Aula 6 Principais Técnicas de Biologia Molecular

o Olá pessoal tudo bem na aula de hoje a gente vai falar sobre as técnicas básicas em biologia molecular mas o que que é a pelugem molecular é um ramo da biologia que estuda a natureza dos fenômenos biológicos a nível molecular através do estudo análise e manipulação do DNA do RNA e das proteínas é um campo que está muito associada a outras disciplinas como bioquímica genética e a própria biologia celular nós vamos falar mais para frente a importância das técnicas moleculares é no diagnóstico mesmo de virtualmente praticamente está presente em praticamente todas as artes e

importância dessa biologia molecular mas antes vamos falar vamos lembrar um pouquinho Onde está o material genético nas células né em células eucariontes o DNA ele basicamente está localizado o look é existe e lógico DNA também é localizada nas mitocôndrias e cloroplastos no caso das plantas mas ele está presente no núcleo que é delimitado por carioteca em procariotos o DNA é uma molécula única ele é um DNA circular que fica disperso no citoplasma numa região chamada de nucleoide a gente dá o nome de Genoma ao conjunto de material genético de um organismo todo o DNA presente

no organismo a gente chama de Gênova é interessante a gente observar diferenças mesmo dentre espécies você tem a mesma espécie o mesmo Genoma mas muitas alterações muitas diferenças entre uma espécie entre essas espécies dentre esses indivíduos essas diferenças que podem ser o tamanho do cabelo a cor da pele a cor dos olhos e várias outras características relacionam-se com diferenças Na expressão gênica É temos basicamente os seres humanos o mesmo Gênova Mas a forma como é feita a expressão dos genes é diferentes e o Jeni tem como o produto funcionar é aquela pedaço de DNA daqueles

formado né Por Um nucleotídeos né cuja produto funcional RNA e polipeptídeos diferentes organismos apresentam diferentes números de cromossomos genes e obviamente pares de bases não reflete na complexidade não quer dizer que quanto maior o número de genes mais complexo organismo é e vamos lembrar um pouquinho do DNA DNA o ácido desoxirribonucleico ele é composto por duas cadeias de nucleotídeos dispostos em dupla hélice é basicamente o que nós temos de ligação entre as entre os pares de bases miga De Nile guanina e citosina são Pontes de hidrogênio entre timina e adenina a gente tem duas pontes

de hidrogênio entre o anime citosina Três Pontes de hidrogênio O que é o DNA que é o genro Gene é um segmento de DNA que codifica uma data proteína Essa é a definição clássica de gene o gene ele contém tanto regiões codificadoras que são Jetsons quanto regiões não codificadoras que são sintomas tá antigamente o implante chamado até de DNA lixo né E hoje em dia se sabe que não tem que tem importante função regulatória tá é os íntrons eles são descartados do transcrito e Edson são ordenadamente Linhares durante o processo que a gente chama de

Spice é o RNA mensageiro ele é transcrito basicamente Pronto né para migrar para o citoplasma Então o que a gente tem como Gere o gene ele contém tanto exons quantos litros e ainda no núcleo o qual o processo que a gente chama de splicing Os Simpsons são retirados de moto por Gene de modo que o desculpa o RNA mensageiro ele vai se tornar um um RNA continuo tá vendo que contém toda a receita do gênero sem então sem espaçadores sem espaços entre as regiões codificadoras tá lembrando então que a transcrição ocorre no núcleo que a

passagem do DNA é a transformação da do DNA e RNA a transcrição do DNA e RNA no início ssprev RNA mensageiro essa fita de RNA mensageiro é bem maior mas ela sofre Nos quais se não tem nativo um processamento em que só as regiões codificadoras são que ficam né na fita de RNA mensageiro esse RNA mensageiro então vai para o citoplasma migra para o citoplasma não é e ele acaba se unindo a ribossomos e ao RNA transportador de a ouvir o processo de tradução e as técnicas moleculares agora falando delas propriamente ditas eles são métodos

comumente utilizados em bioquímica genética biofísica e envolve a manipulação de DNA DNA ou proteína são utilizados tanto em pesquisa quanto fingir ele nossos como a gente tá falando aqui como fingir agnósticos a importância tremenda para detecção de identificação de neoplasias para detecção de parasitos né é de mutações gênicas para determinação de identidade é para testes de paternidade também utilizado é muito na medicina forense então a Gama de utilidades é muito tá e nós vamos ver as principais técnicas aqui mas com as amostras eu posso estar utilizando você pode basicamente utilizar qualquer tipo de amostra desde

que ela contém o DNA então é possível extrair some isso aí DNA do sangue de aspirado de medula óssea de cm urina fezes e mesmo de materiais que já quem sabe sejam formol o que foram embebidas em parafina existem protocolos específicos é é para extração de DNA de amostras que já estão conservadas dessa maneira a única coisa que é importante é que eu dei o DNA esteja bem preservado se ele já tiver por alguma razão já ter sido degradado seja o coração do tempo porque não foi é fixado né preservados de uma forma adequada então

a técnica mas a PCR é um método de amplificação do DNA sem o uso de um organismo vivo foi desenvolvido criado né pelo bioquímico era pesquisador na época quer os males em 1983 é só que ainda era muito manual existiam muitas etapas e ele utilizavam uma tipo de enzima no processo para a duplicação para amplificação do DNA que era de esqueriquiacoli como a pessoa resolvia o processo de amplificação aumento de temperatura de uma missão de temperaturas entre as enzimas era muito muito lado eu não é muito muito delicada e ela tinha que ser reposta durante

o processo várias e várias vezes é na verdade é em 1.300 anos depois em 1986 é descobriu-se bactérias né e bactérias que que sobreviviam uma altas temperaturas em Água altas temperaturas e foi delas que se extraiu o ataque DNA polimerase um ataque que que era treino ou até mais estável não era termossensíveis internos sabe então criou-se um método muito mais eficiente para amplificação dessas sequências específicas de DNA exatamente isso que a pessoa está por meio de mudanças de temperatura é a pessoa ela vai amplificando o seu DNA molde sequências específicas do DNA molde mesmo que

a mesma mistura complexa de e é possível amplificar especificamente uma sequência de DNA tá esse aqui é a publicação é se eu não me engano essa essa publicação ela veio um tempo depois alguns anos depois em que quer vermelho demonstra amplificação do sequências genômicas aberta globina não é uma forma de ali diagnóstico molecular para anemia falciforme tá ele foi Prêmio Nobel de química gente eu quero descoberta que serve realmente é realmente um grande passo mesmo para área de biologia molecular Mas quais que são os princípios da PC então nós vimos que é um método de

amplificação de criação de múltiplas cópias do DNA sem necessitar de um organismo vivo então requer quais os componentes requer sete componentes essenciais necessita de um DNA molde e esse a gente extrai por meio de amostras por meio de protocolos específicos um par de oligonucleotídeos para iniciar a síntese de DNA a gente chama esses esses oligonucleotídeos de primers tá precisa de uma enzima que a DNA polimerase termoestável de desoxinucleotídeos que vão ser utilizados pela DNA polimerase para poder para poder estender a fita de DNA tampão e cátions que são importantes para manter estabilidade da de toda

a reação inclusive da enzima e de água particularmente É disso que eu preciso o assunto termociclador claro que é uma máquina que faz ciclos de elevação admissão de temperatura Como eu vou mostrar para vocês mais para frente é para que a reação toda ocorra e o termociclador é que faz essas oscilações de temperatura e os ciclos pré-determinados e ciclos definidos tá para que a aplicação ocorra Então quais são os princípios da PC e continuando então qualquer sequência algo de ganhar pode ser amplificado pelo TCR pode tá é Teoricamente qualquer sequência pode ser amplificada a localização

dessa sequência é feita pelos primers são eles que ditam qual amplico que vai existir qual é a sequência que vai ser aplicada e o que que são esses Prime são sequências nucleotídicas de 20 a 24 bases né em média são geralmente muito seletivos ou seletivos o suficiente para localizar um sítio único em um Genoma de alta complexidade a gente tem que pensar que quando a gente coloca o nosso DNA molde as essa sequência que a gente quer amplificar bem pequena é muito específica ou pequeno talvez não Mas é muito específica né então é o Primer

que vai fazer a localização dessa e para que possa haver a amplificação o pareamento dos primes consequência salvo se faz pelo estabelecimento de Pontes de hidrogênio obedecendo o pagamento convencional de escrito próximo a anos ativos é o prime ele se pareiam ou seja ele se liga ao template ou se a fita de DNA é por meio daquela daquele que a gente já sabe timina adenina guanina citosina é o pagamento conhecido der das partes de base Lembrando que a adenina timina é me desculpem aqui além da admiração são duas ligações de hidrogênio e guanina citosina três

ligações de hidrogênio mas para que os primo e se liga hein de forma assim tão correta específico Existem algumas regras que precisam ser seguidas tá é primes de DNA flanqueiam uma região de interesse e demarcam a trico é importante essa frase que a gente fala de a gente usa ternos ternos são muito muito Gerais né na Biologia e comuns na biologia molecular C O que quer dizer quando eu digo que eles funkeiro não quer dizer que ele se ligam próximos ou na região de interesse para demarcar o que vai ser amplificado o amplicon é a

sequência alvo de DNA que vai ser amplificada e os primes devem ser desenvolvidos de acordo com a região que se quer ficar a o desenvolvimento do primer específico é chamado de Prime design e são sempre aos pares viu a gente tem um primer que é chamado de palma para isso para ver saúde cuja sequência é igual ao referência Gene então aqui a gente tem a fita do a dupla fita de DNA durante a reação de PCR ocorre um aumento de temperatura com a quebra das ligações das pontes de hidrogênio e esse DNA mod da origem

Então as duas pistas separadas indivíduo risadas Então eu tenho um par de praias o prev-saúde é esse que se liga na fita assim três linhas cinco linha é o Primer cinco linha três linhas um time grande sentido porque é o sentido da faca DNA polimerase tá gente ele sempre vai se ligar nesse sentido e ele tem a sequência exatamente Idêntica ao do DNA molde da outra fita Enquanto o outro tem uma é correspondente ele é complementar a outra fita de DNA o que que acontece quando esse primer se liga a fita de DNA ele franqueia

quer dizer ele se eles se liga próximo ali a gente ela também de hibridização a na fita de DNA ataque dna-polimerases consegue então começar o processo de amplificação ligando os oligonucleotídeos presentes ali naquele meu tubo não que ela minha aquele meu mix de PCR para que possa ocorrer o processo de extensão que eu já vou mostrar para vocês já já sim Mas qual que é o tamanho do amplo com quem vai determinar o número total de nucleotídeos que vai existir naquele Lampião com são os primes e É lógico que eu consigo promover isso fazer isso

né desenvolver esses esses praia nesse para ver amigo previamente de modo a ter o tamanho que eu desejo o outro e conterá o tamanho eu desejo tá sobre o primeiro design os primers devem ter sequência única no DNA molde isso aqui é algo claro né porque o primo ele tem que se ligar sequência que você quer a sequência específica que você quer ele tem que ele tem que ter apenas um sítio de pareamento tá não deve existir sítios de anelamento e possíveis fontes de contaminação como ser humano cobaias bota oprime ele tem que anelar ou

se ligar especificamente ódio no seu DNA molde Para que ocorra a amplificação da sequência que você quer vai ter gente na Record nesse de DNA pode ter DNA contaminantes na sua mostra então pra ele não pode aplicar isso e tem que ser específico para região que você quer quanto maior o Primer maior a chance de se Prime ser exclusivo só que a gente tem que tomar cuidado com isso porque primos muito grandes exigem temperatura janelamento muito altas e já já eu falo que isso também vai ter repercussões na minha reação de PCR tá é perde-se

em média que oprime não seja menor do que de 15 pares de bases né a chance deles e anelar em locais inespecíficos ganhar muito grande a quantidade de guanina e citosina nesse Prime deve estar em torno de cinquenta a sessenta por cento tá porque é essa quantidade de guanina e citosina é interfere na temperatura de mel tinha o quê que é a temperatura de Melody é a temperatura na Qual metade do DNA está na forma de fita simples e metade ainda em dupla hélice e o que que é importante a temperatura de mel EA temperatura

de Melody Ela é super importante eu saber essa temperatura para que eu possa calcular a cultura de anelamento quer dizer a temperatura correta em que meus primos vão se parear com a fita de DNA morte então ela dependente da composição do DNA Quanto mais eu aumento conteúdo de guanina e citosina maior vai ser a minha temperatura de Melody e consequentemente maior a minha temperatura de anelamento tá porque aumenta o número de ligações de hidrogênio a gente tem que lembrar que guanina e citosina citosina e se tem três ligações Três Pontes de hidrogênio estão daí a

importância tá porque é estringência no processo de anelamento do primer a este ingerência é super importante ela vai determinar a especificidade no produto de DNA ser amplificado então por exemplo a temperatura de lamento é tão importante é um dos mais importantes dentre as temperaturas na PCR tá E ela vai acertar esse ingerência na minha lamento do praia era força com que esse primeiro vai se ligar fita molde se eu tenho uma temperatura de anelamento muito baixo isso é ruim porque o prime me ligar pode ligar em qualquer porção do DNA isso vai gerar sequências que

não são específicas sequências aleatórias de amplificar sequências aleatórias que eu não quero isso ela for muito alta pode nem ocorreu o movimento de ligação de pareamento tá então importante que essa temperatura de anelamento ela seja ótima temperatura de congelamento ótimo e eu sempre cálculo no momento do Prime design momento em que eu tô desenvolvendo meu Praia sempre tomando os cuidados com o conteúdo de guanina e citosina e também com concentrações de sais e tampa no mix de PCR e é e por fim gente os primos eles não podem parear com eles mesmos ou entre sírios

tem que lembrar que é um par de primes Imagina só se a sequência do DNA e complemento se a sequência do 11º é complementar então a gente tá vendo aqui é formação de um grampo tudo isso aqui é uma sequência de um trago tá e observe que a gente tem uma dentre as sequências tem áreas que são complementares olha citosina guanina guanina citosina timina adenina e assim por diante não forma se grampos comprar em que ele não se liga o DNA noite mas ele liga em si mesmo formado esses grampos ou pode formar o que

a gente chama de primer d'aimer em que o Word e o reverso né eles ligam entre si Isso é terrível porque eles contém também sequências complementares então isso deve ser evitado tá terminantemente evitado também E por quê Porque eu preciso que os pais ianelli na minha fita molde no Meu DNA molde não entre si E lembra que eu falei para vocês que existe Blast tudo então quando a gente vai desenvolver um primeira a gente tem que primeiro saber qual é a sequência do DNA e Geralmente as sequências ganhar que eu quero amplificar e essa sequência

estão todas disponíveis nude Mac e hoje bem que ele é um banco de dados de anotações de sequências de nucleotídeos e tão disponíveis publicamente para quem quiser acessar então por exemplo nas teses de mestrado e doutorado é muito comum que se publiquem se faça sequenciamento de determinadas regiões que antes não haviam sido é que não se conheciam né e o que que os pesquisadores fazem eles colocam essas sequências no dia dente inserem essa sequência de mim que nesse banco de dados Universal E aí todo indivíduo que quiser desenvolver por exemplo Prime uma PCR para específica

para aquele parasita é possível É nesse caso que eu tô mostrando pra vocês eu da Minha tese de doutorado em que eu fiz o sequenciamento das subunidades ribossômicas menor de diversos o seu lado do Só segura velho protozoário da intestino delgado Muito ruim paciência da ideais Então a partir de agora os pesquisadores que tiverem interesse em desenvolver primeiros para amplificação de área e para trabalhar você trazido mas sempre está lá disponível o que que eu faço o corpinho começa sequência nunca terminar sorte e faz para me dizerem E aí eu consigo né determinar exatamente a

eu delimitando as reconhecer que eu quero amplificar eu consigo desenvolver esses primas de modo a gente fala em cínico é utilizando os mesmo o utilizando o computadores de sorte está bom e quais são as etapas de uma PCR a PCR ela consiste de três etapas básicas a primeira processo de desnaturação do DNA molde a gente tem que lembrar que o template ou sem mod ele é uma dupla fica então primeiro a gente aquece aquela mostra aquele meu Mix contendo dele interpretar que meu Meu DNA os oligonucleotídeos e tudo mais como eu falei para vocês aquece

toda aquela que todo aquele toda aquela solução Para que ocorra a desnaturação da fita de DNA Para que ocorra a perda das ligações de Pontes de hidrogênio e posteriormente abaixamos a temperatura para que eu corro pareamento dos primes a sequência alta na fita simples e por fim aumentamos novamente a temperatura para que a taq DNA polimerase possa fazer a extensão dos primes e daí a fita de DNA possa ser produzida então a gente diz que é a PCR ela tem vários ciclos que se repetem tá ciclos de desnaturação de anelamento o clareamento de extensão são

vários vinte trinta siclos assim Para que ocorra o número eu tenho um número razoável de moléculas Para que ocorra essa amplificação então novamente a gente tem processo de desnaturação do DNA mods ocorre geralmente 94/96 graus Celsius rompem-se as pontes de hidrogênio né que ligou as fitas de DNA para que a próxima etapa possa acontecer Qual é a próxima etapa é o clareamento o pagamento dos primes com a fita simples de DNA a Atento e 37 65° tem que lembrar que essa temperatura é uma temperatura que eu disse em Fogo sendo melhor o melhor para o

prima e que eu desenvolvi ela ela não é única tá ela é específica para ver se r e para sequência para o primeiro que eu quero que eu desenvolvi e por fim a temperatura novamente aumenta Para que ocorra a DNA polimerase A Liga esse é o primo ele possa iniciar o processo de extensão né de inclusão dos dntps na nova fita que vai sendo formado então esses vão se repetindo e observe aqui por exemplo aqui é o meu DNA o meu template tá aqui ocorre o processo de desnaturação então a dupla fita de DNA se

torna fica simples Para que ocorra o processo de pareamento dos primas e por fim a extensão e ocorra a síntese de DNA Observe só que no 1º ciclo no primeiro eu tenho eu tenho a formação de duas moléculas de DNA de fita dupla no 3º ciclo eu vou ter 24 e assim sucessivamente dente de uma forma logaritmo após muitos e muitos ciclos por exemplo um número sei lá de 30 ciclos eu tenho o número absurdamente grande de moléculas de DNA do meu template tá e onde essa reação ocorre essa essa reação ocorre na máquina que

a gente chama de termociclador é o termociclador eu programo é esse termociclador da maneira que eu quero tá quantos minutos por exemplo 96 graus Celsius Quantos minutos a 65° Celsius Quanto quantos minutos a 72 processos e eu crio se quantos ciclos eu quiser ele é totalmente modificável né o para que eu possa verificar exatamente aquela molécula de DNA ou Desculpa aquela sequência de DNA específica E tu como é que é a cinética da PCR a cinética a pessoa ela tem primeiro uma frase que a gente chama de strini os primes eles têm muita facilidade para

encontrar o template DNA tá isso vai acontecendo de modo que essa fase inicial da PCR passa por uma fase exponencial o processo de amplificação tá no pico né Tá ocorrendo um grande quantidade com um grande acúmulo de públicos tá porque os primos à medida que os amplicons vão sendo formados os primos vão se ligando com muito mais facilidade eles estão próximos uns dos outros e eles conseguem se ligar com mais facilidade mas isso ocorre até um certo momento a gente observa que a partir de um número de ciclos ocorre o processo que a gente vai

de ouviram fiquei né um trator em que não há mais a verificação do meu ampli não há mais geração de amplico né E por que que não há mais geração de existem diversos estudos propondo n teorias para que eu como o prato mas se você acredita só a perda da atividade da DNA polimerase termoestável ela dura por exemplo até um número X de ciclos aqui a gente desse gráfico específico ele está mostrando uma PCR aqui no 30º ciclo já alcançou platô é as enzimas a gente tem que pensar que estão todas ocupadas também produzindo né

mas fitas de DNA e os produtos ali que vão se acumulando os próprios amplicons que vão se acumulando eles vão inativando em cima existe Claro gasto de reagentes né a gente tem íons a gente tem o tampão tudo isso vai sendo gasto lógico além da enzima né de modo que eu alcanço realmente na pessoa ela não ocorre de forma definida é a partir de um momento eu não consigo mais não ficar moléculas os meus anos que as minhas moléculas de DNA e por isso que aqui o número de ciclos também ele é limitado tá Tá

bom uma vez que ocorre a PCR que eu consigo os meus que eu faço aqueles n simples né de desnaturação de ligação dos primeiros a mulher e por fim a extensão é como é que eu vou conseguir ver meu esse amplo com Acabou a minha PCR E aí como é que eu consigo ver os meus amigos com suas moléculas de DNA que foram amplificadas ou mesmo fragmentos resultantes de gestão de DNA desse material que são amplificados e já já eu falo para vocês é por meio de eletroforese que que é uma eletroforese eletroforese um processo

permite a separação a identificação quantificação e qualificação de moléculas com cargas em uma matriz devido a diferença de potencial elétrico então perai o DNA ele tem carga sim ele tem carga os DNA essas moléculas de DNA tem carga negativa devido aos radicais postar Então coloque sempre esse médio DNA é uma molécula de carga negativa tem que ela se sempre quando eu coloco ela em eu coloco as moléculas submeto as moléculas de e a um potencial elétrico elas vão sempre me migrar em direção a carga positiva tá e nós temos diferentes tipos de gel de agarose

gel poliacrilamida que são utilizados de acordo com o meu interesse o meu interesse ali no o tamanho do meio da minha molécula de DNA quando a gente tem uma molécula de DNA muito grande por exemplo com 1.000 2.000 pares de Base é melhor que ocorra gel em agarose quando eu quero fazer quero observar fragmentos muito pequenos por exemplo numa digestão de DNA e que eu quero segmentos sempre ativar a 50 pares de base ou 200 para de base eu quero visualizar fragmentos menores o ideal é o gel de poliacrilamida tá porque ele me dá uma

resolução maior é como se o gel de agarose tivesse uma Trama mais frouxa e o de poliacrilamida uma uma gama mais apertado eu consigo uma maior resolução quando comparada ao gel de agarose é e como é que é feito o gel de agarose né é o agarose você compra essa relógio que eu vim pro vem mesmo de alga mesmo é Eduarda era né e ele é um pó então eu dissolvo esse Pó em um tampão pro meu tampão geralmente o meu tampão decorrida eu faço isso leva para o meu levo para o micro-ondas porque ele

precisa ser aquecido ou como aquecedor aquecedor e precisa ser aquecido para que ele possa se solubilizar e depois quando ele chega mais ou menos a uma temperatura que a gente disse que quer 38 87° eu coloco na minha plaquinha de eletroforese é Geralmente eu coloco uma fita adesiva aqui e um lado e de outro e coloca o meu gel ali assim material né que ainda vai estar líquido aqui espera um tempinho aí eu coloco também o pente porque ele que vai me dar as canaletas já já eu mostro mostro para vocês que uma É ele

que vai ter as canaletas e as canaletas aqui vão ser importantes para formar a postos onde eu vou aplicar Meu DNA Tá bom uma vez que se der esse gel se solidifica eu retiro essa esse pente Retiro isso essas fitas que eu coloco aqui geralmente fitas adesivas aí eu tenho meu gel E aí eu já posso vir comer o tampão de corrida quer colocada na cuba né o gel de corrida e já posso aplicar a minha mostra vó e qual a porcentagem de agarose que eu faço você falou que é tb é por exemplo que

é um tampão juntamente com o com agarose uma quantidade de agarose vai depender do tamanho da molécula de DNA que vai correr ali Ah então quando você quer por exemplo é um fragmento sei lá de 200 para de base você pode usar uma garota é você pode usar uma solução de agarose tb é a um e-mail por cento por exemplo tá e vamos lá isso quanto menor o vento Mas eu tento concentrar minha garoze quanto maior fragmento menos concentrada essa garota precisa se e é sempre bom a gente lembrar aqui essa Cuba né de eletroforese

ela vai ser ligada ao na fonte é a gente vai ter o cátodo eo ânodo EA gente pode a gente coloca potencial né liga essa fonte o meu DNA ele vai migrar da canaleta pelo gel em direção ao ano eu aqui determinam Por quanto tempo eu vou querer fazer a corrida e como é que eu visualizo as moléculas de DNA então eu vou no Gel eu vou visualizar como a coloração específica por exemplo aumento de etídio o brometo de etídio é uma solução que você também compra e você o pode colocar direto no tampão de

corrida Antes de ligar a fonte antes de fazer o tampão de corrida ou você pode aplicar ou você pode curar depois posso fazer a coloração do céu depois tá aí Eu submeto essa esse meu esse meu gel a uma luz o ver um transiluminador Tá vendo como a pessoa tá fazendo aqui é nosso ver E aí eu consigo ver as minhas bandas perfeitas Como estão aqui coradas com brometo de etídeo geralmente né é a gente a gente também corre junto com as amostras o marcador molecular um controle positivo controle negativo da reação marcador molecular é

ele ele é um e é também um produto que você compra e ele tá vendo ele me dá essas diferenças de Várzea Olha aqui eu sei que assim para de base 200 300 400 500 e assim por diante a existem marcadores moleculares de diferentes que me dá os diferentes graus de diferença entre uma bandinha e outro e vamos falar um pouquinho agora sobre as técnicas em si sobre as técnicas de PCR agora que a gente viu como a PCR funciona como eu visualizo o meu DNA que são amplificados quais são as variações da técnica de

PCR porque o diagnóstico molecular e se baseia grandemente nessas variações da técnica de PCR né primeira delas que eu quero falar com vocês sobre a PCR Multiplex e que a PCR Multiplex nada mais é do que a amplificação de uma sequência alvo né e uma única reação de PCR utilizando mais de um par deprime mais um par de praia é muito interessante Então eu posso utilizar três quatro cinco pares de Prime e amplificando o diferentes regiões numa única reação garante quase cem porcento de especificidade a menos chance de dar falso negativo a cor amplificação dos

aulas vai ser grandemente dependente da temperatura de mel chinelo e a cor e consequentemente da temperatura de alinhamento dos primes uma vez que eu uso vários pares de primaz eu preciso pensar e precisam ter temperaturas de anelamento muito semelhantes muito próximas tá visto que a reação é uma só e vão gerar amplicons de tamanhos distintos Que importante para o diagnóstico ou então como no caso desse aqui ó essa que a gente tem uma PCR Multiplex para detecção de diferentes genótipos do HPV de linhagens de HPV tipos de HPV porque se tem alguns que tem característica

oncogênica e outras não perdiam com gênio outros não então nessa técnica por exemplo eu consigo amplificar um dois três quatro eu posso amplificar DNA de 5 tipos diferentes de HPV utilizando cinco pares de primas diferentes por exemplo se eu usar esse primeiro prédio primeiro aqui ó que é específico ficou para o hpv16 eu vou tempo indicação de um de um fragmento de DNA de duzentos e dois pares de base Se eu por exemplo utilizar esse segundo parte de Prima esse aqui eu vou tempo de ficar são de uma outra linhagem de HPV com 279 para

de base Então se o indivíduo estiver com e por exemplo eu consigo detectar Com certeza você vai ter por exemplo a purificação se tiver dna-molde amplificação por exemplo dessas duas esses dois tipos de sequências correspondente esses dois tipos de HPV sem que eu tenho que fazer reações separadas está no mundo me que vocês tem que pensar também economia por exemplo aqui olha esse gel que que eu consigo ver um gel de agarose em que eu consigo observar diferentes amplificações tá vendo aqui ó aqui aplicou um fragmento de 150 154 para de base então refere-se ao

HPV linhagem 33 aqui na segunda é eu tinha uma mostra com que o amplificação de um de uma de uma sequência de duzentos e dois pares de base 202 de pares de base representa uma HPV 16 e eu tenho por exemplo essas seis em que eu tenho a amplificação de cinco linhagens de HPV diferentes numa mesma amostra tá vendo isso gera pro laboratório 1 ó e aqui a gente observa o marcador molecular ele ele então me dá a eu vou saber mais ou menos o tamanho dos fragmentos que foram amplificados tá então como eu sei

que esse marcador molecular at 100 pares de base tô aqui eu tenho 100 200 300 é dessa forma que aquele que ele vai crescendo tá então eu tenho aqui ó 100 200 300 400 500 600 parte de baixo então o mais próximo de sem o 154 para de barras 202 para de base por por fim e que eu quero que vocês Observe fragmentos menores no Gel Eles Eles correm é a uma velocidade maior que fragmentos maiores são fragmentos maiores vão estar sempre mais próximos da canaleta aonde eu onde eu apliquei o meu DNA e só

mais pesados emigram menos rapidamente fragmentos mais leve fragmentos menores são mais leves milho mais rapidamente no objeto tá e isso é válido tanto para gel de poliacrilamida quanto o gel de agarose uma outra uma outra técnica é muito útil é a nest the PCR a nesta de pessoa é basicamente você faz uma PCR depois uma outra PC está uma PCR da PCR primeiramente na primeira pessoa que você sempre fica um fragmento dinâmico mais abrangente por exemplo fragmento mais aleatório de 1000 pares de bases 750 para de base como tá aqui no meu exemplo né 750

pares de base aí eu faço uma segunda PCR Mas em vez de utilizar o utilizo como DNA molde o produto desta PCR que eu pego um pouco um pouquinho desse Daniel molde e utilizo para amplificar novamente aí eu vou utilizar para áreas internas que a gente diz tá praia mas que vão amplificar um fragmento muito mais específico e consequentemente menor aumenta muito a eficiência da reação de urgente muito porque vamos vão imaginar que é eu tenho Meu DNA molde eu fiz a extração de DNA numa mostra mas eu sei que é pouco DNA que eu

tenho nessa mãos então o que que eu faço eu faço primeiro amplificação de uma região mais inespecífica por exemplo um gênio da sua unidade ribossomica menor é um gene maior E aí depois eu vou e como eu vou faço como eu faço uma PCR daquilo lá eu vou ter milhões de cópias daquele Meu DNA então eu pego ele eu sei que a minha sequência que eu quero tá bem dentro dessa sequência grandona que eu abri fiquei na primeira pessoa é então o que que eu faço eu faço uma nova até CR dela claro né gente

utilizando outros para mim as outras condições reciclagem tá E aí eu consigo amplificar um fragmento menor e mais específico e aqui um exemplo de nesta de PCR em que eu tenho a detecção de um vírus que causa anemia em aves tá então aqui a gente tem a pessoa R1 e aperte R2 lá psr-1 é amplificado um fragmento mais inespecífico observa que aqueles fazem diluição do DNA eles fazem várias reações de PCR diluindo dna-molde aquele DNA que eu extraído a amostra né para obter uma quantidade um DNA mas mais limpinho tá vendo que é que vem

tem muita mostra em cima que não é não para ficar só muito mais inespecífica né E aí o que que ele faz eu pego esse gel eu pego esses a bandinha aqui como que eu pego professora eu pego por exemplo eu tá vendo aqui assim divido para fazer de Exatamente isso ele é com esse se você utiliza o objeto cortante tá gente para poder cortar o gel gel de agarose ele é muito fácil de ser manipulado E aí você ainda enquanto o gel tá no ultravioleta você corta a banda de interesse que você quer tem

que ser rápido e urgente porque a ultravioleta ela degrada o DNA Então tem que ser algo bem rapidinho e aí depois você pega você pegou essa bandinha você consegue purificar essa banda do Gel tá ficar só com DNA Zinho assim kit de purificação específicos para isso tá é basicamente isso tudo feito com tubos tá é muito interessante só com processo de centrifugação mesmo é muito interessante aí você consegue o seu DNA ali o líquido Zinho contendo o seu ganhar aí você utiliza aquele líquido Zinho para fazer a segunda PCR E aí você vai ter muitas

moléculas-alvo né porque provém de um muito Muitas moléculas é amplificadas né gente por dentro da primeira pessoa é então você tem a chance o motivo na segunda pessoa é muito grande a e o que que ele quer mostrar aqui também aqui eu consigo na primeira PCR limite de detecção dela é 10 mil moléculas de DNA eu preciso ter pelo menos nenhum moléculas de DNA naquela minha mostra para que possa haver amplificação da segunda terça RNA Olha só eu tenho uma única molécula de DNA eu consigo a amplificação to Observe como tem aumento de sensibilidade técnica

também tá outra técnica outra variação da técnica de PCR que agora acabem famosa na verdade sempre foi famosa muito útil mas agora com o advento do convite né gente ficou vídeo é um vírus de RNA é a técnica muito utilizada uma técnica de biologia molecular muito utilizado para você atenda unificação de DNA de vírus né como que ocorre a primeira coisa que eu tenho que fazer é transformar o RNA em DNA o RNA a gente que essa transformação DNA ainda é feito com a transcriptase reversa tudo esse vidro tá e o é obtido do RN

é chamado de DNA complementar é o DNA que provém do nexo onde a gente basicamente só de um ex E aí depois eu feito isso feito essa primeira reação aí sim eu faço a reação de percebe porque eu vou ter Meu DNA alvo E aí eu faço um normalmente uma reação de PCR isso aqui tudo gente pode ser feito tanto numa reação só quando separadamente tá em dois estudos separados por cento fazendo primeiro processo de hospitais reversa como fazendo tudo junto então como é que é combina a síntese do DNA complementar a partir de tipo

template DNA mensageiro quer dizer olha a minha mensagem que eu tenho é base que eu tenho ali na minha morte Então a primeira coisa que eu vou fazer utilizar a transcriptase reversa para Que ela possa ela vai fazer essa essa essa reação vai transformar o meu r a mensagem dele a complementar E aí eu simplesmente tem do DNA eu faço simplesmente uma PCR tá importante também por exemplo para detecção de água cerveja né e assim por diante a outra variação é a pcr-rflp é análise de polimorfismo e fragmentos de restrição base embora o nome seja

bem complicadinho É simples é quando eu pego aquele Meu DNA amplificado e submeto ele é digestão com endonucleases de restrição o que que são endonucleases de restrição essas endonucleases de restrição são enzimas que obtenho de bactérias Olha que interessante e são purificados de bactérias existem diferentes tipos tá de enzimas de restrição e ela e elas me clivam o DNA me quebram DNA em porções específicas tá ai professora mas como é que eu sei em que lugar do meu Daniela vai crivar você pode fazer o que a gente chama de mapa de restrição da sequência que

você tem de interesse um presente aí eu lembro que fiquei a sublimidade do Sol nunca menor do meu é de um parasito tal e agora eu quero obter e o mapa de restrição quer dizer quais enzimas de restrição eu posso usar aqui existem também sorte o específico estar gente para isso e já fazem a escolha das enzimas que você pode utilizar as reações e o tamanho dos experimentos que vão se formando tá Então olha só que interessante esse exemplo É nesse exemplo aqui que eu acho muito interessante o que que eu tenho eu tenho um

segmento de DNA de 42 quilos bases 42 mil pares de base e eu vou digerir esse meu fragmento que foi amplificado com duas enzimas Qual é a cor R1 e com a XX Val e aí Val desculpa quando eu faço a digestão desse meu fragmento com a eco R1 é vai ocorrer que várias enzima ela clima o meu DNA em Pontos específicos de modo geral fragmento que tenha 10 mil pares de base 2018 pares de base porque 18 se o que você vai aqui ó esse fragmento tinha aqui tem 28 - 10 18 pares de

base e por fim 14 pares de bases 14.000 para de base 42 - 28 da 14 então a digestão apenas com R1 vai me dar três fragmentos um de 10 mil pares de base outro de 18 mil pares de base ou e 14.000 para de fazem somar o tamanho desse três para mim assim que tá 42 mil pares de bar certo é que eu vejo isso no Gel uma digestão de um fragmento de 42 kilobases Belenzinho R1 eu tenho que encontrar um fragmento de 10 cabe vamos ver onde que tá o outro desce cabelo tá

aqui correndo gel 10 cabelo depois um de 18 KB Oi desculpa antes tenho de 14 minhas tem que do menor para o maior de 14 acabei perfil de 18 cabelo aqui estão três fragmentos é quando eu faço a digestão desse meu esse Meu DNA apenas com égua ruim tem esses três polimento lembrando sempre que quando eu coloco a minha amostra digerida evocou o gel é as amostras menores corre mais rápido que as maiores por isso que eu tenho que fazer isso 10 14 e 18 certo e quando eu faço a digestão apenas com em cima

de baixo sal um essa enzima ela vai clivar o meu DNA em 12 gerando um dois três quatro fragmentos certo são três sítios de restrição são três locais em que as enzimas age nela clivam o DNA gerando quarto para mim mente o primeiro fragmento se vocês concordam do zero aos seis então vai ser 6 cabeça 6 mil pares de base certo o segundo fragmento e vai ser 18 - 6 18 - 6 12 KB o terceiro fragmento ter 38 - 18 ou seja 20 acabei e o último fragmento 48/42 - 18 que vai dar se

eu não me engano quarto acabei então quando eu faço a digestão desse meu fragmento de DNA com essa em cima botei quatro fragmentos sendo o primeiro de quatro cabelo que ele é o mais rápido vai migrar primeiro tá aqui o segundo de 6 cabeça é esse fragmento Zinho aqui o terceiro fragmento de 18 cabelo vão ver onde ele está com a desculpa de 12 deixa eu ver que é 18 - 6 12 é esse ali mentindo aqui ó 18 - 6 12 e o último fragmento de 38 - 18 que é 20 Capitão vamos lá

vim de cabeça então tá aqui o fragmento de quatro esse fragmento É esse aqui um fragmento de 6 que é exatamente esse fragmento aqui um fragmento de 12 que é esse 18 - 6 e um fragmento de 20 que é esse aqui maior e por sim que tem como é maior ele negra mais lentamente de 20 cabelos é esse último exemplo aqui eu vou deixar para vocês fazerem como tarefa de casa que que eu tô fazendo aqui eu tô fazendo a digestão do Meu DNA com quantas enzimas diferentes duas enzimas diferentes Observe quantos sítios de

restrição a gente vai ter um dois três quatro cinco será quantos pigmentos de ganhar que tamanho esses fragmentos vão ter em vou deixar por conta de vocês vocês que vão me contar e a gente tem n Olá Kitty desenvolvidos né baseados na técnica de PCR rflp por exemplo para na carcinogénese para detecção de genes que são de polemistas que leque são que já se sabe que tem potencial carcinogênico para o mesmo diagnóstico tá Para o diagnóstico doenças infecções parasitárias como por exemplo sei a giárdia é possível você tem linhagens de haja o próximo exemplo que

eu vou mostrar para vocês aqui é de helicobacter pylori também né e assim por diante então sério aqui estão as referências dos artigos né Foram em que as técnicas foram descritas e é Ah eu achei que eu tivesse o gene aqui desculpa eu achei que eu tivesse dado um exemplo lembra da da PCR rflp e amostras de Jardim mas o que ocorre é o seguinte existe um vídeo já disponível aí para ver ainda em que você consegue detectar Qual qual é o tipo de qual o genótipo da mostra que tá limpo dia de giárdia por

isso é importante do ponto de vista tecnológico tá gente algumas diários têm potencial zoonótico outras não porque algumas dias de inseto animais e um homem outra só o homem então só tem mais a pessoa psicológico tá é importante por esse fim e também alguns kits de PCR rflp em que eu consigo diagnosticar por exemplo diferentes parasitos utilizando uma única amostra ficar utilizando o DNA extraído de Uma música nossa ficar você é muito importante né Isso é muito interessante eu também pela questão de tempo do indivíduo né enfim e canalizando três amostras em dias separados você

pega a sua mostra ali dentro DNA Você já faz análise do seu material todo de uma vez é muito muito prático bom que que eu gosto de falar também é com relação a biologia molecular a gente tem que pensar que até as técnicas de biologia molecular ela se envolvem uma um certo padrão você não pode fazer técnicas técnicas de biologia molecular em qualquer lugar numa salinha só não pode antes de áreas específicas por exemplo para poder fazer a extração do DNA uma área específica para fazer o mixer PCR uma área específica para que você possa

tem ao processo de termociclagem onde esteja os seus termos secadores todos ali uma área específica para fazer a transferência desse seu material tá é preciso que seja um áreas separadas porque a chance de contaminação muito grande lembra que quando a gente faz a PCR a gente tem há milhões bilhões né de moléculas de DNA imagina se isso por exemplo cai no chão ou uma pequena quantidade de se percebe essa mostra fica na luva de alguém né e sai contaminando aí é maçanetas pipetas e assim por diante então é super importante que áreas que a gente

chama de áreas mais limpas não tiver ocorrer extração de DNA e nas demais você utilize luvas separadamente jaleco separadamente nunca nunca nunca você leve materiais né reagentes ou o equipamentos de uma área para outra cada área tem que ser separada área de extração a área para fazer um mix e a área de Bom dia amplificação de correio gel Elas têm que ser áreas separadas que depois para você fazer a descontaminação dessas áreas é muito muito difícil que são moléculas e mais moléculas de DNA você não é impensável por exemplo você é por exemplo ai no

mesmo dia você quer fazer extração de DNA e daí fazer até uma ciclagem perfeito tá mas você tem que lembrar você pode fazer mas você tem que ter muito cuidado de utilizar jaleco diferentes uvas diferentes nunca passar de um lugar para o outro nessas nessas Salinas Tá e por exemplo aí eu preciso de mais DNA molde para fazer a PCR aí eu tava lá na minha na minha área de Mix Eu uso aquele jaleco vou com a mesma luva lá para onde ocorre os processos de extração na geladeira da salinha de DNA distração aonde eu

tenho Meu DNA extraído jamais você vai fazer uma coisa você não pode fazer você tem que utilizar Tudo limpo tudo novo tá jaleco diferente tudo para poder e o ideal que é um dia que você passou por todas essas áreas nesse sentido sempre né como eu disse para vocês sempre Nesse estilo você vai para casa lava tudo tá montando um tom Tome um belo banho para ir depois voltar aqui nem tente fazer termociclagem e no mesmo dia tentar extrair DNA tá isso não deve ser feito que a chance de contaminação é durante Você pode ter

moléculas de DNA no corpo tá isso você não consegue visualizar e se você for acaso contamina uma área dessa é bem difícil processo de descontaminação torrent é o assunto o quanto quando eu falo de PCR uma aula de PCR poderá ser dado uma aula poderia falar duas horas aqui só de PCR e otimização para vocês ao mesmo tempo eu poderia falar das variações da PCR cada variação de uma aula só né então eu tenho três Umarizal máximo que eu consegui para que tudo ficasse claro né pra vocês mas eu sei que o assunto é vasto

eu coloquei aqui várias referências eu espero que vocês estudem bastante para essa parte de biologia molecular que é fantástico é fascinante mas exige também bastante estudo para prova que você possa entender as técnicas é e não adianta você fazer a técnica seu entendimento dela não faz sentido algum e a gente se vê na nossa próxima aula tá bom um forte abraço e eu tô disponível para vocês para qualquer dúvida