um Processo rápido e fácil de fazer e a uma técnica muito utilizado por vários laboratórios têm biofoton espectrofotômetros nanodrop assim por diante você não precisa de reagente basta de mulher amostra se precisar de luiza mostro também pode ser utilizado para fazer quantificação de um asterisco aqui porque você vai com muito para frente superestimar o seu alvo se você estiver trabalhando com dna prova mas tem um

pouco de renda lá na sua morte e Você não consegue discriminar então você vai superestimar essa superestimação estimativo ela é importante para você se sim vai para o fluorimetro não é segue o jogo com essa informação mesmo a desvantagem equipamento ele é caro ele é mais caro que um florindo de modo geral e não se clima dna de arranhar e porque essa árvore de natal aqui porque quem sabe natal lá na imagem gerais porque analogia é o seguinte fazer uma análise por espectrofotometria é a mesma coisa Que você tem uma árvore de natal toda acesa

com um monte de luzinha acesa e apaga algumas dessas luzes e aí o que que você faz você compara o quanto de luz acesa você tinha antes em relação continuar de luz acesa que você tem depois que você apagou essa relação ela é proporcional cuidar do seu ao por isso que tem essa árvore de natal e o resumo de tudo que eu falei ao longo dessa semana aqui decodificação e de purificação e extração de dna e rna a Estação é a lise quando você expõe suas nucleico para ser purificado seja ele daí não é real

você vai com pm em branco solar o aparelho celular escuras o ácido nucleico e a purificação é retirar tudo que não é ácido nucleico da sua morte deixar só dna ou só ml dente mais de tampão de luz são tão parte do seu sucesso a boa parte o sucesso está relacionado à planejamento limpeza e organização do laboratório tá tudo isso lá na primeira aula segue que eu falo Para você lá que você não vai errar basicamente três tipos de extração mecânica cinemática e química mecânica com força mecânica e se machuca você vai ser fazer uma

digestão coenzima e a química vai utilizar detergente há três tipos de purificação fenol-clorofórmio que pode ser caseiro você compra o kit coluna que é tipo um filtro onde o seu dna e rna fica retida nesse filtro e às vezes magnéticas que ficam sudene a sua renato fica preso na Bid que é puxada por um ímã e você tira o resto que não está preso na beijo no igor e por último você precisa fazer os três passos de controle de qualidade a quantidade se você precisar de você demandar uma quantidade específica vai para o fluorimetro pureza

que é o que a gente falou hoje tem que ser espectofotometro não tem saída integridade você vai fazer por electroforesis seja ela no geralzão lá que você está acostumado já viu ou ela Em capilar com um equipamento tipo de análise é olá meus amigos eu quero saber se vocês tem dúvida mas antes muito obrigado por vocês terem ficado aqui em casa na laje show de bola é não se esqueça de se inscrever no canal se você não se inscreveram me seguir lá que lições no instagram que eu posso controlar diário e se por acaso alguém

aqui ainda não se inscreveu universo davi o mal pontocom vai lá deixa seu e-mail que de vez em Quando eu mando umas coisas legais e e aí e aí e aí