a pcr multiplex o que seria o pcr multiplex ele seria então a realização do pcr utilizando mais de um pare de primer em uma única reação como tá esquematizado aqui nesse desenho é um gente tem três conjuntos de primes sendo colocados no mesmo tubo de pcr e gerando então fragmentos de tamanhos diferentes sim mas qual seria o objetivo de ser realizar um pcr multiplex quando é que a gente vai ter nessa ideia essas necessidade de utilizar o pcr multiplex sempre que a gente precisava olhar mais de uma sequência de dna na mesma mostra a gente
quem investigar mais de uma sequência mais de um microrganismo ou mais de uma sequência de um gene utilizando apenas uma pcr para facilitar a realização da análise para encurtar o tempo de análise também e quais seriam as possíveis aplicações da multiplex eu vou trazer para vocês aqui aplicações bem gerais não é a primeira delas seria para o diagnóstico de doenças infecciosas onde eu vejo a maior utilidade da pcr multiplex não sei que é investigar uma bactéria que tem diferente ceias e essas diferentes cepas podem determinar um diferente prognóstico um tratamento diferente para o paciente né
se for possível avaliar essas diferentes cepas em uma única análise seria ótimo porque assim é o final de duas três horas é possível obter o resultado né de um vários testes ao mesmo tempo e outro outro exemplo de utilização seria para doenças que são ocasionados por deleções ou inserções de várias regiões de um gene na então os podem ser ocasionados tanto pela de a inserção no mesmo gene mais em diferentes regiões então multiplex ele possibilitaria a analisar essas diferentes regiões ao mesmo tempo tá um exemplo seria a distrofia muscular duchenne que é ocasionada pela deleção
de possivelmente seis exons do gene da distrofina e aí e aqui nesse desenho eu começo a mostrar para vocês um pouco mais daquilo que eu falei sobre os fragmentos de tamanhos diferentes né como eu sempre fiquei aqui a gente pode enxergar então que esse conjunto de parar de primer um ele faz o anelamento bem nas extremidades desses dessa fita dupla que eu demonstrei para vocês né então eles geram fragmento de dna maior fragmento de dna do multiplex a gente tem o conjunto de primers dois que vão fazer uma anelamento então numa região bem interna desse
segmento que eu mostrei do dna então gerando um fragmento de dna pequeno e o conjunto de primers três então que gerariam um fragmento de tamanho intermediário aqui nesse lado verde mostra um pouquinho melhor então de uma forma mais realista o que que seriam em o momento de tamanhos diferentes na verdade o comprimento do fragmento onde eu tenho então o fragmento gerado pelo conjunto de primers um o maior fragmento pelo conjunto de primers dois o menor fragmento e pelo conjunto de primers três um fragmento então de tamanho intermediário ii é bom como nós já vimos né
a técnica seguinte se usar depois do pcr multiplex seria eletroforese e nessa eletroforese a gente poderia então visualizar quais foram os fragmentos gerados ou seja quais conjuntos de primeiros encontraram as sequências e fizeram anelamento então são um um gel na fotografia de um gel esquemática a gente tem aqui nesse poço um marcador de peso molecular né que é um regente que tem fragmentos de diferentes tamanhos já determinados na gente sempre utiliza em uma pessoa em uma eletroforese para conseguir estimar o tamanho dos fragmentos da mostra que a gente está analisando e aqui a gente teria
então o fragmento gerado pelo conjunto de primers um mas seria o maior fragmento ou seja fica mais perto do posto de aplicação e mostra aqui a gente teria o fragmento gerado pelo conjunto de primers três que seria se fragmenta que intermediário e aqui a gente teria os fragmentos gerados pelo conjunto dos primers dois que seria o menor fragmento gerado é bom colocando um pouquinho mais de realidade né dando o exemplo um pouquinho mais palpável para vocês conseguirem enxergar isso para análise de variantes genéticas a gente então faz um exemplo hipotético da investigação da deleção de
três exons no gene da distrofina e a gente tem então que separar de primers um ele avalia a presença do ex 16 o par de primers dois avalia presença do exon 3 e o par de primers três avalia a presença do exon 47 ó e aqui a gente tem um gel esquemático não é para tereza mostra a gente tem a mostrar amostra b amostras ia e o marcador de peso molecular então a gente consegue visualizar o gel a gente vê que na mostra a gente tem duas bandas na amostra b gente tem duas bandas mas
que não são idênticas ao mostra ah e não mostra se a gente tem apenas uma banda o que é que a gente tem então as informações né que eu já tinha falado para vocês mas para ficar mais fácil de avaliar então o resultado dessa análise a gente tem que o primer um ele investiga a presença do ex 16 na gerando esse fragmento maior o primer três a presença do exon 3 e seria o fragmento pequenininho e o primer três a presença do edson 47 e seria o fragmento intermediar tão que a gente pode concluir da
amostra ar não mostra a a gente tem a presença do exon seis e temos também a presença do exon 47 o que que significa a gente só não teve amplificação do fragmento menor então nessa amostra a o paciente a deleção do exon eu já me mostra b a gente tem a presença do fragmento maior que seria do exon seis e a gente tem a presença do fragmento menor que seria do exon 3 então no paciente bem a gente vai ter a deleção do exon 47 que seria esse fragmento e intermediário e já o paciente se
ele tem apenas uma banda ou seja ele tem apenas a presença do edson 47 nessa análise ele vai ter deletados o edson seis e o jackson 3 as considerações que são importantes sobre a pcr multiplex pcr multiplex ela pode facilitar bastante análise por permitir a análise de mais de uma sequência ao mesmo tempo mas ela tem alguns requisitos importantes né primeiro deles que os primers diferentes pares de primes eles devem ter temperatura de anelamento semelhantes na então quando você vai fazer uma pcr existir 3 temperaturas na que os ciclos vão alternando que seria a temperatura
de desnaturação que é sempre constante entre 94/96 graus a gente vai ter uma temperatura de anelamento dos primers e essa temperatura ela é variável de acordo com a sequência dos primes tão neste caso todos os pares de primers eles vão ter que ter temperaturas de né lamento iguais ou muito próximas e depois teria a e são que também é constante né de 72 graus que a temperatura de atividade da taq polimerase o outro requisito é que os fragmentos gerados eles devem ter tamanhos diferentes foi o que a gente conseguiu visualizar num exemplo que eu mostrei
para vocês que a gente só conseguia discriminar quais alelos estavam presentes quais access estavam presentes ou ausentes porque a gente sabia o tamanho dos fragmentos que cada conjunto de primer gerava a e os primers não podem ter sequências complementares né entre eles porque senão ao invés de fazer o anelamento na sequência de dna da mostra esses primers podem fazer o anelamento entre eles mesmos e aí não vamos gerar amplificação da amostra o e considerações finais então dessa aula né o que foi apresentado nessa aula para pcr multiplex ela se aplica o pcr convencional a gente
não falou do que é pcr é possível também fazer multiplex no qpcr mas é um grau de complexidade muito maior para fazer otimização da técnica oi aqui é pcr multiplex ela é muito utilizada no diagnóstico das doenças infecciosas e para finalizar quais os passos são necessários para análise de variantes genéticas por pcr multiplex tão primeiro passo extração do dna das amostras o segundo passo a pcr utilizando vários conjuntos de primers vários pares de primer e o último passo a eletroforese onde a partir da visualização do tamanho dos fragmentos que foram gerados na pcr é possível
discriminar quais variantes estavam presentes naquela mostra
