o Olá seja muito bem-vindo ao universo da biologia molecular eu sou Eduardo castanho e hoje nós estamos mais uma vez aqui no laboratório de verdade para fazer uma aula prática de um tema que vocês muito impediram que a extração e purificação de DNA e RNA Mais especificamente hoje nós vamos fazer esse da subtração de Dr a vírus com esse cenário tudo que nós estamos vivendo estou dos temas que mais repetir aqui de aula prática Então vamos fazer uma aula prática sobre isso antes de começar eu quero dar dois recado para vocês o primeiro Na verdade
é um agradecimento outro Mega eu entrei em contato com eles falando que tinha essa ideia que tinha esse pedido aqui de vídeo e eles prontamente se disponibilizaram a doar o e kit para gente fazer a gravação esse vídeo aqui então muito obrigado por Mega o disponibilizar o kit utilizado aqui nesta gravação e o segundo recado é sobre a dinâmica da sala eu quero falar para vocês como vai funcionar primeiro nós vamos lá para um estúdio para fazer uma aula teórica vou explicar para vocês falar que função kit esse tipo de está e nós vamos utilizar
aqui esse tipo de método estação para você se entender o que nós estamos fazendo na banca depois a gente volta aqui para bancada fazendo um protocolo da vida real na massa passo a passo o meu para você entender compra o CD na utilização desse tipo de Kitty eu vou rodar vinheta agora enquanto roda a vinheta aquele como de outubro que você vai deixar para mim deixar lá e comentário se inscreve no canal ação assim nem tudo que você puder para fazer o que este conteúdo alcance mais pessoas para gente consiga difundir mais o conhecimento sobre
biologia molecular a gente se vê Já é [Música] [Aplausos] E aí [Música] E [Aplausos] aí [Aplausos] beleza vamos dar uma olhada aqui na aula teórica só pra gente ter o contexto para você conseguir entender exatamente o que está sendo feito que está sendo realizado em cada passo no protocolo porque afinal de contas misturavam em qualquer um mistura que entende o que tá fazendo de fato lá na bancada quem sabe onde está acontecendo E por que ele está completando misturando o bando em cada passo que se faz um protocolo de biologia molecular tem um grande diferencial
sabe o que está fazendo eventualmente pode corrigir um problema melhorar o último usar uma situação Então essa aula de hora que ela serve para isso deixa eu fazer só um comentário antes que é o seguinte tudo que eu vou falar aqui eu posso que eu vou lá na sala eu já falei antes aqui no YouTube então eu não vou entrar em detalhes eu vou deixar aqui em cima o link de uma aula sobre extração e purificação de DNA e RNA se você quiser saber em detalhes o que eu estou explicando aqui assistir essa aula depois
de ter nascer mas e aqui porque é bem simples que eu vou falar é bem simples o procedimento Mas se você quiser saber detalhes aí você assistir lá depois beleza então vamos lá extração purificação de DNA e RNA geralmente na grande se seu marido das vezes são sem três passos de você vai seguir independentemente do protocolo são esses aqui ó primeiro passo realiza a extração Quando vocês forem o ácido crê tira ele dentro da sala expõe ao ambiente ao meio para que ele possa ser purificado depois que a justamente o passo seguinte é o isolamento
a purificação te isolar o DNA ou RNA de todo o resto proteína de me celulares outros componentes celulares e por última eleição que a recuperação desse assunto ler mantendo em solução aqui no nosso caso eles são possa ressuspensão evolução na aula de hoje vai ser a eleição que é você manter o assunto em solução pronto para o uso aí o controle de qualidade certo conversando aqui com a Lívia como eu falei alise é simplesmente o rompimento das células da membrana celular das parede celular e liberar o nucleico Afinal de gols para você purificar e depois
para você analisar fazer o que quer que seja na grande maioria das vezes ele tem que estar extraído fora da célula certo então para você fazer Alice o rompimento da célula há basicamente quatro mecanismos primeiro deles rompimento ou alisa e físico você faz uma força física e rompe a membrana celular expondo as no lê a químico geralmente conçalves com detergente que vai romper a membrana celular também expondo assunto aí as imagens que atravesse da atividade enzimática que este rompimento celular vai acontecer liberação do ácido nucleico mas na grande maioria das vezes acontece a combinação dos
métodos na aula de hoje no protocolo que eu vou mostrar para vocês hoje nós vamos comprar os três metros mas que vai ter a combinação dos três aqui mais intensamente aqui A Lise química enzimática física também vai ter um passo ali de volta mas basicamente vai fazer uma combinação da química e enzimática para extrair o DNA ou RNA que aqui vocês of the protocol e são dos dois aí me seguida vem o isolamento é o momento que você pega esse ácido nucleico e você para de todo o resto vai isolar o DNA o RNA e
proteínas e outros componentes celulares essa está essa etapa aqui ela pode ser subdividida em dois passos vai fazer esses dois passos que é momento de isolar O isolamento incide o ácido nucleico e depois ela vai acha para deixar ele purinho no caso isolamento a gente tem diferentes opções de estratégias aí de métodos de purificação penal clorofórmio dia é um método caseiro muito bem utilizado você faz a combinação no final que ouro forma consegue isolar o assunto E purificar o método por colunas que é um método que nós vamos utilizar hoje que é um método excelente
também porque ele é muito mais simples do que o final clorofórmico e tende a resultar em amostras muito mais puras quando comparado ao final clorofórmio E aí a outra opção por bits magnéticas que o método muito bom e por isso em termos de Pureza também que praticidade também só que ela precisa dar aqui magnética que é um E quanto é o item caro laboratório certo então Colonial que a gente vai falar hoje como que acontece o passo Purificação então aqui nesse momento a extração já aconteceu Alice já aconteceu o ácido nucleico já está exposto a
célula já estavam vindo a gente vai purificar quando você trabalha com colunas que é o que a gente vai fazer hoje amostra analisada ela vai ser colocado ela vai ser dispensada app tadaa aqui nessa nessa coluna que é como se fosse um filtro vai que tem aqui uma matriz pode ser uma três di circa pode ser outros componentes em varia de kit para que Mas ele tem uma matriz aqui captura o ácido nucleico alto no caso hoje vai ser tanto ganhar com a ganhar com esse kit faz a extração dos dois você vai pegar a
mostra realizada colocar aqui dentro e tá aqui dentro vai colocar essa Colônia em um tubo de coletto essa Coloninha ali no tubo de coleta pode ser centrifugado geralmente a por cento da ação pode ser por Vaca também aquilo kit de hoje vai ser concentre o e amostra analisada vai passar por esse filtro por essa coluna e o que nos interessa vai ficar associado aquela Matriz do DNA ou RNA ou dois né amostra ela vai ficar associado a uma atriz e todo o resto passa reto aqui proteína dentre seus vários outros componentes a o tampão de
lise utilizado é tudo todo o resto ele vai atravessar essa essa membrana aqui e fica aqui na parte de baixo do tubo tubo de coleta que vai ser descartado feito isso basicamente E você já fez o primeiro passo de de purificação que o isolamento do ácido nucleico e sim já está isolado né o assunto é que tá preso aqui isolado todo o resto já foi retirado Foi removido pelo menos o grosso Foi removido Agora vamos fazer um ajuste fino nesse negócio que é lavar esse é real e né que tá preço aqui com uma solução
de lavagem ou com etanol Depende do que você tá utilizando Aquele caso vai ser uma solução de lavagem que é adicionada a aqui em cima dentro da colônia exatamente como foi feito não passa o interior né dos em ações simples e também por centrifugação essa solução de lavagem vai passar reto ela passando reto Ela vai lavar o RNA que tá preço aqui o DNA que tá preso aqui eliminando possíveis proteínas associadas ao R aldenia outros Demi celulares sal detergente ou qualquer coisa que esteja ali associado ainda a mostra de fato Então agora eu acho que
um clipe já foi extraído ele já foi purificado e agora nós vamos recuperar fazer o processo de eles são que é retirar o dessa Matriz solda sólida e solubilizaçao novamente então eles são recuperar o DNA purificado fazendo a sua ressuspensão e água ou tampão geralmente até aqui no caso hoje nós vamos utilizar água estão a eleição vai ser também um passo muito semelhante com que já foi feito anteriormente vamos adicionar aqui a água ou tão contra a água que no caso só que a água nesse momento ao atravessar aqui por centrifugação ele vai recuperar o
RNA que está só e o ácido nucleico agora livro de sal livre de álcool e etanol isopropanol ele é solúvel em água não é possível separar agora da Matriz colocando ele novamente solução então a água ou tampão vai passar aqui pela Coluninha só que dessa vez o ácido nucleico vai sair juntos vai ficar aqui na no tubo aqui no caso das outras vezes que a gente ficou tudo era descarte dessa vez não o RNA e o DNA aqui no tubo pronto para o próximo passo Olha só o protocolo que a gente vai utilizar hoje como
eu disse para vocês né um kit da promessa que ele gentilmente cederam para gravação dessa aula tão nome do kit sirléia Pepe vai alto no Clique a ser purifiquei kit ele é interessante esse kit aquele interessante isso por diversas razões primeiro deles é que esse gente ele nos permite extrair tanto DNA como RNA de vírus e o segundo motivo é justamente esse nós estamos falando aqui de extração de DNA RNA viral e dentro do momento que nós estamos vivendo faz todo sentido e extração desse e vai continuar em alta por um bom tempo então essa
segunda característica a TV será características do protocolo que a gente vai que eu vou mostrar aqui para vocês além de ser Apesar né descer para amigos ele é muito semelhante o que se faz quando você trabalha com esse tipo de kit com esse tipo de método de extração apesar de servir você vai ver que o passo a passo para outros para outras fontes de amostra é muito semelhante pai obviamente a maneira como se vai alisar amostra talvez ali o Senhor dos Passos ele vai variar de amostra para nossa situação prestação mas todo o resto vai
ser muito muito semelhante com que eu vou mostrar aqui e por último vocês vão ver que o protocolo ele é muito fácil nós vamos falando de mais tração manual aqui e o processo ele é muito fácil e muito simples de fazer dá para começar uma estação e depois da quantidade de amostra de 30 minutinhos terminou o seu processo de extração e Purificação já que tomar uma olhada aqui no protocolo é que a gente vai fazer lá durante a gente vai na bancada tô aqui ó a primeira página do protocolo né não vou entrar em detalhes
aqui para gente não precisa né Deve tá falando aqui extrair DNA e RNA as fontes de amostra tipo de amostra que no caso nós vamos começar a fazer uma estação de saliva o kit também é compatível com os tipos de nós em nosso caso que vai fazer extração a partir de saliva 200 ml de saliva já o suficiente para começar e quais são os materiais necessários obviamente do kit está aqui vai precisar de uma centrífuga para fazer esse processo todo de passagem da mostra Ali pela pela coluna precisa de tubos de 1ml e-mail e precisa
de banho seco ou banho-maria tanto faz assim é a 56° Celsius e isopropanol absoluto Então não precisa de muita coisa tudo só que Possivelmente Tem qualquer laboratório de biologia molecular Então pronto Cola está assim veja que os espaços são bastante simples e tem tudo a ver com aquilo que eu expliquei ali atrás eu passo de são de 20 mil litros de proteina secar então aqui nós vamos começar o processo de digestão e da membrana celular aí também obviamente de outras proteínas presentes na célula nesse tubo de um e-mail que vai ser misturado com 200.000 litros
de saliva vai ser misturada depois vai ser adicionados 200 microlinks do tampão Diniz e tem uma concentração adequada de salto e detergente outros componentes ali e também vai fazer favorecer o processo de extração essa mistura aqui vai ser incubada a 56° Celsius por 10 minutos e o processo de extração aqui tá pronto então esses Passos esses Passos bem simples aqui no começo é a parte de extração do protocolo pois você monta ele coloca a colônia dentro do tubo de coleta e é entra e aí entra no Passo nos passos de purificação nós vamos fazer retirar
o tubo que tá lá em cubando no banho-maria adicionar 250 micro litros de isopropanol isopropanol absoluto o ácido nucleico Independência e ele não é solúvel e insolúvel em isopropanol absoluto ou etanol Thomé que no caso protocolo que vai utilizar isopropanol Absolut Vai facilitar vai favorecer H tura do ácido nucleico pela pela Coloninha certo ação do isopropanol serve para isso transferir esse tubo em controle da coluna a amostra realizada o tubo de transferir esse combo e lá para centrífuga centrífuga Por Um Minuto para mostra passar pela coluna e no final das contas no final da sua
centrifugada o DNA ou RNA vai estar preso a uma atenção no que tiver aí na no fundo esse tubo é skate vai então remover esse tubo de coleta jogar fora o sobrenadante jogar fora o que passou né pela coloni e o que tá aí na coluna é o que nos interessa vai pegar a colônia colocar um tubo novo agora para começar os passos de lavagem continuamos aqui portanto ainda em Purificação nesses dois passos que adicionar 500 microlitros da solução de lar a imagem diretamente na mostra que está presa na coluna encaixada ali no domingo vocês
vão ver tudo isso na aula para ir centrifugar para fazer a solução de lavagem passar vai repetir esse passo três vezes num total de 3 vezes e feito isso tá lavado o r a ou DNA está purificado para finalmente entrar aí no Passo diluição vai colocar a coluna com DNA ou RNA já purificado bonitinho num tubo novo de 1,5 adicionar 60 micro litros de água que vem no Kit aqui no caso saiba vendo um kit e centrifugar por um minuto nesse processo centrifugação a eleição acontece o seu DNA ou RNA vai ficar no fundo do
tubo EA colônia agora é o descarte certo guarda isso daqui o protocolo é simples assim fácil de utilizar esse rns-d me afastar purificado Possivelmente em boa quantidade Possivelmente nível de Pureza extremamente aceitável para os próximos passos aí e você poderia aqui no Caçu GO o hazena o seguinte os pontos de controle de qualidade ou processar fazer percebe pensar em tempo real ou a tensão reversa e foi o caso de manga lá certo então isso aqui foi organização do raciocínio vamos voltar lá para bancada e vê como esse aqui que eu acabei de mostrar para vocês
é feito na vida real Beleza então voltamos aqui para bancada agora vamos fazer o unboxing aqui da se material do kit que a gente vai utilizar Eu Só Quero mostrar aqui para vocês é o que vem dentro da caixa né você já viu lá não tenho nem o que faz cada um luzes eu quero mostrar algumas coisas para vocês vó é que tem vários saquinhos com as colunas onde o processo de purificação vai acontecer né eu tirei aqui as colônias Vou colocar aqui do lado Ó tem mais um saquinho de Coluninha e isso temos os
saquinhos com os tubos estudos provavelmente que de 2 ML né os tubos de coleta vou colocando eles aqui do ladinho só para gente chegar lá no seu a gente fica lá embaixo a caixa é tudo temperatura ambiente então precisa ficar no menos 20 e como a gente saquinho Aqui ó Aqui nós temos a garrafa una aqui isso aqui é a garrafa de lavagem da colônia é um processo de purificação vai acontecer ali na Coloninha e as lavagens serão com essa solução Depois tem uma outra caixinha aqui ó e vem com todos os reagentes fechadinhos bonitinhos
que temos deixa eu dar uma olhada aqui que nós temos aqui o by the buffer que na aula de hoje a gente não vai utilizar que hoje na estação um fazer uma a extração de saliva e não precisa o protocolo saliva não precisa duas garrafinhas com água aqui nós temos a o tampão de visto o tampão deles aqui e a proteinase k que vai utilizar no processo dele também Beleza então vamos começar a única coisa que tem que fazer agora antes a gente conversar mesmo é ajustar o banho seco vocês viram gente vai precisar fazer
vai fazer uma incubação no banho seco a 55 graus Celsius vão ligar ou em seco vou deixar Sempre Fica preparada também e deixar preparado isopropanol oi tá tudo agora nesse esses primeiros passos do protocolo vamos lá beleza deixei aqui tudo organizadinho aqui todos os tubos organizados que a gente vai precisar amostra de saliva inclusive tá aqui amostra de saliva na vida real quando você for utilizar tem que deixar essa essa mostra que estabilizada não posso deixar em qualquer tubo não que isso não vai degradar o material aqui dentro mas aqui no caso hoje para uma
demonstração tá aqui dentro desse tudo vamos fazer essas são diretamente dele a gente vai fazer com suas começar e prestando 20 micro litros de proteinase k e tubos de um e-mail eu peguei dois tubos aqui um repetir essa mostra duas vezes então tenho dois tubos aqui um dois e a gente repete essa instalação dessa mesma morte duas vezes só para a gente fazer mais do que uma não tem que fazer uma só então vamos começar colocando vou abrir aqui os dois tubos vou começar a colocando 20 micro litros de proteínas ficar já tá aqui e
vamos abrir proteinase k Arantes a 20 micro litros o YouTube da mosta um de 20 mil inscritos e no tubo que seria mostra dois beleza feito isso colocamos proteinase k vamos colocar agora 200 micro litros fechar aqui é proteinácea e deixar aqui no cantinho aqui não vai utilizar mais vamos colocar agora 200 mil incritos e amostra 200 mil incritos e amostra a amostra de saliva tá aqui o cuidado para não contaminar a 200 microlitros da amostra de saliva não Turbo II eu vou trocar a 200 micro litros de amostra de saliva no tubo 2 beleza
feito isso agora vamos 200 micro litros já tá ajustado aqui de da solução início a solução deles que a solução junto com a proteinase k que vai fazer de fato a extração o chacoalhe aqui mas não é legal chacoalha não é já qual é o mínimo possível porque solução deles geralmente tem bastante quantidade de detergente eu vou ter que tomar cuidado para não fazer espuma então 200 microns da solução deles minuto ruim E aí e mais 200 microlitros da solução deles o noturno 2 é feito isso O que nós vamos fazer ES E aí e
agora é misturar é que a mistura nós vamos fazer a mistura por Vortex lavor detectar a rápido fechar os dois tubos bom e depois incubar eu não vou ter que sair daqui deixa alguns Alguns segundinhos aqui vai ter que estando rapidamente os 10 segundos mais ou menos é falta protocolo isso e daqui está pronto para incubar a 56° Celsius furo 10 minutos vamos lá tô aqui terminamos na nossa incubação vamos trazer para cá aqui é o seguinte Olha só para gente ficar claro o que nós fizemos até agora nesse momento a gente misturou a nossa
amostra de saliva ou a solução deles e com proteinas carro Nossa fazendo aqui é extração com pena lembrando o celular para extrair RNA para se sair bem reais foi facilitado por temperatura a 56° Celsius que a gente fez até agora agora a partir desse momento nós vamos começar um processo de purificação extraídos RNA e o DNA já está extraindo lições aonde vai começar um processo de purificação para purificar nós vamos precisar dos sobrinhos de coleta vão abrir um saquinho novo aqui de tubo de coleta e como falar para fazer isso antes mas aqui só para
vocês acompanhar em tempo real vai ser legal o subiu de coleta ao tubo de coleta é esses aqui aí esse tubinho que não tem tempo tá então separei aqui o instrumento de coleta e e tem que pegar também obviamente a Coluninha que é o que vai fazer o processo de purificação esse em duas colunas uma para uma mostra e outra para outra mostra e agora essa gente se vê Obviamente você precisa marcar o tubo vamos lá não se esqueça de fazer isso né que até esse momento é os tubos não está arrumar cartão Dá para
colocar aqui no caso né né no caso dessa desse kitzinho que dá para escrever na tampa eu gosto eu prefiro escrever na tampa e na parede para ter certeza que eu tô tô fazendo certinho né que eu não tô estudando essa moto Apesar que aqui no tubo de coleta não faz muita diferença Nossa horroroso faz um aqui ou aqui mais importante é colocar o nome certinho na tampa que onde vai estar a mostra mesmo mas é que eu gosto de colocar também só porque eu sou neurótico agora o próximo passo o seguinte nós vamos adicionar
250 micro litros de isopropanol em cada um dos tubos e depois vou ter que sair então deixa eu isso para o canal aqui já separado no tubinho a e pelo seguinte né Para nós Aquele tudo bom grande aqui atrapalhando a gente eu vou ajustar aqui 250 já está 250 vamos pegar 250 micro litros de isopropanol e colocar aqui na mostra um que a gente acabou de tirar lá da incubadora e aliás do banho seco eu vou trocar aqui para não contaminar mais 250 na amostra 21 Oi beleza o Vortex de novo dez segundinhos se esquece
fechar bem aqui né ela não abrir e saiu voando tudo que não é incomum beleza porque só um pouquinho e deixa a mostra aqui ele vai fazer agora é o conteúdo pegar o conteúdo de cada um dessas nossos sobrinhos aqui que tá muito barulho gente colocou isso preparar o etc e passar para coluna vez que ele vai fazer tá aqui não tem muito segredo tem só uma dica que eu gosto de dar aqui ó Então pega aqui o conteúdo touro e tem aí os seus sei lá mais uns 400 e poucos micro litros né e
vem aqui autoboom CO2 deixa o que que eu faço e Pet aqui ó a minha dica é pipeta no centro da coluna e pega lá no centro da coluna A evita jogar na parede nesse momento e peça todo conteúdo lá no centro da coluna para você ter certeza o tio que você está completando tá entrando em contato com a coluna que é e o material que vai fazer o processo de purificação certo Me coloca lá no centro do itinho é preciso para um e faz isso por outro também E aí e vai não tu dar
uma só dois e perto é bem lá no centro evitando jogar na parede se jogar na parede também não tem problema mas você evita evita tenta fazer com que a amostra entre o máximo possível de contato com a coluna que tá aqui no centro 17 Joga lá beleza feito isso vai fazer é fechar a coluna importante fechado esquecer de fechar ela vai centrifugar não tá coluna aqui na centrifugação na no tubo de coleta da 1 e 2 agora nós vamos centrifugar processo de centrifugação da amostra a toda mostra que realizada degree celular potente e Misturado
vai passar pela coluna vai passar pela coluna e o que fundo nosso interesse aqui no caso hoje é DNA e RNA né porque se que trabalha com o RNA com ácidos nucleicos o tal daí a r a vai ficar preso na colônia como a gente Dilma na aula teórica é durante o processo de centrifugação E aí começa o processo de purificação o r ao dele é preso na membrana vai começar o processo de purificação tudo o resto vai passar reto a gente vai jogar fora vamo lá para centrífuga agora a gente vai repetir este processo
algumas vezes então aparece a primeira rodada centrifugação que a gente vai fazer é amostra e essa moça ela vai passar pela coluna e esse prender que foi de me arranhar vai ficar associada a comune o resto vai passar reto hoje que tu vai fazer agora esse processo foi feito por centrifugação eu já ajustei aqui a centrífuga ela já está preparada para centrifugar por um minuto na velocidade máxima que ela tem capacidade de temperatura ambiente mesmo estou colocando aqui uma amostra não esqueça de balancear centrifugar eu tenho hábito já deixar o pininho do tubo virado para
cima não é obrigatório aqui nesse caso mas você que tiver o ato deixa também deixa ela balanceado aí para não fazer um barulho para não desbalancear no caso nenhum acidente no meu esquece fechar tampa normal esqueci de fechar fechou bem a hora que trava aqui é a tampa a festa Trip Down start a moça vai passar lá Vamp ficando retido na coluna então daqui um minuto a gente volta para retirar amostra da sempre sem divulgação finalizada vamos ver E aí E aí E aí amostra passou pela colônia tão que a mostra que ela está preso
na coluna e o que é sobrenadante aqui o que passou reto não nos interessa vão para bancada se nós terminamos a centrifugação agora aqui a gente tá vendo aqui a solução e o fundo tudo certo e aqueles que ia fazer um negócio que é meio estranho que pode parecer meio estranho para quem nunca fez ouvir a quem não entende o protocolo pode ficar muito inseguro quer pegar e esse tubinho daqui tirar dali de dentro tirar você que ir aqui estudo que tá gostando são lá fora in walsh sair amostra não tá ali amostra retida aqui
na nossa coluna né não se processo de purificação um serviço para isso amostra alisada com um monte de porcaria da misturado passou pela coluna o que é rearden a ficou retido aqui na coluna e o resto ficou na solução que atravessou que passou direto pela colônia pela para nossos pegar a mostra está aqui é isso que nos interessa então por isso é a e aqui a gente vai colocar em um tubo longo já deixei um tubo de coleta pronto aqui da mostra um deixar de bonitinha mostra tá ali preso mesma coisa aqui para nossa dois
joga a força que não nos interessa passa Coluninha retendo amostra de verdade nossa realdania passa para coluna Luz agora que o processo de purificação começou ela já fez arrumar a parte da Purificação já foi feita não precisa lavar é aquele é resgatar retido ali o DNA tá retirou ali na conversão ser lavada a gente vai retirar um pouquinho de proteína que ficou outros de abrir celulares outras coisas que estão ali a gente vai fazendo lavagem gente faz isso com solução de lavagem é um abraço a nossa que a gente vai colocar adicionar aqui dentro 500
micro litros de solução de lavagem vou pegar a minha P1000 deixa ajustar aqui para 500 vamos passar isso aqui para 500 que a gente micro litros e adicionar ó a gente vai fazer o processo de lavagem algumas vezes é por isso que a raposa aqui e com vários monitores vários ML né então pegar 500 micro litros o e colocar e cada uma dos nossos o diretamente lá na mostra tá mesma coisa Tenta pipetar diretamente na coluna que é onde está a só amostra retirada não faz esse processo se você conseguir jogar diretamente ali como eu
tô fazendo aqui é o melhor ó o processo de lavagem passa a ser mais eficiente feito isso fecha a e agora nós vamos fazer três rodadas centrifugação vai centrifugar por 3 minutos na velocidade máxima é centrífuga três vezes tão nós vamos pegar essa solução aqui essa essa nossa mostra misturada a solução de lavagem centrifugar por 10 por 3 minutos em velocidade máxima aquela solução vai passar lavando amostra gente vai jogar solução de lavagem fora adicionar mais 500 micro litros sem Sugar por três minutos numa velocidade de Março vai fazer mais uma lavagem e pedisse mais
uma vez de fazer total de 3 vezes para fazer bem esse processo de lavagem mesmo para depois recuperar ele ia mostra vamos lá para essas essas três rodas Vamos a primeira rodada de lavagem então mesmo que a gente fez na primeira rodada de centrifugação deixa que bonitinho balanceado a festa centrífuga só que agora a diferença que a gente vai fazer se sente ligação vai ser um pouco mais lenta por três minutos vamos lá primeira rodada Valente on [Aplausos] [Música] E aí [Música] E aí [Música] [Aplausos] [Música] E aí eu vou agora que a gente fez
os três passos finalizamos os três passos de lavar gente vai jogar fora né o último produto aqui da da Lavagem e recuperar amostra Eloir a moça eles são na nossa significa retirar desprender o DNA ou RNA ali da membrana e passá-la a solução novamente a gente vai fazer para isso vão precisar é o de um tubo novo que é o tubo que a gente vai guardar mostra onde ela vai ficar armazenada de fato depois então vamos escrever vamos nomear nesses dois tubos aqui para a gente não perder para ficar tudo organizadinho depois então vai que
em um dos tubos colocar mostra um e no outro a amostra 21 e foi assim ó tinha ele vai fazer então vai descartar o sobrenadante né que passou pela Coluninha pega o tubo da mostra um Coloca ele aqui bonitinho é a mesma coisa faz a mesma coisa com amostra 2 e deixa aqui no tubo que é onde a gente vai guardar agora nós vamos fazer um passo que é semelhante ao passo lavagem só que vence uma solução de lavagem vai ser água é poderia ser certo né que nunca nosso caso o que está pedindo água
vamos pegar a água ultrapura que vem no Kit já colocar 60 micro litros dessa água diretamente na coluna e centrifugar só que depois da centrifugação de frente o que aconteceu das outras vezes a água vai desprender vai evoluir amostra da coluna vai desprender a moça da lide dentre fazer ela passar direto é totalmente frente o que aconteceu outras vezes as outras vezes nós jogamos descartamos o que passou pela coluna e Guardamos a coluna que vai ser o contrário Então uma muito cuidado nesse passo foi lá por um acaso você não chorar fora o que é
do seu interesse nós vamos pegar a amostra fazer uma rodada de certificação agora com 60 mil litros de água não quente micro litros de solução de lavagem mais com 60 micro litros de água amostra e na coluna ficar no fundo a gente joga com uma fora é a nossa está pronta para guardar ou fazer o controle de qualidade vamos lá vão pegar água água que agora nós vamos utilizar 60 micro litros que eu pegasse pc-60 micro litros de água dentro da colônia mais uma vez tá só que agora como eu falei para destruir a mostra
você senta micro litros de água mesmo esquema lá na colônia um direto na mostra direto lá no meio o máximo que você puder e agora o volume atenção que o volume é bem menor normal tá estava aproveitando 500 micro litros agora tá apertando só 60 micro litros é um volume bem menor não se assuste anormal lá no fundo bonitinho não esquece de tampar mais uma vez Oh e vamos para mais uma rodada centrifugação agora Passa o final de centrifugação para recuperar a moto vamos lá na última rodada de centrifugação agora para ele ir à mostra
vamos lá mesmo esquema não deixa de esqui colocar organizadinho aqui às vezes o tubinho ele não cabe direito na centrífuga é você pode deixar em meio a tampinha dele meio de lado depois ele se ajeita lá dentro tá mas não é não esqueça de balancear a ver com isso só ligar e a eleição vai começar centrifugou por um minuto tá pronto Agora é o seguinte E não se esqueça né que o que importa agora é o que tá dentro do se tubinho é a sua mostra mesmo o que está na coluna é descarte vou jogar
aqui ó vocês não tão vendo aí mas estou descartando mesma coisa para outra mostra aqui é descarte e aqui está a mostra eluído é feito isso Acabou e a sua extração está completa que as duas famosas prontinhas para armazenamento ou para você iniciar são pontos os pontos de controle de qualidade da Estação e da Purificação então pra gente finalizar eu daria que algumas dicas para vocês como a gente já fez em outros vídeos de aula prática que eu peguei de algumas dicas finais aqui também tem algumas dicas que vocês podem fazer mais como vocês viram
um kit ele é extremamente concurso é muito fácil usar Não tem segredo não tem muito que utilizar aqui sim eventualmente você precisar fazer alguma coisa diferente ali talvez se você tiver a nossa muito suja Nossa muito impura colocar mais um passo de rodada de lavagem não é isso é fora no protocolos eu que tô falando não é uma ideia que eventualmente alguns protocolos cai bem você pode fazer mais uma rodada de lavagem colocar um quarto passo de lavar aquela dica de apertar sempre no centro ela é muito importante Ela é excelente e se você tem
pouco material nos que uma terceira é dica para quem tem pouco material que um pouco RH pouca de né não funcionar bem naquela primeira rodada a gente fez a eles são aliás que a gente fez a análise amostra analisada depois tem que o batom e fez a primeira centrifugação o que você poderia fazer ali também passar a sua mostra pela Coluninha de centrifugação duas vezes aquela solução usada passa pelas pela coluna é pela colônia depois da centrifugação Pega aquele sobre antes que a gente jogou fora e vai jogar fora passa lá mais uma vez acumula
também tá fora do protocolo é uma dica que eu tô te dando a faixa aqui do que tá escrito que é recomendado lápis mas para quem tem poucas amostras às vezes essas idéias elas acabam funcionando muito bem e pra finalizar mesmo última dica se você gostou desse kit Você tem interesse em trabalhar com vírus ou trabalha com vírus e que trabalha com o vídeo não importa trabalha com material é viral e tem interesse saber mais sobre esse kit eu vou deixar aqui na descrição desse vídeo um link para você um formulário para você preencher ali
e a promete vai e brinca como é que vai entrar em contato com você para tirar dúvida eventualmente para esclarecer alguma coisa porque nada mais justo esse aqui funciona muito bem foi disponibilizado uma cortesia da parceira promega e eu acho que vale a pena vocês conhecerem beleza eu sou Eduardo ccasa do universo da biologia molecular Eu só preciso fazer mais um agradecimento importantíssimo ao Instituto Lauro de Souza Lima em Bauru que forneceu esse espaço aqui principalmente a equipe técnica da Patologia e da biologia molecular um beijão aí para Bia Aluno Universo sabe o mal que
disponibilizou tudo isso aqui para gente fazer a gravação Valeu por um mega valeu valeu sinto nossos Lima quando todos vocês gente se vê no próximo vídeo tchau tchau [Música] [Aplausos] E aí [Música] E aí [Aplausos] [Música]
