Como desenhar primers: do zero à PCR

Olá seja muito bem vindo ao universo da biologia molecular na aula de hoje eu vou ensinar tudo o que você precisa saber tudo o que você precisa saber para desenhar o time pra fazer pc então a aula de hoje é uma aula prática mal até a hora que tem uma parte teórica mas nós vamos fazer o desenho dos primeiros na prática utilizando softwares disponíveis gratuitamente na internet beleza então hoje a gente vai fazer uma aula prática Antes de a gente começar deixou de lembrar por favor não se esqueça de se inscrever no canal vamos fazer

essa comunidade crescer quando você se inscreve no canal você interage comigo de alguma maneira vil tube o youtube o google entendem isso como maneira de interação que esse conteúdo é importante para você que pessoas com perfil parecido com o seu podem se beneficiar com esse tipo de conteúdo ea Gente vai alcançar mais pessoas então por favor hoje não se esqueça de se escrever aí no canal beleza então depois a vinheta gente começa a aula o mar [Música] e é isso aí como eu falei pra vocês a gente vai fazer uma aula prática do zero com

desenhar praias para você fazer pcr a partir do zero a 100 desde você conseguir a seqüência de dna candy do Seu interesse que é o seu alvo até você ter os primos diluídos e otimizados para a sua reação de percebe então vamos lá qualquer agenda de hoje eu dividi aqui como de costume mais ou menos em quatro partes essa aula então a gente vai começar com os conceitos necessários aqui se você está a um nível mais avançado e não precisa de conselhos sobre o que é pcr o que é primer como funciona a organização que

eu matei uma temperatura de anulamento esses essas Coisas todas você pode pular e daqui a pouco vou falar para que momento dessa aula que minuto da sala você pode pular para ir direto para a parte prática agora eu te aconselho fortemente que você fique assista esses conceitos iniciais porque são eles que vão te dar base para você entender como desenhar os problemas lá na frente o que é importante você saber o que é importante você considerar no momento de desenhar seus primos tá bom Aí depois a gente vai para a parte prática que é desenhar

para a emergency lá a gente vai conseguir vai descobrir encontrar seqüencial que vai utilizar a nossa pcr nós vamos utilizar um software um álbum chamado câncer ou melhor que é um orgulho pra identificar regiões é conservadas do seu álbum isso pode ser importante para algumas pessoas depois vai utilizar o pac 1 1º 3 plus que é o software de desenho de praia Propriamente dito e considerar vários parâmetros recomendados para uma pc é adequado para que uma pessoa que funciona adequadamente depois vai para a parte de validação desse prêmio é que a gente desenhou a sonda

fazer a validação em cirílico lá no blast depois a gente vai utilizar um outro algoritmo chamado net primer e depois vai falar um pouco sobre as validações bancada claro que a prática não vai ser Na bancada hoje não pelo menos talvez algum dia mas é eu vou falar pra vocês do que vocês têm que fazer um laboratório para diluir os planos de maneira adequada pra fazer pra vocês é otimizar o funcionamento e as condições e as concentrações desses prêmios na sua reação tá bom e aí nesse processo todo de validação ou falar também como que

você compra quais são as informações importantes que você deve considerar na hora de comprar um Primer só de filtrar é o sistema de purificação ou falar de quantidade de taxas de rendimento essas coisas todas são importantes para você considerar no momento da compra então olha só nessa aula kim é importante que você já saiba para você entender o que eu vou falar hoje é importante que você já saiba em detalhes o que é e como funciona a pcr qualquer estrutura do dna como dna está estruturado e entender um pouco sobre Temperatura the melt sobre pcr

temperatura de mel ou falar previamente na hora de hoje aqui explicando pra vocês mas é bom que você tem esses conceitos mais bem estabelecidos antes de entrar na aula tá bom se você quiser assistir uma aula específica onde eu falo especificamente sobre o pccr lá dentro dessa aula eu falo sobre estrutura de primers acessa playlist que estou colocando aqui em algum lugar acessa playlist que lá vai Ter todas as informações que você precisa além dessa playlist você pode encontrar uma outra aula que tá no meu canal também eu vou deixar essa lá no final nos

vídeos recomendados lá no final do da apresentação que a uma aula sobre a pcr em tempo real na aula de pcr em tempo real tem um momento que eu falo sobre temperatura time out ou você procura aula completa sobre pcr em tempo real e encontra lá A parte temperaturas melt ou você procura um vídeo e desmistificando a temperatura de mel disse que lá eu explico tudo isso em detalhes certo então vamos começar com esses conceitos iniciais necessário se você não quiser saber sobre seus conselhos nem sei se você já sabe se você quiser pular direto

para a parte prática dessa aula as essa aí é o vídeo nesse tempo que eu tô mostrando aqui na minha tela que eu não sei ainda que é porque estou gravando Meia hora mas depois quando editar um vídeo você vai saber exatamente para quê momento dessa aula você pode pular para assistir a parte prática os conceitos iniciais necessários gente precisa entender são esses aqui então a gente vai falar sobre pcr bem rápido não falar um conceito rápido percebe porque têm uma aula complexo pr vai dar uma um lembrete depois a gente vai falar dos primers

porque são eles os responsáveis pela especificidade da pcr Porque eles são muito importantes e eles são a base da onde hoje é bom entender isso depois vou falar da temperatura de melt o que é e da temperatura de anelamento que são coisas diferentes muitas pessoas não sabem mas são coisas diferentes e depois a gente vai falar das estruturas secundárias todos esses são os conceitos iniciais necessários pra gente e prática então essa teoria da aula de hoje Começando com pcrf pr vocês sabem muito bem provavelmente vocês sabem muito bem que é uma técnica muito utilizada em

laboratório de biologia molecular ela é muito popular utilizada não só para se fazer aplicações relacionadas à pcr em si mas é utilizada dentro do fluxo de trabalho ou dentro do protocolo de várias outras técnicas como técnica de pcr em tempo real seqüenciamento michael rei e clonagem a cimpor tem um Monte de outras técnicas que utilizam a pcr em algum momento além do seu fluxo de trabalho então a técnica é muito utilizado porque o que ela faz duas coisas fundamentais para quem trabalha com dna ou confiar que é a quantidade com o ps a gente consegue

aumentar muito a quantidade do álbum que a gente quer analisar e à especificidade que a gente consegue analisar o aumentar a quantidade de um fragmento específico só aquilo que eu preciso ver aquilo que é Preciso analisar então ela consegue aumentar várias vezes fazer cópias muitas e muitas e muitas cópias de um fragmento específico é mas é algo parecido com que a célula facel no momento da divisão ela vai multiplicar o seu genoma para que essas duas células filhas têm um cópia desse genoma aqui na terceira ele vai fazer isso também só que a gente vai

fazer um tubo de ensaio muito bem vai fazer essa reação in vitro e obviamente a gente não vai utilizar Toda a maquinaria da cela a gente vai utilizar gerar condições artificiais para que uma enzima consiga fazer várias cópias de um fragmento específico e estou mostrando aqui então imagina que eu tenho esse meu alvo em azul na verdade esse é o meu fragmento da onde há onde tem o meu alvo só que possui um dna genômico pode ser um clone pode ser um gene pode ser um fragmento você conheceu qualquer coisa então tem Uma molécula que

dentro dessa molécula dentro de si mesmo molde eu tenho aí sim o álbum exatamente que é o que eu quero fazer várias cópias que é o que está aqui em vermelho então com a pcr eu consigo fazer várias e várias cópias do meu fragmento vermelho que um fragmento específico como a gente faz isso a gente vai colocar dentro de um tubo que vai criar dentro de um tubo todas as condições para que a gente consiga vá fazer cópias Desse fragmento específico ali dentro vai ter que ter obviamente o meu dna molde que ela vai o

que vai servir como molde com um template pra eu fazer cops uma enzima cadeia da polimerase a idéia polimerase é é a enzima que vai construir vai sintetizar as cópias do dna que eu estou copiando os nucleotídeos que são as unidades formadoras da molécula de dna não são hostis os tijolinhos para dna polimerase adicionar aqui ao longo do processo da Pf os primeiros que são os olhos nucleotídeos que dão é especificidades são eles que selecionou fragmento algo que eu quero fazer cópias e nós temos união bivalente que é geralmente magnésio formato de cloreto de magnésio

que o fator de napoli mas além disso além desses ingredientes a gente precisa criar as condições favoráveis para que a pessoa que ocorra e basicamente vai fazer duas coisas temperatura nós vamos Variar temperatura para que os passos da pcr sejam possíveis de acontecer e nós vamos manter uma concentração de sal ou seja a pressão osmótica ali dentro controlada e o ph também tem uma solução tampão para que o ph vary pouco ao longo da serra então olha aqui primeira primeiro passo precisa dividir três passos o primeiro passo é que estou mostrando pra vocês onde nós

temos uma molécula aqui uma molécula de dna fita dupla esse é o meu Alvo é esse fragmento aqui aqui que eu quero fazer várias e várias cópias e esse fragmento eu quero fazer várias cópias então imaginem que se está falando de um dna genome com o fragmento maior imagine que nessas extremidades nessas duas extremidades aqui tem mais um montão de dna pra cá né mais um montão de dna pra cá mas hoje ele não me interessa eu quero olhar só para o meu algo pra quem eu quero fazer Cópias o resto não me interessa o

que a gente tem que fazer a primeira coisa que tem que fazer é de naturalização molécula pegar essa estrutura dupla fita romper essa estrutura essas ligações que formam que permitem que a molécula se mantenha dupla fita em duas fitas simples a gente faz isso através de temperatura a gente aumenta a temperatura lado da temperatura ambiente de 25 graus mais ou Menos para 94 95 graus por um determinado tempo alguns segundos ea 95 94 graus celsius a molécula de dna dupla fita vai se dissociar formando duas fitas simples e aí a gente vai para o segundo

passo o segundo passo ele acontece uma temperatura menor por volta de 60 graus isso varia e hoje vai falar bastante disso vou explicar porque isso varia porque a temperatura de anelamento que é o segundo passo que eu to distante pra vocês Ela varia de situação para situação mas o que importa é nessa temperatura ideal de anulamento aqui nessa temperatura ótima janela momento aqui no meu exemplo a 60 graus os primers que a gente colocou na reação eles vão encontrar complementariedade as extremidades do meu fragmento alvo porque eles vão encontrar complementaridade porque eu desenho prima dessa

maneira eu sabia qualquer a seqüência do meu alvo antes de fazer o Sr ou eu sabia pelo menos qual era a seqüência de nucleotídeos ou de base das extremidades do meu alvo eu mandei sintetizar eu desenhei isso que é o que vai fazer hoje utilizando um software deu depois que eu desenhei esses primos utilizando um software eu liguei no meu fornecedor falou o fornecedor eu quero que você sintetize esses primeiros nessa seqüência específica que eu estou mostrando aqui Pra vocês porque ele se liga nas extremidades do meu álbum e eu quero fazer pr com esses

fragmentos e aí o fornecedor vai entregar pra você no seu laboratório e você vai utilizar na reação de pcr e como eles são específicos eles vão se ligar às extremidades do meu alvo e aí a gente pode para o terceiro passo que a extensão ao longo da extensão a nós temos essa estrutura zinha dupla fita que formada especificamente entre o Meu primeiro o meu alvo em ambas as extremidades das duas fitas simples e nessas condições é a primeira fase ela consegue se associar em tomar de napoli mas ela encontra-se estudo estrutura dupla fita aqui onde

nós temos uma estrutura uma extremidade 3 linha livre aqui no meu primo uma extremidade 36 livre que o meu primo a dna polimerase ela se liga à essa essa estrutura do prefeito do profeta e ela Consegue adicionar nucleótidos de maneira complementar aqui ela vai utilizar essa fita azul aqui com um molde e vai adicionar nucleotídeos de maneira complementar aqui no caso ao adicionar uma citocinas tosi numa tim bum adenina guanina e timina adenina timina assim por diante formando a nova fita ela funciona dna polimerase ela funciona de temperatura várias temperaturas anapolina se consolida em vários

campeonatos mas de Um modo geral aqui hoje em dia falar de napoli mas ela funciona no seu potencial máximo a 72 graus celsius tel basicão da pcr então a 72 grau celso de lima polimerase ela funcionar ela trabalha em sua maior velocidade então que ela vai fazer pegar os nucleotídeos livro sem solução que a gente colocou lá também e colocar foi uma das novas fitas de maneira complementar e aí a gente termina o terceiro passo O interessante é que é que a gente veja que há no início no início desse processo lá no primeiro passo

nós tínhamos uma molécula molde né uma cópia do meu alvo no final do terceiro passo essa molécula que ela gerou duas então passa a ter duas se eu repetir esses três passos de novo só que agora começando com duas moléculas no final deste terceiro passo de novo que eu comecei agora com duas moléculas eu Terei quatro porque cada uma dessas duas aqui gerou mais duas é votar quatro se repetir três passos novo começando com 4 no final do processo ter 8 se eu começar de novo pensando coisa pois um de nós vai ter 16 depois

32 depois 64 depois 128 assim por diante e é por isso que a gente consegue fazer várias cópias de um fragmento específico então o resumão da pc é isso aqui a gente pega esses três passos repete várias vezes de 30 a 50 vezes dependendo Da aplicação e aí uma molécula já eram duas do 14 408 8 16 16 32 e 64 128 assim por diante até que no final da reação lá depois de quarenta ciclos de pcr eu tenho bilhões milhões ou bilhões de cópias do meu fragmento aos certo isso aí a pcr esse é

o resumo que eu tinha que fazer pra vocês sobre o pccr agora vamos entender como é que os primers ele se ninguém de maneira específica às extremidades Eu falei pra vocês então a gente desenha o primeiro a gente constrói o primeiro de tal maneira que ele seja complementar as extremidades do meu álbum mas como é que eles tenha como é que eles são complementares porque eles são complementares porque ele se liga na extremidade e não se liga em outro lugar na molécula é isso que vou explicar para vocês agora então dá uma olhada aqui ó

é uma questão de probabilidade de imunização Então com um primer hibridização essa associação de um dna fita simples a um outro de nesta simples um fragmento de dna fita simples encontrando um outro dna é fita simples então seu processo de mobilização a formação da dupla fita de novo eu vou mostrar pra vocês uma fita simples o fragmento de dna só uma fita dele não existe ele não é dupla fita com uma sequência que eu não sei a qualquer cada negócio desse aqui um nucleotídeo mas eu Não sei qualquer sequência deste fragmento como entender aqui então

como que essa probabilidade de imunização torna os primeiros super específicos imagine que eu tenho no clube de vôo livre na minha reação na minha solução aqui narração de nata uma solução eu tiro livre e ele é uma se tornou se na eu vou fazer uma pergunta para vocês qual que é a probabilidade dessa citosina se associar a este nucleotídeo que eu não sei qual é a sequência aqui Na extremidade qualquer propriedade a assinalar-se a que tiver uma adenina ele vai se ligar no bairro se tiver uma tina ele vai se ligar e não é se

tiver uma citocina outras 12 nem vai se entregar não mas se tiver uma agonia ele vai se ligar ele vai se ligar então das quatro opções que nós temos a ação dessas citocina aqui apenas uma vai funcionar então em outras palavras estou falando o seguinte olha que eu Tenho uma chance em 44 possibilidades e apenas uma chance dessas citosina ciliar na extremidade sócia na sua extremidade tiver uma boa menina certo uma chance em 4 agora de novo mesmo a situação só que em vez de uma torcida só eu tenho duas usinas uma ligada na outra

duas cozinhas qualquer chance dessas duas citocinas encontrarem duas meninas aqui na extremidade se tiver a te liga não liga a c&a g há há há nada disso liga Se tiver cg gc ct nada disso funciona nesse caso eu tenho 16 possibilidades das 16 possibilidades que são essas daqui apenas uma somente quando aqui na extremidade for gg esses dois núcleos juntos esse micro um óleo que o time vai encontrar complementaridade vai se ligar tão uma chance em 16 se nós tivemos então agora um fragmento pequenininho de três núcleos índios Quais são as possibilidades de encontrar complementaridade

aqui no treino aí passa a ter uma chance em 64 são na verdade são 64 possibilidades e apenas uma delas vai ser complementar ao meu fragmente um álbum ok então das 64 possibilidade somente quando aqui nós tivermos um g gc sg c c vai encontrar complementaridade quem tiver um óleo que eu tive um primer por exemplo de seis núcleos essa chance Diminui para 1 em mais de quatro mil em uma chance em 4.100 tiver 20 nucleotídeos que é o tamanho médio e dos primers nós temos uma chance em mais de 1 bilhão desse fragmento de

21 que eu te desencontrar complementaridade em outras palavras se um time ele não for desenhado construído para saber lá especificamente uma região conhecida é muito improvável falando os considerando apenas probabilidade é muito improvável Que esse primeiro vá encontrar complementariedade em algum outro lugar é muito improvável que o primeiro específico para uma região específica vai encontrar complementaridade e outras regiões considerando apenas a probabilidade é biologicamente falando isso acontece acontece em vários motivos para que isso aconteça mas não interessa aqui nesse conceito agora o conceito que você tem que entender é de probabilidade então é Por isso

é por questão de probabilidade que um primer de 20 núcleos tidos ele tem uma probabilidade muito pequena e lá em duas regiões diferentes de um mesmo final certo como isso pra vocês acontece acontece e nós vamos trabalhar na aula de hoje na prática na vida real nós vamos trabalhar nós vamos desenhar primers que têm menor probabilidade de senna em regiões que não são as regiões que a gente quer aos nossos altos certo então hoje nós vamos criar condições e Utilizando as ferramentas que vou mostrar pra vocês para que os prêmios sejam ainda mais específico têm

maior chance de serem específicos ao nosso alvo e de onde vêm os prémios eu comentei pra vocês o primeiro ele é sintetizado você de uma vez que você desenhou depois que eu mostrar aqui pra vocês como desenhar você vai mandar fazer você baixar o seu fornecedor e vai pedir o seu fornecedor ele vai lá uma máquina existe uma máquina e equipamento Que vai ligar um nucleotídeo atrás do outro na ordem que você pediu então ele vai pegar uma boa menina ligado a uma sintonia fina é depois uma menina e um administra por diante até formar

um núcleo o óleo nucleotídeo que você pediu site de uma máquina que faz isso que vai sintetizar na ordem que você quer você compras e aí já falar no processo de compra também cause quais informações você precisa adaptar seu fornecedor para que você consiga comprar isso de maneira Mais tranquila com mais segurança então falamos dos prémios vão falar da atm ou da temperatura the melt olha só olha essa imagem aqui eu tenho uma molécula de dna dupla fita ela está dissociada então formamos aqui duas fitas simples elas são complementares àquelas são associadas para uma duas

fitas simples porque a temperatura está muito alta se a gente diminui a temperatura aqui Você não imagina que seja 95 graus em diminuir a temperatura na temperatura ambiente 25 graus essa molécula vai se associar de novo problema do prefeito certo é isso que acontece só que se a gente abaixar essa temperatura gradativamente de 95 a 94 a 93 e baixando aos pouquinhos essa molécula vai se juntar ao mesmo tempo ela vai se associar inteira ao mesmo tempo uma molécula essa parte azul Vai grudar nessa parte laranja toda de uma vez não é assim que acontece

a molécula vai se associando aos poucos as partes são mais estáveis da molécula provavelmente onde tem mais conteúdo dgc ela se associa antes nesse processo de descer à temperatura de 95 para uma temperatura mais baixa as partes mais estáveis elas se uniram antes as partes mais instáveis e logo depois o que acontece é o seguinte ó baixou um pouco a temperatura alguns Pedaços e silva que eles vão começar a se associar com um bloco inteiro alguns pedaços se associar é baixar um pouco mais outros pedaços como associar e olha que nesse meu caso agora olhar

mais ou menos aqui eu tenho metade mais ou menos a metade da minha molécula ela tá fita dupla de novo em metade dela ainda está a finta simples quando isso acontece nesse processo de diminuição da temperatura de 95 ontem provocando mais baixa onde eu tenho metade da minha Molécula já associada novamente ea outra metade ainda está dissociada é neste momento que eu falo que essa molécula está em sua temperatura the melt é aquela temperatura onde metade da molécula já está associada formando a dupla fita em metade dela ainda está dissociada ainda simples então aqui é

a temperatura tinha antes se eu baixar um pouco essa temperatura que vai acontecer aqueles outros pedaços Eles vão começar a se associar a fórmula do planeta se eu achar um pouco mais ela vai formar dupla fita por inteiro toda mora lá sairá dupla fita de novo certo olha só porque isso é importante porque a temperatura the melting ela é um indicativo é um indicador da estabilidade da dupla fita do dna é um indicador da estabilidade da dupla fita de dna e isso é fundamental lá na frente quando a gente foi desenhar Primeiro porque esse indicador

de estabilidade aqui ele vai ser utilizado ele vai ser um dos parâmetros que a gente vai estabelecer lá no software desde prima para que a gente saiba mais ou menos como vai ser depois lá na frente à temperatura de amy lamento que é o segundo passo da pf então a gente vai determinar a gente vai descobrir a temperatura de immelt pra lá na frente de terminar a temperatura de lamento a gente vai determinar conhecer A estabilidade no plus ita para depois de terminar a temperatura hoje no aumento claro uma coisa muito importante toda molécula ela

vai que esse perfil de associação ou dissociação toda molécula em outras palavras ela vai ter a mesma temperatura the melt não moléculas de dna diferentes têm temperatura the melting diferente a temperatura de melting a estabilidade da molécula ela está diretamente relacionada com o tamanho da molécula a Quantidade de nucleotídeos ou pares de base que essa molécula tem e a quantidade de goiana e citosina em relação à quantidade de adenina e termina então quanto maior for uma molécula quanto mais cumprida uma molécula com maior quantidade de nucleotídeos ou bases tiver essa molécula maior a sua temperatura

the melt quanto maior a quantidade de gone nina e citosina em relação à denit mina também Maior a sua temperatura the melt moléculas grandes moléculas com maior quantidade de bases precisam de mais energia para se dissociar moléculas com maior quantidade de leis e também precisam de mais energia para dissociar por isso que elas têm maior temperatura de mel moléculas que não a quantidade de gc elas são de mais energia porque porque a ligação de goiana com se 12 ela é feita através de uma ligação tripla de pontes De hidrogênio adenina com tina uma ligação dupla

de pontes de hidrogênio para romper uma ligação tripla você precisa de mais energia do que você precisa para romper uma ligação do platão resumo isso aqui a temperatura de mel de um fragmento de dna depende do seu tamanho não gostar de bases ea sua proporção entre gc e até quanto maior o fragmento quanto marco da gc maior a temperatura radiante e aí nós vamos para temperatura de anelamento voltar aqui Porque eu mostrei slide aqui voltar nessa situação não é a fita simples lá em alta temperatura e conforme a gente a baixa temperatura vai se associando

é porque é isso que vai acontecer entre o primeiro passo o segundo passo da pcr nós temos a mulher contou dissociada no primeiro passo ea gente vai baixar a temperatura para que os primers ianelli então a molécula começa-se real social nesse processo só que os primeiros eles vão se associar Antes da molécula antes da molécula se associar formando dupla fita de novo os pais se ligam antes disso acontecer é que ali por volta de 60 graus mais ou menos e e porque só que é importante porque a gente tem que entender que a reação de

pcr qualquer reação do laboratório de biologia molecular não acontece com o mar que a gente tende a ver isso aqui que estou mostrando pra vocês como um negócio meio mágico né contou tocam tudo se liga tudo fundo mas Não é assim que acontece a gente tem que tentar entender sempre o que está acontecendo lá no tubo o que com a reação o que passa de uma reação um procedimento que você está fazendo laboratório o que aquilo significa o que está acontecendo dentro da molécula ou entre as moléculas durante esse processo quando a gente faz esse

exercício de não achar que tudo é mágica que tudo acontece simplesmente o que acontece consegue entender melhor como funcionam Os processos de biologia molecular dessa maneira isso é fundamental que dessa maneira a gente pára de ter segurança no laboratório a gente diminui a nossa insegurança no laboratório porque a gente entende o processo e não só copia o que o outro faz e não só segue o protocolo está fazendo a gente entende que acontece a gente tende a ter menos insegurança no laboratório ea gente deixa de disseminar um monte de bobeira que a gente ouve por

Aí eu tenho certeza que aí nos laboratórios você trabalha no laboratório tenho certeza que você segue você faz alguma coisa que alguém de flor pra você fazer você nunca parou pra pensar por que você faz aquilo eu vou dar um exemplo visitem vários clientes eu fiz isso várias vezes onde quem trabalhavam com moléculas modificadas trabalhavam com um som das tackman por exemplo de um flor off associada à molécula eles pipetta vão e se essas Moléculas trabalhavam com suas ondas embaixo da bancada literalmente embaixo da bancada o cara entrava embaixo da bancada para fazer proprietário ele

fazia um espetáculo dentro de uma gaveta porque estava com medo de estragar o flor ofendido que aquele furor fosse perder a funcionalidade dele se ele fizesse ele não fizesse isso não é verdade europa e pede a sua funcionalidade vai perdendo o suficiente se ele ficar exposto à luz por um tempo Mas não é assim você fica um pouco na bancada o tempo que está preparando sua reação vai estragar a sua mostra fora mas o que acontece então as pessoas tendem a disseminar quando elas não tendo o processo como um todo eu entendo que elas estão

fazendo elas tendem a tem segurança quando elas têm segurança elas copio elas disseminam esse monte de abobrinhas gente em laboratório entender isso que estou mostrando aqui pra vocês é fundamental a Gente entender porque lá na frente a gente vai selecionar primas com temas específicos porque ktm é um parâmetro importante na hora de selecionar prédio na hora de desenhar praia aí eu mostrei aqui moça é o que mostrar aqui pra vocês essa molécula se re associando é de 95 graus a uma temperatura ambiente é fundamental a gente entenda por que que os primers terá temperatura de

mel que eles têm E eles têm a temperatura janela de janeiro lamento que eles têm por que que a molécula de dna não se reacionários do primer se associar a ela tudo isso a gente consegue começa a visualizar de uma maneira muito mais estruturada muito mais eficiente vamos lá cheia de reflexões vamos falar do que interessa olha que temperatura ótima de lamento porque ótima de lamento porque o primeiro pode selar a um dna a Diferentes temperaturas ele pode só que esse elemento ele inespecífico então a gente vai trabalhar com uma temperatura ótima de anelamento onde

os painéis vão se ligar de maneira específica e eficientemente as extremidades meu fragnito então vamos lá então aconteceu aquilo que eu falei que estava 95 graus 94° mais ou menos a gente vai passar a baixa temperatura e por uma temperatura onde os primers se nenhum se associe em si e pedirem as Extremidades do meu fragmento alvo de maneira eficiente e específica essa é a temperatura de lamento que não é a temperatura de melt é diferente a temperatura de melting nós temos metade da molécula associada e metade da molécula dissociada em algum momento nesse processo de

baixar a temperatura de 95 para a temperatura de lamento os meus primeiros passarão pela tranquila temperatura de melt em algum momento aqui pra cima os primeiros estavam em Sua temperatura de morte porque metade do primeiro estava associado ao fragmento alva e metade dele ainda não estava associado a um fragmento alvo nesse momento foi a temperatura de melt ou seja a temperatura de immelt é um pouco maior alguns graus a mais alguns graus celsius a mais que a temperatura de congelamento certo então imagina baixando a temperatura de 95 o primeiro vai começar a se associar uma

parte se associa a Outra ainda não porque tem muita energia ali muita temperatura se você baixar um pouquinho mais um outro pedacinho vai sair de lá aí chega à temperatura de melt se você baixar um pouquinho mais eles janela por completo chegou na temperatura de nivelamento a têmpera temperatura ótima de anelamento certo então é isso que eu vou mostrar pra vocês a temperatura de anelamento ela está em Maio ao menos quatro ou seis graus abaixo da temperatura tem temperatura de morte então se você calcula a temperatura de melt existe uma fórmula para você calcular a

temperatura de immelt você consegue a partir daí calcular a sua temperatura ótima de lamento essa temperatura the melting a forma da temperatura de mel já não é simples você vai considerar toda a teoria de termodinâmica várias informações Complexas e obter para você conseguir chegar à temperatura de malte mas você não precisa fazer isso na mão porque existem vários softwares o software vai utilizar hoje várias ferramentas disponíveis gratuitamente na internet que vão calcular pra você essa temperatura de modo que você vai precisar fazer a gente vai fazer daqui a pouco é colocar seqüência no cantinho de

tamanho no corte do seu 1o a concentração de sal na sua reação e Basicamente isso a gente consegue chegar à temperatura de menos mas uma vez que tenha temperaturas melt a fórmula da temperatura de anelamento que é o que nos interessa pá para fazer a pcr é para programar o termociclador lá durante a pcr é facinho ela 0.3 vezes a temperatura de morte do primo que a gente vai descobrir os anúncios só um software mais 0.7 vezes a temperatura de mount do meu produto e produtores daqui é o que a gente vai formar ao longo

da Pcr que a gente consegue descobrir também colocando essas ferramentas aí - 14.9 então se imaginar que um exemplo se eu tivesse um primer cuja temperatura de the melting dele seja 60 graus o coca que 60 graus e um fragmento de uma temperatura de mel de 72 vamos supor que coloca a informação aqui faça continha eu vou chegar à conclusão que a temperatura de ótima de nivelamento desse meu primo de um deles né porque estou aqui tem que fazer para cada um Deles essa conta que para cada um deles é de 53 pontos cinco graus

celsius mas não se preocupe com isso agora a gente vai falar isso na prática já e aí a gente vai para as praias estruturas secundárias que são fundamentais quando a gente fala que desenho de praia porque porque um primer é uma molécula de dna pista simples em outras palavras se desenhou um negócio de 20 no peru x é um dna zin fita simples Isso quer dizer que se ele encontrar complementaridade nas condições ideais ele vai se ligar essa complementaridade pode ser o alvo tem que ser só esse objetivo mas ele pode encontrar complementariedade um outro

primo em primeiro ford por exemplo se ligando um prime reverse um primer ford se ligando ao próprio praga foge um prime revés ligam o próprio para revés pior não pior mas tanto enquanto um primeiro ford se dobrando e se ligando Nele mesmo é isso que vou falar agora essas três situações elas são ruins porque essa estrutura dupla fita essa estrutura secundária que um primer se ligando com ele mesmo há um outro primer gera ela pode atrapalhar só percebe isso depende do que de com forte é essa estrutura secundária que foi formada pela ligação de praia

com o primeiro prémio com outro primeiro um rap um time ligado nele mesmo O conforte essa estrutura dupla fita e foi formado ali ou seja com essa habilidade dessa estrutura dupla fita ou seja coque atm a temperatura de melt dessa estrutura dupla fita que foi formado ali então nós vamos criar condições hoje nós vamos estabelecer parâmetros na hora de desenhar nosso primeiro para evitar que essas estruturas secundárias aconteçam e se elas acontecerem porque às vezes é muito difícil é muito difícil evitar que elas Aconteçam a gente vai criar estruturas do paf estrutura secundárias fracas fraca

de tal maneira que elas não chega a atrapalhar a nossa reação de serra então a primeira possibilidade é um primeiro ford se ligando ao prime reversa olha só esse meu primo é forte aqui é um exemplo hipotético ele só tem cinco núcleos né e não vai trabalhar consigo no clube e trabalhar com 18 22 25 é ele encontrou complementariedade a uma Outra extremidade do meu primo reversa ele ligou aqui informou estrutura dupla fita isso aqui pode atrapalhar minha razão de pcr em si essa essa ligação que foi muito forte ou mais forte do que deveria

um primeiro ford ele pode ligar ele mesmo há um outro prêmio ford um revés ligar um outro revés que no caso encontrou complementariedade ponto aqui nessas duas nucleotídeos ele foi uma estrutura do planeta mesmo Que aqui nessa ponta não tem ligação aqui tem isso aqui pode ser forte o suficiente para atrapalhar a reação de pcs atingiu números entre pares diferentes gêneros entre prémios iguais é um problema então você não paga a maior razão é pra ficar fácil de entender um primo ele pode se dobrar encontrar complementaridade com ele mesmo formando rappin hood aqui ó aqui

esses e ele pode ser complementar a esse g E esse texto é complementar a esse a ele pode dobrar lá em temperaturas baixas antes da reação aconteceu em algum momento da reação e reformar sua estrutura é chamada de rappin que é um grupo de cabelo tá então suas estruturas de dna dupla fita formada pelos problemas que podem atrapalhar a reação do pr durante o processo de desenho que vai tentar evitar isso aqui se não for possível evitar isso a gente vai fazer com que as Ligações sejam pelo menos fracas e agora sim vamos para a

prática é aqui que a gente vai começar a nossa aula prática a aula prática está dividida aqui em seis momentos 5 é porque esse último aqui a gente vai fazer na bancada nós vamos fazer a gente vai voltar a mostrar as contas para vocês mas a aula prática então a gente vai dividir em cinco passos a gente vai descobrir onde encontrar uma seqüencial onde você vai encontrar a sua Seqüencial para você trabalhar nós vamos descobrir se essa seqüência alvo ela tem regiões conservadas que a gente quer nesse caso aqui trabalhar com regiões conservadas para ter

uma chance de um prédio auxiliar de maneira específica nós vamos desenhar os primers propriamente dito ou ferramenta de desenho do prime e hoje a gente vai usar o primer 3 plus que é uma das ferramentas online gratuita mais Utilizados no mundo existem outras muito boa também mas a gente vai usar o time depois vai fazer uma avaliação em cirílico utiliza no blast depois uma outra variação uma validação ensino utilizam a net praia pra verificar junto da estrutura secundárias e quais são e depois vou falar pra vocês como vocês vão comprar que como qual método de

de purificação do prêmio você pode utilizar é quais são as lições que você tem que fazer para trabalhar no laboratório Algumas coisas nesse sentido vamos começar conseqüência alvo a deus foi uma coisa antes eu fazia esses cinco e seis passos com vocês só que a primeira vez que eu vou fazer isso algumas vezes está a seguir essa ordem que algumas vezes a primeira vez que eu vou fazer eu vou direto ao ponto nós vamos pegar uma seqüência alvo e desenhar a praga tá vamos pegar a seqüencial vilar direto para o próximo passo 3 quer desenhar

primers sem firula Vão fazer isso a maneira mais grosseira maneira mais simples que dá para fazer depois a gente volta e faz esses todos os espaços de novo só que agora considerando alguns aspectos que a gente não tinha considerado antes está a fazer essa primeira pra vocês têm uma noção do todo do que o mais importante que é o mais a informação mais grosseira que você precisa para depois e refinando aos poucos como desenhar um primer mais adequadamente então vamos começar com a Seqüência alvo é eu vou mandar na descrição do vídeo eu estou colocando

esses links úteis que eu mostrei aqui pra vocês são os links que eu vou acessar as ferramentas hoje a gente encontrar a nossa seqüência a gente vai usar esse banco de dados aquinense biai que o ref séc uma sessão leve saque o f7 é um banco de dados as pessoas que descobrem sequenciam elas de alguma maneira chegam a uma sequência específica de dna pela primeira vez Segunda vez quando ela sequenciam fanning dna de um organismo elas podem disponibilizar essa sequência elas descobriram um banco de dados público e elas podem fazer isso através do mma e

por exemplo podem enviar a sequência delas para esse banco de dados e esse banco de dados vai obter essa informação ele pode curar informação não pode validar aquela a informação de seqüenciamento ela foi uma informação da sequência que está sendo Mostrado ali e disponibilizar em outros bancos de dados mais refinados que ela está utilizando aqui é o chef séc o refis é que ele é um banco de dados é bem abrangente e integrado um com informações não redundantes e superbem anotados anotado quer dizer que ele foi é o processo de sequenciamento de um processo de

validação de curadoria essa informação é bem composta de várias sequências genéticas incluindo sequência genômica transcritos e até proteínas se A sua seqüência alvo não foi você que descobriu não foi você que sequenciou não foi você que encontrou ela pela primeira vez você pode encontrar essa informação do banco de dados com mais que emocionante pra você vamos supor aqui no meu caso hoje a gente vai utilizar um gene como exemplo que é hoje a pdh utilizam japhet h&h de humanos vai trabalhar com essa sequência de humanos que a informação ali era bem mais é facilmente disponível

e vai Trabalhar com esse gene ea gente vai lá todo ao longo de toda a prática de batidas utilizar esse gene mas se fosse o caso aqui por exemplo você poderia colocar o seu fragmento ao seu genial porque você poderia usar o seu genial porque se você quisesse trabalhar com qualquer outro jeito qualquer outra espécie se ela tiver disponível no banco de dados você pode encontrar então vou dar o inter aqui e aqui a gente recebe esse Resultado do dia a pph vão dar uma olhada então rapidinho sobre essa página que abriu em não vou

falar em detalhes hoje sobre iniciais sobre esse banco de dados porque não é o foco mas eu falar algumas coisas importantes aqui algumas informações sobre o gênero de um resumão sobre higiene eu já perdi a audiência geral de do 3 fato de andré 13 desidrogenase é um gênio muito utilizado como é referência ou como candidato a agente referência em Análise pcr em tempo real pra expressão gênica para a quantificação de expressão gênica e não usa ele aqui porque ele é um gênio bem conhecido pra isso que tal já perea é o nome dele aqui a

gente tem os resultados que nós encontramos por espécies em animais foram 13 trinta e nove por plantas 19 o fungo não por espécie né nesse aqui pô las em redes que se aí os tipos de moléculas nós temos dna Genômico de r há também a gente pode selecionar em o mensageiro é não codificante transportador ribossomal aqui hoje no caso a gente vai trabalhar com dna genome aqui desse outro lado nós temos as espécies aqui sim por espécie encontrou sete resultados para rattus norvegicus em cinco resultados bbc árabe dops italiana e assim por diante o que

interessa são os quatro resultados e almoçaradas de humanos que no meu caso aqui um exemplo você fica com uma então Vou clicar nesta opção e aqui ele vai mostrar os quatro resultados pra gerar pbh que ele encontrou e aqui a gente tem que tomar um pouco de cuidado pra trabalhar com a seqüência mais indicada para o que você quer fazer porque ele está mostrando que a seqüência do gene que é o que todos cumprindo o que eu quero eu quero utilizar mas ele está utilizando aqui a seqüência está mostrando também a seqüência do cromossomo 12

a sequência Completa do cromossomo 12 aos 1 133 milhões de pares de base não é isso que eu quero que era um gênio só tem 10.880 para de base aqui ele está mostrando pseudogenes desse gene também não é nada disso que eu quero eu quero estudar aqui ó eu quero essa primeira então tem que ter um conhecimento é pelo menos básicos sobre a seqüência a gente quer trabalhar o tamanho do jeito certo mas se você quiser ter uma idéia do que Esse fragmento é que em seqüência é essa daqui esse número de acesso ele pode

ajudar tá vendo esse n gêmeos você é um código se você quiser saber o que significa esse código você pode utilizar esse segundo link útil aqui ó que vai te mostrar o que significa cada um dos códigos havendo então o ng na que estão mostrando é uma região incompleta incompleta porque porque eu tô pegando um gênio inteiro não pegando um Cromossomo inteiro de voltar aqui e olhar o cromossoma o cromossoma ienes e o nc é uma região completa então selecionar que o primeiro que é o que a gente quer quando a gente seleciona que o

primeiro ele vai mandar gente para essa página com vários detalhes sobre essa seqüência então ele vai mostrar aqui pra mim o óculos não tem aquele código tamanho dele dna a definição que é esse gênio nome dele O número de acesso à versão que essa sequência está disponibilizado no banco de dados as palavras chaves qualquer fonte qualquer organismo qual o autor que sequenciou isso aqui descobriu se essa sequência é aonde foi publicado tem um monte de informação sobre isso resumo sobre o gene e algumas características aqui sobre uma remixagem você consegue encontrar aqui um monte de

outras coisas a sequência da proteína também nessa Questão a seqüência de aminoácidos na proteína ele gera e aí vai mas aqui em baixo nós temos a seqüência que é o que me interessa é que tem aqueles 10 mil e 800 pares de base que é o que eu quero trabalhar imagine que eu quero fazer a pcr de algum lugar de algum fragmento dentro desse meu alvo aqui eu quero fazer presente em um alvo que está aqui dentro eu vou trabalhar com ele consiga seqüência eu posso entrar aqui ó afasta Ele vai disponibilizar vai disponibilizar seqüência

nesse formato que é chamado de fascista que tem esse cabeçalho com os cabeçalhos símbolo de maior e aí uma descrição em seguida ea sequência todo embaixo a gente vai fazer aqui é copiar essa sequência é um control c mesmo em casa pode salvar sequência também a gente vai copiar o que interessa a gente hoje e é isso aqui essa seqüência de nucléotidos que a Gente vai utilizá-la no nosso software de desenho de praia é isso que a gente vai fazer certo voltar aqui na apresentação um pouquinho então o que a gente fez até agora foi

pegar a nossa seqüência ao e agora nós vamos pular etapas nesse passo 2 aqui a gente vai pular espaço dois ea gente vai lá para o desenho de primer diretamente tá bom e depois a gente volta e faz todos os espaços de incubação de cal Então está que copiamos essa seqüência a gente encontrou no nosso banco de dados essa uma fonte dos seus da sua sequência pode ser qualquer lugar eu mostrei uma maneira que é uma maneira mais usual e confiável também é vamos pelos nossos links úteis ea gente vai lá para o primer três

primeiros três têm essa cara aqui ele ele tem um monte de coisa mas não é difícil de usar se você entender as coisas que vou explicar hoje pra vocês vão desenhar primer com mais Treino a primeira coisa teske a gente tem que selecionar nós vamos fazer o genérico tá porque a gente não quer primeiro para a clonagem hoje a gente não quer primeiro seqüenciamento a gente quer para pc é quando charlie genérico gente troca que essas é é esse teste ele vai mudar alguns parâmetros que não são os podem nos seus mais leais para a

pcr então aqui nós vamos fazer aula monstra de primers o nome da nossa seqüência é Que a gente vai simplesmente dá um control v colar que se conhece a gente copia lá em cima você se você tivesse salvo sequência no seu computador você poderia escolher um arquivo aqui ó vai escolher o arquivo no seu computador em formato rasta e fazer o upload depois mas você pode acontecer controle e lê então essa é a primeira coisa pura isso aqui por enquanto a gente vai fazer isso aqui já já a gente vai pular essa parte aqui por

enquanto Se você fez isso aqui já colocou sua sequência você poderia já da ump primers pico primas mas a gente não vai fazer isso agora nós vamos ajustar alguns parâmetros eu vou mostrar alguns parâmetros importantes para vocês de desenho de praia pra pcr volta aqui na apresentação são esses parâmetros aqui que a gente tem que considerar para fazer o desenho pra praia mesmo a gente lembra que foi pra vocês nosso objetivo é fazer com que Os primers eles liguem de maneira específica e eficiente as extremidades do álbum que eu quero amplificar então todos esses parâmetros

que estou colocando aqui pra vocês eles são no final das contas para que você consiga esses dois objetivos que lhe ensine as extremidades manual de maneira específica e eficiente a primeira coisa tamanho os primeiros eles não podem ser muito Pequenininhos eles não podem ser campeões eles são muito pequenininhas você aumenta a probabilidade dele se ligar em regiões não especificadas tipo 67 nucleotídeos e aumenta a probabilidade de se ligar em regiões não especificadas se você tem fragmentos muito grandes você também aumenta ligar pra ele deve se ligar em regiões não especificadas mas não é por conta

de probabilidade é porque ele é tão grande que ele pode se Ligar um pedacinho dele um pedaço do dna fazer uma uma barriga onde não se nenhum outro pedacinho pequeno uma outra extremidade no outro um outro pedaço do dna então ele consegue se ligar a linha de uma maneira específica totalmente bagunçada que não é o que a gente quer então a gente tem que trabalhar por volta de 18 a 25 no rio tinto está um pouco mais se você precisar depende da aplicação quantidade de guanina e Citosina a gente tem que manter uma proporção ali

de goiânia citosina em relação à admite mina entre 40 e 60 por cento mais ou menos porque porque se você aumenta muito a quantidade de bonilha de mina ou se aumentar muito a temperatura the melt consequentemente aumentar muito a temperatura de armazenamento se isso acontece você trabalha contra tem pratos the melting muito alta ou temperatura de rolamento muito alta você tem maior chance do Primeiro ligar de maneira específica blow da reação de pcr a temperatura the melt do nosso primeiro ela vai ter que ficar por volta de 57 63 graus dá pra ser um pouco

menos um pouco mais isso mas aqui é uma faixa mais ou menos igual à temperatura de mel de funcionar bem e muito importante os primers você vai desenhar aqui no caso dois prêmios cada um dos seus prémios vai ser ter a sua temperatura de immelt específica ea sua temperatura de Anelamento específica só que a temperatura de melt entre os seus pares de primers você vai utilizar uma mesma reação de pcr ela não pode ser diferente não pode ter uma temperatura de immelt de 65 graus para baa1 prime por ford e de 50 para o seu

reverso não pode porque não é que você vai ajustar reação de pcr a um passo 2 que lamento que temperatura você colocaria ali com essa diferença muito grande então você perde eficiência Estiverem temperatura de mount muito distantes uma da outra então trabalhar com uma diferença de mais ou menos no máximo na verdade cinco graus entre os seus primos repetições você não quer primers que tenham vários núcleos ativos iguais em seguida tipos aqui há há há vários azul vários tesouros de todos juntos e isso atrapalha também no momento da ligação com o seu alvo e gt

gt deus e tse tst repetição de 2 mil títulos iguais também não é interessante Não só evitar essas repetições e 5º 5º quinto parâmetro aqui estrutura secundárias vão trabalhar para evitar as estruturas secundárias quem vai fazer isso pra gente é o software vai estabelecer parâmetros no software que ele vai desenhar primas que não contenham a estrutura secundária ou que tem uns outros secundários muito fracas tamanho do produto você não quer um produto muito grande também um produto muito grande assim de 10 mil pares de Bases e não vai fazer uma série de produtos acima de

10 mil pares de base que é difícil qualificar se perde eficiência da reação de pcr um fragmento muito grandes é possível fazer é conseguir fazer mais fica cada vez mais difícil com quanto maior o fragmento mais difícil para muitos pequenos a fazer não fazer talvez se tem problema para analisar depois eletroforese mas em relação à pcr funciona muito bem pra muitos pequenos então aí pra nosso Exemplo aqui vão ficar entre 510 mil pares de base que é um básico região do alvo que ele tomar cuidado também com seu alvo sem considerar informações do álbum também

nesse processo porque porque às vezes você tem um alvo que tem uma região difícil amplificados acontece nem toda nem todo o fragmento de dna vai ser amplificado vai sofrer segue com a mesma eficiência tem direção mais difíceis mesmo amplificar talvez o conteúdo de gc talvez por região Repetitiva não importa mais importa que tem que tomar cuidado a região que você vai escolher mais importante que isso tem que tomar cuidado se você não tem aquela região que você quer amplificar ela duplicado ou triplicado ou copiado em outras regiões do genoma por que isso acontece por exemplo

os pseudogenes são fragmentos são genes não funcionais imagine se eu vou pegar um aqui tem o Habitat na a ctb aberta a china é um gênio que tem vários os seus genes ao longo do genoma não têm o gene e funcional que gera proteína que é o que vai gerar proteína de fato lá depois da expressão do gene mas existem outras regiões com aquela mesma sequência daquele mesmo gene espalhado ao longo do genoma que não é funcional que não gera uma proteína mas ela estava presente se você desenha um primer que vai vai implicar justamente

uma região que é Comum ao genial e aos pseudogenes dele se vai aplicar coisa que não interessa eventualmente então considerar qual região que você está amplificando isso depende caso a caso os eleitores tutu você vai ter que estudar a sua auto você vai ter que estudar o seu fragmento é que você quer ficar pra você ter essas informações e evitar essas regiões repetitivas ao longo do genoma e depois você tem que considerar também as modificações dos tipos de purificação Que você vai fazer do primer as modificações eu falar na frente no caso da pcr que

a gente vai trabalhar pouco modificação basicamente nenhuma mas você pode é adicionar no seu primeiro álbum flor off por exemplo se você precisar detectar se esse primeiro mês a ou pode ser uma sonda se você precisa detectar esse primeiro de alguma maneira por alguma situação você pode adicionar um flor off ou você Pode acionar uma botina que parece ligar mais tempo david é um processo de purificação a modificações que você pode fazer assim mas há companhias permitem que você faça isso elas elas disponibilizam esse tipo de serviço aqui no caso a gente não vai fazer

nenhuma modificação ele vai só comentar sobre primer degenerado o primeiro que eles têm mais uma seqüência daqui a pouco fala sobre isso a gente precisa olhar agora e Depois as purificações é como você purifica o a companhia o seu fornecedor vai purificar seu primo e depois que ele for sintetizado já falamos também tentam seguir considera essas espécies 8 a 18 aspectos aí a gente vai jogar isso lá no nosso software agora vamos voltar aqui então o primeiro 3 que a gente fez até agora foi jogar nossa seqüência aqui e nada mais já colocou o nome

da nossa seqüência que Ela mostra de primers e aqui nós vamos fazer os ajustes gerais primeiro o tamanho do seu produto qual é o tamanho do seu fragmento que você quer gerar qualquer produto a mãe do produto da pcr daquele deixou várias opções só os produtos disponíveis aquino de fogo para 63 é fragmentos de 500 e um par de base a 600 então se você quiser fragmentos de 501 a 600 você coloca entre um traço 600 espaço Aí você coloca a outra possibilidade de 601 700 espaço 401 a 500 em todas as possibilidades que a

gente vai fazer aqui então ó paga tudo pode deixar de fosse você quiser mas só que pra vocês verem a gente vai querer de 510 mil a gente colocou lá num é o máximo que a gente quer se você quiser trabalhar com fragmentos menores é recomendado tamil 2001 deixar de 10 mil pra gente desenha em alte depois a gente vai estabelecer qual é o Tamanho do nosso kaymer qual é o mínimo que a gente aceita ter um mínimo de 18 qual é o máximo que a gente aceita ter 27 um bom passar para 25 aqui

se você é software para 63 queridão conseguir fazer um de 20 melhor é isso que está falando pra ele coke atm a temperatura de mel dos nossos prêmios vão trabalhar aqui nosso caso entre 57 e 63 que eu tinha colocado que na aula eu tinha colocado é de 57 63 beleza é igual então vamos voltar aqui 5763 cridão se você conseguir 60 melhor tá aí ele pergunta que qualquer diferença máxima de tema entre os primers acta central não será ou não deixar suas 55 gramas não quero problemas muito diferentes um do outro não consigo fazer

pensar e depois quantidade de gc a gente falou que ia trabalhar entre 40 e 60 não quero muito mais que isso não se achar 50 melhor agora agora pra atenção porque isso aqui são Condições da reação de pcs aqui esses primeiros são as condições de desenho do primeiro aqui em baixo são as condições de pensar que ele vai fazer lá na frente ea gente vai informar isso aqui para o software porque porque as condições de pcr basicamente a concentração de sal entre outras coisas a concentração de sal que você tem na sua reação ela também

vai influenciar na tm dos seus primeiros porque não basta a estrutura do primeiro Tamanho quantidade de gc mas a quantidade de sal a pressão osmótica que você tem na sua reação também porque se fosse uma certa concentração você tende a manter esse dna mas separados tiver uma outra concessão você tende a manter-se em armas junto tende a gerar fita simples e tende a gerar fita dupla isso está relacionado à concentração de sal na reação também mas talvez você não saiba agora talvez você não tenha essas Informações agora na sua reação se você tiver se você

souber essas condições essas concentrações você alimenta essa informação que se nato no software se você não tiver você deixando de fumar ou não mexe então quais são as condições e está falando aqui na concentração de cátions monovalente a concentração de cátions de valente cássio nuno valente é clicar tá lá na solução tampão o kart onde valente é o que você vai Colocar o cloreto de magnésio provavelmente pra que é o fator da dna polimerase qual é a concentração de nt ps que você vai utilizar na sua reação e depois a gente fala dessa concentração de

anel de óleos aneladas tá então vamos aqui primeiro se você não tiver nenhuma das informações deixando fosse você tiver você coloca aqui ai como eu sei isso aqui onde eu vou encontrar você pode pegar o seu master mix o máximo você comprou mas trimix que você Pretende comprar ou a solução tão que você pretende comprar utilizar ou seja a enzima que você pretende comprar óleo protocolo óleo datasheet nessa nesse semestre mix oudeh solução tampão da sua enzima e lá vai ter essa informação eu peguei eu peguei um protocolo aqui na internet o protocolo aleatório de

dna polimerase e dois pra você estar molhada então a concentração de íons de caixas monovalentes e concentração de cátions De valente estamos a olhar daqui nesse protocolo se você quiser essas informações você pode buscar no protocolo da tashi do seu fornecedor tá bom então a gente pode ver que nós temos on começar um curso de magnésio no kit né nesse kit aqui de dna polimerase vem como magnésio 25.000 imolar 25 mínimo lá na reação você pode colocar diferentes quantidades entre 1 a 4 mínimo lar e aí você vai escolher o quanto vai colocar aqui de

acordo com a Tabelinha o que importa é isso que vai ficar em uma faixa entre 1 e 4 mínimo lar gente olhar aqui então para cá tínhamos de valentes está 1.5 mínimo lar eu sei que é mínimo lá que se você clicar aqui está selecionado se você clicar aliás qualquer um desses aqui são links se você clicar abrir outra aba você vai ser direcionado para a explicação da cni longe do que você clicou então está falando dos ianques de Valentes e ele está falando que é mínimo lá tá bom vamos fechar aqui então aqui está

um ponto 5 é de acordo com o que você for fazer a sua pcr você poderia trocar livrar da quantidade que você precisa e de íons de valentes no caso de monovalente que ele está a 50 enquanto que ele tinha o ponto que ele tinha aqui ó então a gente vem aqui no master mix do buffet se você olhar aqui um tampão ele tem uma Quantidade de 500.000 imolar de kcl que a união de valor o iron monovalente 500 tá só que esse master mix aqui ou esse mix ou o tampão pelo menos evitar dez

vezes quando você colocar na reação ele vai ficar uma vez só então ele vai passar de 500 mínimo lar para 50 mínimo lá essa vai ser a concentração final dele aqui é aqui já está 50 então aquele tal de fusão é o que se utiliza geralmente nas reações tá tranquilo que eu falei também que vocês não precisam Me mexer muito e é a concentração 12 de limpeza que está a 0.6 só uma olhada aqui de ntp você vai colocar a 0 dois de cada um você pode trocá lá se quiser boy por último nós temos

esse daqui ó que a concentração dos olhos aneladas então aqui não é a concentração de óleos que você vai utilizar nossa reação é a concentração do prime que será utilizado a sua reação é a concentração dos olhos amarelados Então a minha comunicação para você neste momento é deixar como de fogo certo então aqui voltando colocamos a sequência aqui só isso arrumamos alguns ajustamos alguns parâmetros de temperatura tamanho do primeiro e semtran e agora feito isso primers e aqui está o resultado então aqui para o seu primeiro set de praia no seu conjunto o primeiro par

de primers para a aula moça de primers nós temos um rostinho que azul o primeiro left ou o Primeiro ford e o powerlite ou o reverse então aqui é a sequência que ele disponibilizou de acordo com todos aqueles todos aqueles parâmetros que a gente pra estabeleceu ele chegou à conclusão que essa sequência aqui é a sequência criou as duas melhores vão dar uma olhada aqui um pouco mais sobre eles o primeiro esquerdo ou ford ele começa na posição 966 quer dizer que ele vai começar nucleotídeo 966 olha só que vocês conseguem ver essa Nossa seqüência

aqui em baixo na sequência esse nucleotídeo é o núcleo de número 1 aqui é o núcleo de número 51 aqui o 101 assim por diante e aqui nós temos só esse é o 151 se você for contando na você vai chegar nesse daqui que é o 966 então ele começa 966 no total ele tem 20 nucleotídeos aqui nós somos 20 mil títulos ele tem uma tm de 60 graus temperatura de menos 60 graus sua constituição 55% é dgc ele E que é esse enem que é qualquer estrutura secundária que ele possa formato não faz ele

não forma estrutura secundária com ele mesmo ou com outras praias não fomos a secundária eça aqui a estrutura secundária na extremidade 3 linha como ele não faz nenhuma estrutura secundária na extremidade três nem ele também não faz nenhuma estrutura secundária mas essa aqui especificamente é importante ficar de olho porque como ela na extremidade 3 linha é a partir da Extremidade 3 linha que a dna polimerase ela começa a funcionar nucleotídeos então se essa extremidade aqui ela tivesse outra secundária em ficar esperto a gente pode perder eficiência da reação de pc então mais especificamente tem que

ficar de olho tá se como é que ficou torcendo na área que não tem nada e se tb aqui é a ligação é o brinde em qualquer região não específica do template então ele tem uma certa chance Dele se ligar aí fora do template esse número 12 pesar diante de uma referência um valor baixo para essa ligação específica é baixo porque o parma e três vezes em vários parâmetros de desenho de praia ele considera a possibilidade do primer selar em regiões não especifica se esse mauro que fosse autossuficiente o prêmio e 3 ele não ia

desenhar eliminadas em seu primeiro ele falar se não encontrasse uma região dentro da seqüência a gente colocou aqui Que atendesse todos aqueles parâmetros que a gente pra estabeleceu ele ia falar não conseguiu desenhar praia pra você do jeito que você pediu ou você afrouxa e os seus parâmetros você seja mais leviano um dizer assim você jamais leviana e com os parâmetros que você colocou ou você procura uma outra sequência ou não desenhar primer essa seqüência mas do jeito que estabeleci um jeito que você estabelecer os parâmetros não Conseguiu desenhar então se esse número se essa

ligação e fora do nosso template principal fora do nosso alvo principal ela fosse forte ele não ia desenhar primeira linha hp significa repitam estrutura secundária o primer selando nele mesmo ele dá um valor daqui de estabilidade do 3 linha e se essa estabilidade ela tem que ser boa lembra porque a partir da assinatura linha que a polêmica frase vai começar a cena nucleotídeo ela vai Dos 5 litro 3 linha então assinar três mil vai ser a ela ela tem canelada todo jeito a 5 linha até pode ter uma porção de zanella dali uma porção que

não seja complementar o alvo especificamente solução detalhes mas a 3613 não tem que ser bem feito e ele dá um valor de penalidade 1 é um score de uma pontuação que lhe dá pra esse primeiro que você desenho quanto menor esse valor melhor e também aqui a gente tem um valor que a gente não tem uma referência é alto ou Baixo mas de novo se o primer 3 desenhou com aqueles paramos que a gente estabeleceu ele é um bom primeiro não tem um valor baixo de penalidade ea mesma coisa e para o outro primo ele

começa lá na posição 7 mil e 22/20 nucleotídeos manteve igual à do outro primo é contínuo disse também que aqui não fontes outra secundária todo bonitinho do jeito que a gente queria então esse aqui ó o primeiro ford está aqui O prime reversa lá embaixo então a pcr seria a gente fizesse pcr seria de se fragmentam aqui nessa estrutura toda certo o que se faz aqui desde o primeiro agora se você quiser fazer o pedido de saque provavelmente muito novamente se parte para que a funcionar na sua reação a alibem é muito provável que ele

funcione na sua reação sem nenhum outro ajuste só do jeito que a gente fez o dele o uac o basicão já a funcionária que Você a fazer se a copiar essa seqüência que o primeiro ford essa outra sequência do plano de reverse colar aí no word e a 1 ou no e mail no corpo do e-mail na ferramenta de compra do dos seus olhos e comecei a pedir seu fornecedor exatamente como está aqui ao prêmio ford tenha sequência desenho aqui pra mim e pra mim universo tenha seqüência nem isso aqui pra mim é isso que

você a fazer constrói isso que vou precisar Usar beleza e estamos aqui eu queria fazer o basicão primeiro pra vocês verem que não é um negócio tão complicado mas agora vamos refinar um pouco isso que a gente acabou de fazer um trabalho um pouco mais detalhe que vou fechar o 1º 3 vou fechar a tabela quem já utilizou e ganhou feijão vamos lá então que a gente está fazendo aqui vão retomar o raciocínio é então nós falamos que iríamos seguir essa ordem não seqüencial gente já buscou a Eu pulei região conservado em dezembro pra mim

e fiz nada disso aqui que eu falei que ia fazendo a gente fez aqui seqüencial desde o primeiro ponto então fazer agora com calma é um desenho vão pegar seqüencial de novo vamos aqui nossos links úteis colocar aqui de novo g a pdh selecionar nem precisa selecionar humano ali porque esse daqui já a nossa seqüência afasta e aqui está o que a gente precisa ainda ser que a gente vai copiar de novo só Que é o seguinte algumas pessoas ao lance talvez seja a sua situação aí você tenha várias versões do seu da sua sequencial

por alguma razão não importa porque algumas pessoas elas seqüenciaram alvo delas pela primeira vez elas têm vários resultados do seqüenciamento por exemplo ela quer fazer uma pcr daquele daquele resultado seqüenciamento ou o banco de dados possui várias versões daquele alvo daquela sequência por alguma razão você Tem diferentes versões daquele seu fragmento alvo onde você vai desenhar os primers cê vai desenhar os primos naquelas regiões naquelas regiões que elas são iguais na maioria da sua sequência na maioria das versões a sua seqüência então se você tiver duas versões por exemplo você vai desenhar um primer onde

não tem variação de nucléotidos nessas suas duas versões Tá existe um software existe um algoritmo online que a gente vai utilizar que é bem simples para você saber quais são as regiões que são mais conservadas entre as quais são as regiões que não têm variação entre os seus alvos entre as suas versões de alvo então vou mostrar pra vocês então imaginar que eu vou copiar um pedaço não fazer uma sequência muito grande pra não vão demorar muito lá nesse software o copiar esse pedaço aqui ó Copiei control c vamos na nossa lista de links úteis

vamos aqui para o aqui ó gostou ômega é no clássico ômega que vocês vão fazer a seguir esses passos primeiro a gente troca de proteína pra dna porque nossa seqüência de dna a gente vai colocar duas seqüências que muitos porque ele tem duas versões do nosso alvo aí você vai colocar esse símbolo escrever sequenciar 1 e colou aí que você vai fazer você vai lá no seu nós no Seu na outra sequência na outra versão do seu alvo e copia do mesmo jeito que a gente fez com a primeira e copia só ter vindo aqui

na primeira vez eu peguei aqui um fragmento x dela que no começo agora tô pegando um outro alimento que tem uma parte que vai sobrepor ali como se fosse a região conservada do meu alvo e aí eu venho aqui embaixo e coloco a seqüência 2 e joga aqui segundo passo você vai selecionar que Tipo de parâmetro de anelamento que ele vai fazer no méxico nada que a gente precisa mexer em nada agora e submete espera um pouco dependendo do tamanho do fragmento essa análise pode demorar e dependendo do medicamento ou da conexão internet vai ser

rápido vamos ver quanto tempo a nossa pronta não demorou muito a quem é bons 15 segundos apesar de ter cortado o vídeo aí é levar 15 segundos né e aí você vai ver aqui ó seqüência uma Seqüência dois quando eu peguei as suas sequências na seqüência dois eu não peguei o começo dá seqüência a uma entrevita vendo um processo de alinhamento que ele fez aqui ó nada bate porque não existe né eu peguei um pedaço que sobrepunha só que agora que chegou um momento que se sobrepunham ele vai colocando aqui nessa parte sobrepõe tudo isso

que ele está mostrando que teve sobre a posição só que temos sobreposição tudo bonitinho Então se você fosse desenhar seu crime para diferentes seqüências de um determinado alvo você não ia pegar essa parte aqui porque ela não elas não são iguais elas não têm vez das versões diferentes elas não anima elas têm consequências diferentes então não faz sentido você desenhar um primeiro aqui porque o primeiro você pode estar dizendo um primer e quando você for amplificar vai que você amplifica um fragmento que não tem isso Aqui porque não tem não sei não importa agora mas

o que vai fazer a trabalhar nas regiões que com certeza tem que é que você pode fazer baixar esse arquivo aqui e selecionar somente o fragmento que te interessa né ou você pode uma das suas sequências lá e utilizar só aquela porção que interessa tá bom então aí a gente fez aquele segundo passo que é identificar as Regiões mais conservadas e você garante quando você for fazer só pessoa é como se for desenhar seu primeiro você não vai dizer ao pai uma região que pode não amplificar por não existir ou por alguma razão a a

ser diferente do seu alvo na sua mostra mesmo na hora de fazer a pf então como ficamos fizemos encontramos a seqüência do alfa identificando os identificamos as regiões conservadas ea gente vai desenhar prime que a gente já fez uma vez vão fazer de novo agora com Algumas pequenas modificações vão copiar nossa conhece aqui na verdade a gente não vai fazer com modificação não em que só vai dar uma olhada com mais cuidado lá no primeiro 3 vamos aqui em abril para 6 3 aí de novo então a gente vai deixar aquino deixou o generic é

vamos colocar aqui a aula moça de primers cola a nossa seqüência alvo ou abre o arquivo ponto fasta e agora a gente vai olhar preciso aqui que a gente passou reto da última Vez olha só a gente pode pegar seqüencial e eventualmente tenha uma região que não interessa por exemplo aquela região que a gente acabou de olhar link não era conservada é a região que a gente não quer desenhar praia vamos supor que a região que a gente não quer desenhar praia porque sabe que essa região não é conservada tá aqui ó sp da ação

aqui ó nesse pedaço são aqui não me interessa o Que eu posso fazer que eu posso simplesmente selecionar região que não me interessa e clicar nesse botão coloquei quando eu faço isso ele colocou o sinal aumentar disse que vai ficar mais fácil de ver a cne colocou o sinal de menor aquele colocou o sinal de maior então o primeiro três não vai desenhar prime aqui na sequência e não vai utilizar essa seqüência aqui a gente pode fazer o inverso aqui a gente quer selecionar uma região que o primata que Está ali em algum lugar onde

pode pegar por exemplo aqui no meio se esse pedaço aqui o primeiro item que está dentro dessa região aqui por alguma razão se a gente quiser fazer isso é só usar o incluir região que é este botão aqui então a gente vai incluir um a região com com a abres chave e fecha a chave lá embaixo um outro botão que tem também é quando a gente precisa que um dos primeiros qualquer um dos prêmios um ford reverse Ele precisa estar nessa região tão a gente quando seleciona e se um fragmento e aperta este botão ok

de colchetes quem está falando que o primeiro três filmes selecionei está falando o seguinte ó premier 3 meu primeiro ford ou meu pai me reverse ele tem que ir além dessa região o outro para apostar em qualquer outro lugar mais um ford ou reverse tem que estar aqui dentro e essa última opção aqui é quando você precisa é de terminar com mais Especificidade onde vai ficar o primeiro ford ou onde vai ficar o primeiro verso é você vai colocar é uma recomendação entre o sinal de maior e menor e falar onde o primeiro ford deve

começar onde o primer reverso deve começar então informações um pouco mais específicos lembrando se você tiver dúvida em qualquer um desses aqui ou coloca o mouse em cima que lhe dar um resumo do que é ou clica nele só que um link ele vai te jogar numa explicação mais Detalhada certo então é isso aí vão a pagar só que eu fiz foi dar sequência aqui de novo jogar aqui de novo porque eu não quero de limitar nada nesse momento general settings a gente vai deixar do jeito que a gente fez outra vez vão criar aqui

um fragmento aí vai ter que sem querer de volta a gente vai criar um fragmento de 500 a mil ou 10 mil né nesse caso aqui com 10 mil e aí o tamanho mínimo 18 ótimo 20 o máximo vão Tocar aqui para 25 a pm atm 57 63 tá certo cuidado ágeis e vamos tocar aqui pra 40 por cento e cinquenta e sessenta por cento é isso aí concentração que a gente não vai mexer a gente não sabe que que a gente vai usar ainda qual de apolinário não sabe nada disso é essa que é

uma biblioteca de regiões repetitivas onde o primer ele pode ser online especificamente então você pode carregar essa informação coloca ainda a Informação de um ano e que a gente sabe o algoritmo sabe ele tenha esse banco de dados vai falar que não pode revelar essas regiões repetitivas onde a gente sabe que os fãs não está nela de maneira adequada então em caso que a gente tem a informação de um ano outros organismos também então a gente vai colocar de um ano aqui sabe dá pra fazer aqui também depois que você estabelecer os parâmetros e você

vai querer Provavelmente usar sempre o cinto ou os parâmetros muito parecido com as suas pcr para as suas reacções você pode salvar essa configuração você salvar sozinha em sauá seis sites ele vai baixar um arquivo eu acho que é um ponto txt isso ele aponta xt e se você pra você não tem que configurar o primeiro registrou toda vez que você for fazer um desenho de primer você pode depois é carregar esses ajustes que você fez carregando esse Arquivo como peixes e lá para salvar também é agora a gente vai que para os ajustes avançado

só tem bastante coisa mas não é difícil tem bastante coisa aqui mas não é vai ficar dentro daquilo que eu expliquei pra vocês até agora na teoria população outros ajustes mais avançados que se você não quiser mexer provavelmente vai funcionar na verdade é que esses ajustes eles já vêm num padrão que funciona para a grande maioria das Vezes para guga maioria dos casos mas se você tiver um caso específico uma região específica uma situação específica aí você pode vir aqui e ela está de acordo com sua necessidade vamos dar uma olhada aqui ó quantidade máxima

de polly alguma coisa então repetições de nucleotídeo então o prime aqui o deixou o dele no primeiro 3 está falando que pode ter até cinco repetições iguais ele aceita tipo ah ah ah ah ele aceita se tiver seis aí não aceita mais Então se você quiser ser um pouco mais rigoroso troca para 4 e se você quiser mais 15 em funcionamento a quantidade máxima de eles não falei que a eni ainda né quando está falando de informática sequência de dna a letra m representa qualquer um dos quatro tiros isso geralmente acontece quando há uma falha

no seqüenciamento quando há uma falha no banco de dados as sequências Que você não tenha um pedaço daquela sequência ou alguns núcleos específicos só você troca a letra da posição onde estaria aqui nucleotídeo pela letra n então tem um nucleotídeo ali naquele lugar só você não sabe qual quer ou não importa qual quer então você troca pela letra então se você tiver trabalhando com a sequência que talvez em alguns eles porque o seqüenciamento não ficou bom ou porque o banco de dados ainda não é muito curado Aí você eventualmente pode ter e na sua sequência

você pode pm chico que o prêmio três construa primer mesmo que tem 1 ml uma região que tem aí ele pode fazer isso tá mas aí é que no caso do trecho 10 porque nossa sequência bem curada não é o caso esse negócio aqui ó cg clã piquet que é isso é a quantidade de cng na extremidade 3 linha do seu free do seu primo do óleo dos dois países porque Isso porque a extremidade três linhas que eu falei pra vocês é aquela que a gente tem que tomar cuidado ela tem que ser muito específica

então se tiver um g1 ceast nas três linhas do primeiro núcleo de manter essa linha é legal é bom porque é uma ligação mais forte você pode colocar mais 161 g ali você pode pedir para 63 na verdade encontrar uma região de tal maneira que ele desenha um primer cuja a extremidade 3 linha começa com um cerco com g e isso vai fazer com que aquela extremidade aquela ligação seja mais forte nome da pessoa em diminuir a chance de você ter ampliação de produto específico então você pode fazer isso você falou pô craymer 3 o

seguinte você trocar aqui pra para 2 por exemplo ele vai tentar desenhar primer que tenha gcg ou cc na extremidade 3 militar vamos deixar 0 aqui porque a gente não quer mexer nisso agora Pode ser se você tiver dificuldade desde a primeira estrangeira no ranking a aplicação específica tem várias coisas e pode fazer essa é uma delas talvez tenha armar sua reação mas se pode amar desde o primeiro também quantidade máxima de gc na extremidade 3 linha aí você consegue também é de terminar a faculdade a quantidade máxima que você vai ter ali números de

retorno quando os resultados de para esse primeiro você vai receber depois que Você delpy primeiro ele vai dar os dois melhores lá os dois primeiros são os dois melhores com menor valor de penalidade mas ele vai dar outros resultados também que é ele manda aqui é o cinco resultados isso é interessante tem gente que faz vários prêmios e testa qual funciona melhor aqui do lado direito depois de olhos aqui que está aqui são menos importantes agora aqui não há direito a gente tem estabilidade máximo na extremidade de Três linhas você consegue colocar um valor aqui

pelo menos até o delta g então o valor é baseado nos parâmetros de termodinâmica e aí você consegue estabilizar é estabelecer qualquer instabilidade maior também é o negócio mais específico overlap ou sobreposição de junção tanto nas unidades 5 linha como na extremidade três linhas pra algumas situações é interessante que o primer ele seja desenhado entre junções por exemplo quem vai trabalhar a Expressão gênica o que vai trabalhar com análise de rna mensageiro a uma recomendação que um seus pais mas pelo menos ele esteja é eles ianelli justamente numa junção edson edson então as mensageiras dia

o garoto tem edson entrou em acção com quando o rh ele é processado no cinema seja processado tem a junção desses dois ex 11 anos mas sim e é interessante que o seu primeiro ele um deles pelo menos janelle em uma das funções action action Isso é uma maneira de você evitar a contaminação de dna genômico e rodagem não comprar não vai fazer uma ligação dessa sondagem não porque vai ter um entrou ali no meio né no caso de rna mensageiro ele vai se ligar então você evita a contaminação tudo é de energia no único

o fato é que você consegue especificar é qual que é onde tava aqui é quantos quanto os nucleotídeos estarão é adjacentes a essa e silva o leco essa Sobreposição tá tanto das 393 linha como a 5 linha essas duas opções para quem pra quem está desenhando mais de um prêmio a quem vai desenhar os painéis de uma vez e aí ele vai desenhar um primer seguido do outro ele vai falar com a distância que você quer do seu ford unprofor de dois por ford 3 por ford 4 você consegue estabelecer uma diferença uma um espaçamento

entre eles a questão tem pessoas que fazem vários prêmios para testar melhor condição às vezes são Pessoas que vão fazer um laboratório um teste de laboratório vai utilizar esse primeiro sempre esse mesmo prêmio por muito tempo por muitos anos por um teste interessante a testar todas essas possibilidades colher melhora mais econômica que vai ser mais eficiente e sete não têm essa opção também é esse todos aqui a partir daqui do max elf blá blá até aqui embaixo até aqui o maxilar hermes prime todos esses aqui tanto do lado esquerdo Como lado direito ele estão falando

estruturas secundárias da fã dtm é que tá falando de ligação de estrutura secundária de força de ligação do próprio comprime com ele mesmo para o encontro prêmio pra mim mesmo com um template tudo só quem está falando disso tarde e força de ligação e aí você consegue estabelecer quais são as forças ligação estruturas secundárias que você vai permitir o quão o exigente você vai ser que não tenha estrutura secundária Se tiver com forte você vai aceitar que ela seja etc tudo isso aqui você vai arrumar nesse nesses parâmetros então era só complementariedade entre um mesmo

primer um primer ford ligando com o primeiro ford por exemplo um primo e aqui nós não tem um valor da termodinâmica que nós estamos falando em valor dtm aqui a mesma coisa qual é o máximo que um primer vai se você vai permitir cumprir mas ele e ao pai dele não fordes ligando a reverse e aí você Pode trabalhar com o tema o dinâmico da termodinâmica valores de tm também e assim vai todo mundo aqui ó self tão ele com ele mesmo ford com ford nós temos um ford com reverse nós temos uma complementariedade na

extremidade 3 linha é essa que é importante que eu falei pra vocês não pode ter uma complementariedade na 3 linha porque pode atrapalhar a reação ou não pode ter uma complementariedade forte a ponto de atrapalhar reação aqui é a ligação de Rap estrutura secundária de rappin a ligação do seu primeiro uma região que você não quer que se liga a região não especifica a que se você tiver utilizando uma biblioteca de ligação inespecífica o quanto que você permite que ele se liga em regiões não específicas e aí bom e acabou toda parte de forças ligação

aqui nós temos algumas outras opções aqui você está falando o primer ele deve terminar a extremidade 5 linha Dele com a base ou nucleotídeo aí você coloca você quer ser um jejum há um tempo está falando que os instrumentos incluindo o seu primeiro tem que terminar nucleotídeo x vocês têm determina qual nucleotídeo que você quer a mesma coisa quebrou três linha três terminais de três linha e aqui para interna à venda para quem trabalha com sonda que não está fazendo agora está trabalhando em sua companhia forte revés o acrônimo que você usa para o primeiro

Left então é o ford o raid é aos é o reverso e aqui é o separador do nome do praga ea então a gente dá uma mexida boa que nos ajustes avançados e aqui está falando qual os parâmetros de termodinâmica que você vai utilizar ele tem duas opções são dois estudos o termodinâmica diferente você pode selecionar quais esperamos que você vai utilizar eu vejo mais esse da santa luzia que não sei se uma mulher eu vejo mais em santa Lucía aqui do que o outro ea correção de sal mesma coisa lembra que quando a gente

está falando de termodinâmica se vocês olharem a fórmula da termodinâmica ele considera a informação do sal da concentração de sal também na reação isso é importante é para manter as fitas separadas por quando a pessoa morre e ele considera também é essa informação na fórmula termodinâmica então aquele tenha a correção de sal na fórmula também muito bem então vamos lá então só Teve a gente já mexeu lá nos outros parâmetros lá atrás né e aqui é pra quem está fazendo o seqüenciamento não é o nosso caso agora então temos gente a mexer lá atrás esses

ajustes avançados michel agora e aqui a informação de óleo interno não interessa porque essa é para sondagens não trabalhando com sonda e aqui os valores de penalidade o peso da penalidade eu falei pra vocês que todo primeiro a gente viu lá com desenho Primeiro ele vai dar resultado e vai ter um monte de informação e no final o valor da penalidade um valor quanto menor melhor e você pode trabalhar nesses valores penalidade olha só alguns exemplos aqui não vai olhar tudo não mas se você tiver é um primeiro vamos supor que a pm seja um

parâmetro muito importante no seu caso por alguma razão não mais do que o geral mais do que os parâmetros convencionais de pcs desde 1o Ar tem pra você é muito específica você pode dar um peso diferente para teme se você vai falar o seguinte 1º 3 a tm tem que está dentro dessa faixa se ela estiver um pouco fora dessa faixa isso é importante pra mim então de um valor de penalidade maior para o meu primeiro que sair desses parâmetros pré-estabelecidos aqui você consegue dar um valor de penalidade para teme ou para qualquer outra coisa

que tamanho quantidade de 600 para tudo e é isso aí É são os principais que a gente tinha que mexer agora a gente voltar aqui no meio e delp primers nós vamos receber a esses resultados só isso aqui que eu tô gostando pra vocês não oprime o primeiro left o primeiro ford o primeiro dois pra mim haiti ou reverse na seqüência deles é isso que a gente vai pedir que é essa seqüência que a gente vai utilizar pra comprar lá na frente depois fechou então de remendo desenhamos o primeiro é assim que a gente desenha

prima é isso que Você consegue mudar um só fazer um negócio aqui deixa eu voltar não tinha uma coisa antes da sequência né o nosso primeiro foi desenhado aqui ao ford está aqui o reverse tá aqui e aqui em baixo são as outras opções deixou cinco opções de resultado então a opção 2 a opção 3 opção 4 estão aqui em baixo e assim que a não têm mais de 56 opções quem tem tem a principal e mais quatro aí vocês podem ver que o valor da penalidade que está 0 0 61 15 00 62 porque

é um pouquinho pior csac 010 6301 0 64 que eles são cada um quanto mais para baixo um pouquinho pior não quer dizer que não funcionaria para onde funcionaria também mas esse aqui de todos que ele desenhou esse aqui é o melhor está com 10 106 de valor de penalidade então agora a gente pode comprar esses dois prêmios aqui a gente quiser e depois seguir para a reação vamos voltar aqui próprio nossos slides Então a gente fez aqui a seqüência ao que encontramos nas regiões conservadas dezembro nossos próprios agora vamos começar a avaliação ea gente

vai utilizar o blast para fazer essa avaliação só a gente vai entrar aqui no nosso desenho ea gente vai mandar o primeiro 3 média fica nesse botãozinho aqui ó e aí você vai cair nesta página aqui então aqui deu o nome do nosso experimento ao amostra de primers a Sequência dodô left a seqüência do right quando ele foi feito é o banco que vai gerar sequência do produto da pcr não temos nenhum interno que não tem sonda eo que a gente pode fazer é clicar em blast é o que a gente vai fazer agora quando

você clica em blast ele vai mandar gente aqui pra essa página e também de muito o que mexer aqui não vale a pena mexer em nada já tinha as duas sequências ford reverse que o que Se esse programa a fazer ele vai pegar sequência e jogar contra um banco de dados é imenso e ver se essa seqüência aqui ela se há nela em algum lugar se ela sair de lá é o que a gente quer porque a gente é isso que a gente espera que o time faça durante a pcr aqui eletronicamente digitalmente tem que

fazer a mesma coisa que vai pegar esse primeiro e como se tivesse uma pcr e digital não persegue digital a técnica Mas a pcr de uma maneira digital então ele vai pegar esses dois prêmios comparar com um banco de dados e nem se ele há nela que é isso que a gente quer que aconteça na vida real lá no youtube então vamos fazer o blast clicar nesse botão e aqui sim às vezes demora mais porque o banco de dados é muito grande e deixa trabalhando eu vou cortar o vídeo e já volto e te falo

quando ambos voltamos não demorou muito vou demorar um pouco na verdade não levamos 30 Segundos a que ele está mostrando os parâmetros da nossa da nossa busca é da pesquisa fazendo vários navios que importa é a que tem os dois primeiros que a gente fez a análise é o forte ao ford que o f5 do ford reverso tá um olhar forte primeiro aqui em baixo tal resultado que ele encontrou complementariedade havendo então ele encontrou complementariedade a várias sequências que estavam disponíveis nesse banco de dados um monte de seqüência Aqui ó e aqui destinada a gente

consegue ver qual que foi doação desse alinhamento digital que ele fez então ele tem um valor máximo aqui de 40.1 valor total foi de 40 ponto enquanto maior nesse valor aqui melhor a cobertura foi de 100% seja o primeiro além dos 100% essa sequência esse negócio por cento essa alta seqüência que também sempre senti falta sequência aqui então ele encontrou que Complementaridade com um monte de gente o que acontece porque ele encontrou complementaridade com várias regiões aqui na verdade porque tem vários organismos havendo isso aqui é um organismo se que outros outros vários organismos pode

filtrar aqui ó compor ou o sapiens filtra e aí sim ele vai achar que o resultado só para humano e olha só encontrou complementaridade com quem com hoje a pdh também então a questão os diversos transcritos que esse gene pode Gerar mas isso não importa para a gente agora porque a gente não tava trabalhando com expressão gênica que importa saber que amplificou já pegará que é o que me interessa beleza tão está validado aqui a pcr eletrônica precisa e digital a gente fez e funcionou então está validado a gente pode fechar daqui e seguir para

as nossas outras validações aí a outra avaliação qual que é vamos aqui é a validação gente vai utilizar o Net primer só que é só pra gente verificar qual é a estrutura secundária aqui esses planos estão gerando já foi o seguinte vamos lá na nossa lista de links úteis clique aqui na net primeiro a cnet primeiro você vai ter que fazer cadastro diferente dos outros aqui você precisa de um cadastro vamos tentar acessar a cnet primer eu já tenho cadastro vou colocar meu cadastro aqui a gente vai fazer o uso da ferramenta A gente pode

colocar o nome é que a aula primers uma descrição se você quiser o top no youtube a gente pode colocar seqüência unhas seqüenciadores vão lá copiar a seqüência um é o forte aqui o left cola iraque aí a seqüência dois cola é que aí a gente possa mexer nada aqui agora tá porque tem aquela concentração de óleo também que você pode utilizar mas se você quiser trocar se você souber já quais são as condições Da sua pr troca troca mas se você não souber a deixa do jeito que tá concentração de óleo o monovalente igual

a gente deixando o nó no primeiro 31 de valente também concentração de sal é o de sódio total é equivalente a gente não tinha mexido lá que não precisa mexer onde vai pro canalizar e aqui em baixo onde vai dar a ao resultado para cada um dos primeiros ele vai dar uma pontuação também é quanto maior melhor A unita o peso molecular ele da tma quantidades e pode até alguma coisa que tem por exemplo uma coisa diferente do que a gente tem lá no primeiro 3 não sei se foi diferente vamos ver aqui ó nosso

time aqui tá 62 pontos e 69 lá no primeiro 301 60 porque são alguns ajustes diferentes o que a gente quer ver aqui foco no primeiro três desses outros o que tiver de informação sobreposta continua com a informação do 1º 3 que é a nossa ferramenta de desenho De primer aqui a gente quer ver isso aqui ó é os números quais são as estruturas secundárias aqui no caso ele formou um ele faz uma ligação com ele mesmo havendo um self nemer não dá uma olhada aqui olha se você clicar a gente mostra onde ele dá

a ligação ainda a ligação de dimerização então tá aqui ó é nessa região que está dando a ligação de dimerização o outro primer ele não tem dinheiro nenhuma então ele está funcionando Bonitinha que então a gente pode utilizar esse software esse algoritmo para encontrar onde estão os dinheiros tá e aquele tem um valor nem a força dessa ligação dessa estrutura secundária também beleza se a gente olhar lá no primeiro três talvez nem mostra essa ligação lá se não mostrar porque foi fraca lá ela passou nos parâmetros que a gente pára estabeleceu então ele desconsidera não

ele não mostra a como sendo algo que Atrapalha é bom só para você saber então só pacote não são crimes muito bons ele faz um cross há quiosques de mostrar isso aqui aqui embaixo de motocross da m1 primeiro cigano outro então a ligação fraquinha também o tac é um primor se liga no outro é o fórum se ligando no reverso certo então sobra em ter uma noção é muito raro é bem difícil na verdade desenhar um par de primer que não tem nenhuma estrutura secundária normal de estrutura secundária não pode Ser forte a ponto de

atrapalhar a relação com a conversar como eu falei pra vocês mas de um modo geral vai ter uma estrutura secundária e isso é aceitável desde que a gente que siga que esteja dentro dos parâmetros que a gente para estabelecê la fechado então a gente foi aqui fez a esse outro ponto de validação que era das estruturas secundárias estão voltando aqui pra gente lembrar que encontramos na seqüência num no uso não é sexo na ncb Ae identificamos se ele tinha regiões conservadas e desenhamos os primeiros dentro das regiões conservadas e desenhamos os prêmios no primeiro 3

a gente fez um plástico pra ver se aquele pra mim é saber lá algum fragmento de dna que está depositado no banco de dados ea melou funcional bonitinho validamos a estrutura secundária não tinha nenhuma aberração ali e agora a Gente vai fazer a avaliação de bancada agora que você tem a sequência do primeiro como você faz esse pedido que quais as informações que você deve passar por seu fornecedor e quais informações você precisa saber pra compartilhar com seu fornecedor então vamos para essa parte agora tá aqui ó no momento do pedido que você deve considerar

você deve considerar essa quatro cozinhas aqui vamos olhar que Deixa eu voltar só nosso primeiro toy é essa seqüência que é que você vai pedir é isso que você vai colocar no arquivo seja lá como sabe disso no corpo do e mail numa planilha se você vai colocar uma ferramenta de de pedir pra mim interessa mas que vai utilizar quero dois primeiros hoje a pdh o primeiro ford é esse aqui com essa seqüência o primeiro reversa é essa aqui com essa sequência é isso que você vai me passar Bom é isso que vai pedir pra

ele mas então o que a gente vai considerar no momento desse pedido na hora de você fazer a compra do seu 1o quais são as informações que você vai passar por seu fornecedor primeira delas acho que talvez aqui a mais importante escala de síntese que quem escala de síntese é o seguinte a escala de síntese ela está relacionada com a quantidade de bases que serão utilizadas no início do processo de síntese do primeiro eu falei Para vocês que o time é produzido e sintetizar uma máquina que faz isso o equipamento que faz isso ele vai

pegar os nucleotídeos na ordem que você pediu e ele vai ligando um no outro e faz isso só que esse processo ele não é 100% eficiente ele num momento em que a máquina que esse equipamento vai adicionando que o tio a máquina erra tem o que eu digo que cai fora que se perde tem fragmento que ele não continua sendo produzido fica pequenininho acontece de Tudo ele durante o processo de produção então a escala de cinza é o seguinte o quanto de base quanto pelo título vão ser utilizado no início da produção do seu primeiro

quanto menor a quantidade medida de base iniciais nucleotídeos iniciais no processo menor a quantidade final que você vai ter o seu primeiro que já colocou uma quantidade x ac por onde o processo você vai perder um pouco de si x aí você tem o seu produto final que é O rendimento final dos seus próprios então quanto menor o melhor a quantidade inicial que você pede de bases na as causas decididas no seu primeiro é diretamente relacionado à quantidade final que você vai ter nos seus prêmios no final do processo quando você receber de fato laboratório

lá no youtube então quanto maior esse valor você coloca ali maior rendimento no final mais praia você vai ter mais relações Você consegue fazer então é isso a primeira coisa escala de cinzas está diretamente relacionado ao rendimento o quanto você vai ter de primer lá no final o tipo de purificação eu falei para vocês agora esse processo de síntese é ineficiente então acontece você tem um primer que ele foi e começou a ser sintetizado ele parou no meio do caminho você não consegue sintetizar mas só que não te interessa só que não importa para você

Na sua reação é pequenininha demais não é seu primo completo tem lá seis nucleotídeos por exemplo se você não quer ser filtrados e purificada tem que sair dali existem diferentes tipos de purificação que retiram todos os primers defeituosos do processo países diferentes publicações vou mostrar pra vocês e para cada aplicação uma tipo de purificação é mais indicado eu vou mostrar daqui a pouco formulação na grande maioria das Vezes você comprar praia você recebe um tubinho de primeira linha utilizada um pozinho não ele não está em solução então você pega recebe um pozinho e aí você

vai adicionar água ali um tampão para responder esse praia ou não você pode comprar o premier league e às vezes você tem companhia que vende você recebe o primeiro já em solução quando terminada a concentração tão o tipo de formulação e você escolhe na hora da compra também algumas empresas permitem Que você escuta a maioria das vezes nem utilizado pozinho e por último no nosso caso aqui quase importância a 0 é a modificação você adicionar um flor off uma extremidade uma botina alguma alguma modificação que você pode colocar nas extremidades do seu praga hoje a

gente não vai falar disso aqui em alguns casos algumas posições específicas o primeiro que eu tinha de 1 2 ou 3 selar uma região uma posição específica de nucleotídeo talvez seja Interessante pode ser que seja interessante não ter um núcleo específico talvez seja interessante que a sequência seja a tcg ou a tcc ou a tca todas essas combinações elas podem ser interessantes para alguns casos então você ter nucleotídeos genéricos ali no meio do seu primo isso pode ser legal por alguma razão e você pode determinar isso no momento da compra também eu vou mostrar uma

tabelinha de Como você faz então voltar aqui o na escala de henan no tipo de purificação olha aqui uma tabelinha que eu peguei na internet que foi no site da maxim não me engano os tipos de purificação e a indicação de dois tipos de purificação aqui em cima para cada aplicação nós temos esses tipos de sinalização é a mais utilizada provavelmente o que você vai comprar é esse tipo de purificação que você vai Selecionar ela indicada propiciar em tempo real é indicada pra pc convencional para fazer mais correr para fazer seqüenciamento então saque de sinalização

mais utilizada cartucho ato shu é algo parecido com o sistema de purificação ou de extração de dna que utiliza aquelas colunas e até onde eu sei é o sistema cartuxa parecido com isso você seleciona o que você tem os fragmentos grandes e os pequenininhos defeituosos passam por alisson interessa É você tem que você vai utilizar e o cartucho também é recomendado para prpc em tempo real seu pensamento é marcar o rei é s um cartucho não é recomendado que você possa trabalhar com fragmentos grandes que é a purificação fica mais complicado o hplc o hpl

a c é para as ondas de pcr em tempo real pela clonagem marca vez o peixe que é um é transformar em pólo acrilamida clonagem mas correia também e esse último aqui mgso para quem vai Fazer trabalhar com adaptadores para seqüenciamento de nova geração é que eu estava ali pra vocês têm como referência que tipo de de purificação vocês vão escolher se o pcr convencional banho na de sinalização que é o suficiente e os códigos e o pac então aquilo que eu falei se você precisa colocar em uma determinada posição mais de um núcleo atingiu

então você vai ter primeiras consequências diferentes você pode trocar as nucleotídeo que você vai mudar Por uma letra genérico então o r por exemplo significa a hoje é tão-só nucleotídeo seu primeiro o seu primo na verdade vai ter lá seqüência x de bonitinha e uma determinada posição ele vai ter um é isso significa que ali naquela posição pode ter tanto marina quanto uma agonia tanto faz para alguns casos pode ser interessante tá então aí o primeiro ele pode ter é essas essas outras letras aqui então cada uma delas significa uma Combinação diferente de onde nucleotídeos

inclusive você pode colocar quatro nucleotídeos humana determinada posição sei lá um cliente de número 4 do seu primeiro pode ser ver que é um a um o seu 1 g por exemplo tá é o que dá pra fazer também é colocar ele e aí pode ser qualquer base lembro que falei quando está falando de seqüência aqui de nucleotídeos o enem significa qualquer base ou base desconhecida então pode ser qualquer base ou você pode colocar 1.135 Significa que ali não tem nada mas aqui no caso quando vai desenhar primeiro isso não interessa então essas outras aqui

é o que importa tá bom então essa aqui é o código e na bancada e que você fazer belief desemprego então a gente fez aqui falou validou tudo vai chegar comprou comprou escolher o tipo de purificação que você quer o seu a síntese escala simples tudo tudo certinho aí você vai receber no seu laboratório Tubinho provavelmente utilizado o que você faz com aquilo e eu vou te falar o que você vai fazer você o que você deve considerar então se deve considerar esses quatro componentes aqui primeiro trabalho fazer uma diluição do primeiro chegar de suspender

aquele time que vai chegar pra você e você tem uma solução de estoque isso a gente vai nos geral se mantém essa solução de estoque assim micromar vamos falar sobre isso daqui a pouco mas não é essa que você Vai utilizar no seu dia a dia não é essa que você vai tirá-la do seu clube para fazer a pf essa é só uma solução para você guardar lá no seu filho - 21 - 80 o que você vai utilizar é a solução de trabalho que você vai tirar um pouquinho dessa solução de estoque e diluir

parte da solução estoque uma solução trabalho geralmente está deixe se mantém as dez micro lá por que faz isso pra você não tem que ficar congelando e descongelando os seus primos todas às vezes você faz Uma solução de estoque você vai deixar guardadinho vai tirar um pedacinho uma porção da solução de estoque e essa sim você vai utilizar no dia a dia congelar e descongelar congelar e descongelar tela acabar e aí a sugestão solução do estoque acm como la ea solução de trabalho a 10 mícrons lá você vai estabelecer qual é a quantidade praia que

você vai utilizar na sua reação porque você vai receber um primer no seu laboratório você não sabe Exatamente quanto você vai utilizar tem a recomendação padrão de quanto você vai utilizar mas será que essa recomendação padrão funciona pra você você só vai saber testando e altamente recomendável que você teste então você vai trabalhar com seus primeiros e em diferentes quantidades você vai pegar aquela recomendação padrão está entre 01 e um micro molar essa concentração final que vai falar na sua reação de pcr e você vai fazer uma Faixa de diferentes concentrações 01 02 05 07

e um micro molar que você ver qual é a funcionar melhor além disso além da quantidade de praia que você volte lance utilizar na sua reação você tem que testar a temperatura de lamento que você tenha a pm você tem aquele porque você deseja para você sai com a tn você vai calcular a temperatura de anelamento como eu mostrei pra vocês só que você não vai usar essa temperatura de janeiro a mente Como se calculou diretamente vai testar várias se você pega as que você calculou vamos supor que seja 57 temperatura saneamento testa a 55

56 57 58 59 60 e ver como funciona melhor que você vai fazer isso para os seus dois terços dos seus olhos pra você tem que testar todas as combinações não esqueça que você está utilizando os dois prêmios ao mesmo tempo isso quer dizer o seguinte que quando se está falando de concentração ou quantidade do primeira reação pode Ser que você tenha reações que o plano e ford ele esteja em menor quantidade do que o próprio reverso e vice versa você vai descobrir isso testando atestando aí a temperatura de lamento não é porque você vai

fazer uma temperatura de lamentos dos dois primeiros se eles tiverem temperatura saneamento diferente você faz o teste e ver qual dessas várias temperaturas novamente que você testou como é que funciona melhor qualifica melhor não Ficar melhor significa a quantidade de dna amplificado lá no final sem a formação de fragmentos inespecíficos a concentração de dna temperatura de mel tinha quantidade que você utiliza do primer pode influenciar na geração de fragmentos inespecíficos se você tem uma grande quantidade de prima na sua reação você pode fazer com que os primos cianelli entre eles formando essas estruturas secundárias é

que eu falei você tem maior você gera Mais chance de isso acontecer porque você tem aula elas esses painéis em grande quantidade você tem chance de gerar fragmentos inespecíficos então isso tudo que eu falo para vocês é pra você amplificar o seu fragmento alvo com bastante qualidade em quantidade que você precisa sem formar dinheiros sem formato produto específico fechado então quando o seu time a chegar que você vai fazer de fato na bancada na Vida real seu primeiro chegou você se preparou colocou lula seja lequinho bancada um pouco seus equipamentos é preparou tudo que você

precisa preparar seu pai vai estar lá dentro de um saquinho e vai colocar ele não precisa dar um jeito de o time ter temperatura ambiente ainda porque está ali utilizados estiverem utilizado e você vai fazer o quê primeira coisa que você vai centrifugar você vai pegar esse tubinho e como fazer um spin off Spinelli uma centrífuga rápida se você não sabe por alguns segundos os dez segundos deixa ele sempre fumando uma velocidade ok pra que você faz isso porque se tiver algum pozinho resto de primeiro que ele se loco se mexer ali dentro do tubo

durante o transporte integrado na tampa está grudado na na parede do tubo você traz tudo isso o fundo do tubo e aí quando você abrir o seu clube para fazer a diluição você não corre o risco de Perder aquele prime perder um pouquinho do que você tinha ali dentro então você dar essa primeira vez em jogada rápida é um espinho para trazer todo o possível conteúdo que não está no fundo tudo do tubo para o fundo do tubo esse é o primeiro passo o cara de tristeza aqui três porque chegou pra mim é triste porque

ainda tem algumas coisas pra fazer olha só o japão está tão feliz mais aí no paço 2 você vai fazer a Solução de estoque a solução do estoque a gente vai deixá las em micro lá você pode trabalhar coisas outras concentrações manter 200 a 50 pode pode do jeito que você quiser mas sem o padrão não se deixa a solução de estoques e michael mullarkey é essa que você não vai ficar congelados congelantes vai deixar guardadinho lá pra você usar você recuperar quando você precisar quando a sua solução de trabalho terminar o que você vai

fazer Chegou então praia sempre fui gol está todo mundo lá no fundo não tem nada na parede nem na tampinha você vai adicionar água quanto de água vai colocar dez vezes a quantidade do primeiro como que você sabe quanto do primer você sabe porque quando você compra o primo quando você recebe o crime lá no seu laboratório vai vim com um papelzinho e live in com a especificação dizendo várias coisas sobre ele Inclusive quanto de praia tem ali dentro em várias informações inclusive quanto veio de primers porque a quantidade ela varia que pra mim pra

primer porquê porque o processo de síntese do primer é ineficiente não é 100% eficiente então a perda ao longo das índias naquele pra mim então cada turbina vim com uma cultura diferente algumas empresas algumas empresas que entregam uma quantidade que você pediu se você pediu sei lá Trinta nanograma de primer você recebe 30 anos de praia algumas empresas fornecem serviço mas a maioria não a maioria você vai trabalhar com a quantidade a escala e simples inicial que vai determinar a o produto final o seu yield a quantidade que você recebe lançou laboratório mais valia de

praia praia que você vai colocar dez vezes na hora só que conta você tem que fazemos que conta você tem que fazer se você quer Manter a solução acm como lá como eu estou te falando você vai pegar o x normal se é o que veio do seu primeiro é que vai está escrito lá no seu papel zinco recebeu e adicionar x vezes 10 de água se você tiver lá no seu papel sim por exemplo o seu primeiro ford do gene já perdera que a gente acabou de criar ele veio uma com a quantidade de

35.1 molz deprime veio com essa quantidade aqui você vai Adicionar 351 micro litros de água e quando você faz isso você adiciona essa quantidade de água nesse pozinho que tinha essa quantidade aqui ele vai ficar uma concentração de 100 micro molar e aí você guarda isso pra você diluir se você quiser evoluir agora para a sua a solução de trabalho você dilui se não você guarda isso vai utilizar isso lá na frente só quando você precisar vai ficar mexendo na solução do estoque não ela vai ficar a aguardar disse mas Geralmente que se faz de

lula para a solução de estoque você vai fazer um segundo passo de diluição que é fazer a diminuição da função de trabalho que essa aqui vamos manter nossos primos que a gente vai usar no dia a dia a 10 micro molar então você vai fazer uma diminuição de 1 para 10 não é simples aqui você tem uma solução que estava a 100 micro molar você quer gerar uma solução de 10 você vai por exemplo que você vai pegar Dez micro ônibus da sua solução de estoque que você acabou de criar pegar 10 mil microfones ali

passa por um tubo novo e adiciona 100 micro litros de água e você vai ter a sua solução de trabalho 10min como lá é essa solução aqui que você vai congelar e descongelar utilizar no seu dia-a-dia a história vai ficar guardada essa que você vai pôr para funcionar então ficando cada vez mais feliz aqui ea e no paço número 4 nós vamos encontrar as condições ideais de Pcr que foi o que eu falei lá atrás e vai testar o que diferentes temperaturas de lamento e vai testar diferentes concentrações de praia e ver qual é a

que funciona melhor faça isso dá trabalho dá trabalho fazer se dá trabalho mas se você fizer isso você vai fazer trabalho no futuro é melhor que você faça toda essa padronização hora que seus primeiros chegam e você vai funcionar bonitinha sua reação e você não vai ter Trabalho no futuro tentando otimizar e que está acontecendo e faz eletroforese não funciona é tão otimista agora essa hora de seu prêmio chega e se manter organizado manter sua solução de estoque bem guardadinha e faças diluições para a solução de trabalho pra você não contaminar não degradar seus prêmios

na solução esse toque e lê e aqui nós temos então um resumo da aula de hoje primer são os ingredientes que mais Variam a percebe o que pensamos é que tem um gradiente que faria mais que o pai numa pcf do dna mariana tem dados do qual a fonte daquele seu dna mas um modo geral quem trabalha com uma fonte de dna e trabalhar sempre com aquela é brasília a mesma coisa de magnésia vai alterar alguma concentração ali aqui e ali se precisar não que varia mesma praia então o time de fato é que são

os games que mais variam até seis são eles que têm Que utilizar melhor mesmo utilizar com mais cuidado então os prêmios são os responsáveis por dar à especificidade uma reação de pcr ele junto com a estrutura do dna o álbum que você escolher a concentração de sal você está trabalhando a quantidade que você vai colocar na sua reação tudo isso influencia a especificidade mas a gente fala de probabilidade o primeiro é o cara ele que manda na especificidade temperatura The melt o atm é quando a metade de um primo que estava indicado pode ser qualquer

dn a dupla fita mas quem está falando de um time é quando a metade de um primer está dupla fita ea outra metade está aflita simples a temperatura de anelamento ou a temperatura ótima de enervamento é a temperatura na qual os prêmios se ligam com maior eficiência ao seu alvo geralmente está entre 46 graus abaixo da temperatura de melt e vários parâmetros Devem ser considerados no momento de dezembro pra mim é de falou sobre eles tamanho porcentagem de gc temperatura the melting as seqüências repetitivas estruturas secundários que podem se formar tamanho do seu álbum região

do alvo e aqueles parâmetros todos que a gente conversou hoje meus amigos era isso a aula de hoje é essa eu espero que vocês tenham gostado espero que essa aula seja útil para vocês aí na vida real No dia a dia no laboratório de vocês e olha só se vocês quiserem algum tema se você tiver alguma dúvida precisarem de qualquer hora aula sobre biologia molecular que nos relacionados manda nos comentários que eu preparo essa inclusive foi alguém que me pediu alguém comentou em algum em alguma das outras alas que eu já fiz e tá aí

pra você a aula de como desenhar praias na a prática na lata se você gostou desse Conteúdo compartilhe com seus amigos se inscrevem no canal deixa seu like esses comentários quase cozinhas quatro cozinhas like comentário compartilhar se inscrever beleza muito obrigado até a próxima de aula [Música]