En la clase de hoy vamos a analizar la segunda parte de la unidad conceptual que trata sobre la regulación de la expresión génica. Y en esta clase nos focalizaremos en los niveles postranscripcional, traduccional y posttraduccional. Para comprender mejor cuál es el foco de la clase y qué es lo que suma esta clase número cinco a la clase anterior, hagamos una breve recapitulación de lo que hemos visto respecto de la regulación de la expresión génica.
En la clase anterior nos focalizamos en aquellos pasos iniciales de la expresión génica. En particular vimos como el grado de condensación de la cromatina regula la accesibilidad de la maquinaria transcripcional y a esta a los mecanismos que controlan el grado de condensación de la cromatina. Los denominamos en su conjunto regulaciones pretranscripcionales y también vimos los mecanismos que regulan el inicio y la frecuencia de la transcripción misma.
Estos mecanismos eh los explicamos en términos moleculares mediante un conjunto de elementos entre los cuales se destacan el rol de los factores específicos de la transcripción. Estas proteínas que tienen la capacidad de unirse al ADN en conjunto con otras proteínas que se unen a ellos denominados correguladores, pueden reclutar a sitios específicos del genoma a modificadores epigenéticos, por ejemplo, complejos modificadores de histonas que las pueden acetilar, desacetilar, metilar o desmetilar y complejos remodeladores de la cromatina que pueden movilizar algunos núcleos exponiendo segmentos específicos del ADN. Dependiendo de si el sitio a donde se unieron estos factores específicos de la transcripción, sean potenciadores o enhancers por un lado o silenciadores por otro, tendrán un efecto positivo o negativo sobre la formación del complejo del inicio de la transcripción y aumentarán o disminuirán respectivamente la frecuencia de inicio de la transcripción.
Recordemos que la RN polimerasa 2 no solo necesita reconocer molecularmente el promotor teniendo la zona de la cromatina laxa en el sitio del promotor de un gen determinado, sino que necesita de señales moleculares adicionales para pasar de ese estado inactivo, aunque posicionado en el promotor, a un estado activo. En síntesis, estos procesos que analizamos la clase anterior nos permitían pensar en un aspecto particular de la regulación de la expresión génica, aquel en donde lo que se está regulando es el nivel, es decir, la cantidad de un producto génico. El resultado de esos procesos era si un gen se iba a expresar o no y cuál era la frecuencia con la que ese gen iba a transcribirse, impactando en la cantidad del producto génico.
A diferencia de eso, vamos a complejizar algunas cuestiones en el seminario de hoy. En primer lugar, vamos a analizar algunos puntos diferentes de la regulación de la expresión génica posteriores a la producción. Eh, al inicio de la transcripción, por ejemplo, vamos a analizar los mecanismos de procesamiento de la RN y su exportación al citosol.
Vamos a estudiar con cierto detalle los mecanismos que regulan la estabilidad del RN y finalmente vamos a estudiar mecanismos que regulan la estabilidad y la actividad de las proteínas. Esta clase va a estar focalizada en aquellos genes que codifican para proteínas. Es decir, que los ARN cuyo procesamiento y regulación vamos a analizar son fundamentalmente ARNs mensajeros.
Me gustaría subrayar, ya que vamos a analizar con bastante detalle algunos mecanismos centrados en las moléculas de ARN, algunas propiedades biológicas de estas moléculas que las distinguen de otras biomoléculas de las células como las proteínas y el ADN. En primer lugar, a diferencia de la molécula de de las moléculas de ADN, que son muy estables, las moléculas de ARN son lábiles. Esto significa que se degradan con facilidad, tanto dentro de la célula como por fuera cuando se hace un procedimiento experimental de extracción de ARN de las células.
Por fuera de las células, las moléculas de ARN son muy sensibles, se degradan con facilidad ante cambios en el pH y la temperatura, por ejemplo. Y dentro del interior de las células son sustrato de un conjunto amplio de enzimas dentro de las células que se denominan eh nucleasas de ARN. Estas nucleas pueden ser exonucleas, es decir, pueden degradar a las moléculas de RN a partir de sus extremos.
Hm. despolimerizando los ribonucleótidos que las constituyen. Y estas son las enzimas más abundantes, pero también hay algunas endonucleas, es decir, enzimas que pueden romper los enlaces entre los nucleótidos, los enlaces fosfodiéster entre los nucleótidos, aún por fuera de los extremos de las moléculas.
Otra propiedad de las moléculas de ARN es que si bien en los libros de texto tendemos a eh tienden a ser representadas de manera lineal huciones acuosas y dentro de las células, las moléculas de RN adoptan conformaciones tridimensionales complejas. Y esta aquí vemos en esta diapositiva un ejemplo de un ARN lineal. pero que ha adoptado esta configuración tridimensional compleja, formando, por ejemplo, enlaces complementarios hm en intracatenarios, en aquellos sectores en donde se forman esos enlaces intracatenarios.
Hm. Por ejemplo, las adeninas eh de una molécula de ARN lineal pueden formar enlaces complementarios con uracilos presentes en otra parte de la molécula y así sucesivamente. Y aquellos tractos en donde se forman estas enlaces complementarios tienden a adoptar una forma hiloidal.
Esta propiedad de adoptar una forma tridimensional compleja nos permite comprender cómo dentro de la célula se produce un reconocimiento específico entre las moléculas de ARN y las de otras proteínas. Hm. Recordemos, por ejemplo, que el reconocimiento molecular proteína a proteína se basa en la complementariedad de formas tridimensionales.
Hm. Un ejemplo es la complementaridad que existe entre muchas enzimas y su sustrato. Algo análogo, esta complementaridad tridimensional también se da entre proteínas que tienen la capacidad de unirse a determinados ARNs y la forma tridimensional particular de estos.
Pero no solo las moléculas de ARN tienen la capacidad de unirse a proteínas específicas gracias a esta forma tridimensional que poseen, sino que también pueden unirse a otros ARNs o a moléculas de ADN mediante complementariedad de bases. Es decir, dos principios físicoquímicos distintos permiten a las moléculas de RN reconocer molecularmente, por un lado, las proteínas y, por otro lado, a otros ácidos nucleicos. Analicemos en primer lugar el procesamiento del ARN mensajero eucariota.
Se denomina procesamiento o maduración de la RN al conjunto de modificaciones que sufre el transcripto primario, el producto de la transcripción de la RN polimerasa 2, hasta convertirse en el transcripto maduro, que es el ARN mensajero, listo para ser exportado al citosol. Este procesamiento consta de tres pasos moleculares. La modificación del extremo 5 prima de la RN.
El extremo CCO prima es está ubicado en el primer nucleótido que introduce la RN polimerasa en el transcripto en producción. Luego el corte y empalme de exones, un proceso conocido por su nombre en inglés splicing y el y la modificación covalente del extremo 3 prima, que es el extremo final del ARN. A pesar de mencionarlos de manera secuencial, estos tres pasos moleculares del procesamiento de la RN eucariota no son posteriores a la producción del transcripto primario, sino que los hallazgos durante la década de los 80 y de los 90 en el ámbito de la investigación permitieron determinar que todos estos pasos moleculares de procesamiento sonranscripcional.
ionales ocurren al mismo tiempo que la RN polimerasa 2 está transcribiendo activamente el transcripto primario. En este esquema podemos observar el resultado de manera esquemática, el resultado de muchos años de investigación en donde pudo determinarse, por ejemplo, que las enzimas y proteínas que catalizan cada uno de estos pasos del procesamiento se encuentran asociadas efectivamente a sectores de la RN polimerasa, por ejemplo, las enzimas. Aquí podemos ver a las enzimas que van a realizar el proceso de capping y a las enzimas que van a ser eh el procesamiento de splicing y a las que van a modificar al extremo tres prima asociadas al dominio carboxiterminal fosforilado, que era característico de una RN polimerasa en activa transcripción.
Comencemos entonces con el primero de estos procesos, la modificación del extremo 5 prima que se denomina capping en inglés o agregado de la caperusa en español. Es una modificación covalente de uno de los extremos de la RN. Observamos en el sector izquierdo de la diapositiva la representación molecular en vertical y en celeste de un ARN mensajero.
Hm. El primer nucleótido, el extremo 5 prima, resultará ser modificado por el agregado, por la unión covalente de un nucleótido modificado, pero que a diferencia del resto de los nucleótidos que se unen en un sentido 5 prima, tres prima, es decir, con una vinculación entre carbonos particulares de los azúcares de los ribos nucleótidos. En el caso del CAP, la unión es 5 prima a CCO prima.
Hm. Y otra alteración respecto de los nucleótidos usuales es que este nucleótido, que es una guancina, se encuentra metilada en una posición particular de su anillo nitrogenado. Hm.
Los transcript de siete metil guanoina pueden ser reconocidos molecularmente por un conjunto de proteínas denominadas complejos de unión a la caperusa. CBC por sus siglas en inglés, cap binding complex. Y el efecto que tiene el agregado de esta armazón proteico en el extremo cinco prima del mensajero es proteger ese extremo de la degradación por las abundantes exonucleas dentro de la célula y también, como veremos en breve, permitirá la correcta exportación del ARN a través de los poros nucleares y posteriormente también participará del reconocimiento de la maquinaria de la traducción.
H analicemos la modificación del otro extremo del transcripto primario, del extremo final. H dentro de la secuencia génica que está transcribiendo la RN polimerasa, aquí podemos ver en celeste el transcripto primario que está siendo producido por la RN polimerasa utilizando como molde las secuencias génicas. Dentro de la secuencia génica que va a transcribir la RN polimerasa, hay una secuencia que quedará plasmada en el ARN del transcripto, que es A a Aa U a A a Aa.
Esta secuencia de ribonucleótidos es una señal de corte y poliadenilación que será reconocido por enzimas que estaban viajando en el dominio CTD fosforilado de la RNA polimerasa y van a catalizar un corte un clivaje del transcripto primario que está siendo producido por la RN polimerasa. La RN polimerasa seguirá transcribiendo algunos eh cientos de nucleótidos más, pero ese ARN adicional que genere la polimerasa es frecuentemente degradado. Ahora bien, luego que se produce el corte o clivaje justo por debajo de esta secuencia de clivaje y poladenilación, otra enzima denominada eh poliapolimerasa va a adicionar cientos de nucleótidos de adenina en este extremo final del transcripto.
Notemos entonces que esta cola de polia, este tracto de adeninas, no estaba codificada en el genoma, sino que es agregado por una enzima que polimeriza en ausencia de molde. Está tracto de cientos de moléculas de adenina es reconocido por un conjunto de proteínas denominadas proteínas de unión a la poli o polie binding proteins que nuevamente protegen ahora el extremo tres prima de la acción de exonucleas y van a permitir la correcta exportación y el reconocimiento de la maquinaria transduccional, es decir, tanto la modificación del extremo 5 prima como del extremo 3 prima convergen en las funciones que cumplen, aunque los mecanismos moleculares que las producen sean distintos. Analicemos ahora la última de las modificaciones eh de procesamiento que sufre el transcripto primario, el corte y empalme de exones o como se lo conoce en inglés splicing del RN mensajero.
Para comprender este último tipo de procesamiento, debemos advertir que los genes eucariotas son discontinuos. Este hallazgo producido en la década de los 70 sorprendió a la comunidad científica que venía trabajando hasta ahora para comprender los mecanismos de expresión génica con sistemas procariotas en donde los genes son continuos. ¿Qué significa exactamente que los genes eucariotas sean discontinuos?
Significa que las secuencias que están presentes en el transcripto maduro, en aquel que va a ser exportado el citosol, no se encuentran de manera continua y lineal en el genoma a partir del cual se produce el transcripto primario, sino que esas secuencias se encuentran fragmentadas y dispersas, interrumpidas, si se quiere, por otras secuencias de ADN. que no van a estar presentes en el transcripto final que va a ser exportado al citosol. Por convención, aquellas secuencias del ADN que finalmente estarán representadas en el transcripto maduro se las denomina exones.
Y a las secuencias entre los exones que serán removidas durante el procesamiento y por ende estarán presentes en el transcripto maduro final, se las denomina intrones. Algo notable es que los exones suelen ser en general mucho más pequeños que los intrones. Hm.
De modo tal que los exones representan una proporción minoritaria en la secuencia total de ADN. ¿Cómo es este proceso de remoción de intrones? Es un proceso molecular que también fue comenzado que se comenzó a comprender durante la década de los 70, pero avanzaron las investigaciones a la década posterior para lograr descifrarlo de una manera más completa y debemos tener en cuenta para comprender lo que es un proceso altamente preciso en términos moleculares.
Notemos que implica el clivaje, el corte de eh los enlaces covalentes en dos puntos de la secuencia del transcripto primario y la unión posteriormente de dos exones que estaban separados antes por un intrón. Notemos que si este proceso se produjera, por ejemplo, por un error molecular de un único nuucleótido, esto tendría consecuencias negativas para la célula, porque esto probablemente produciría una alteración en cómo se leen los codones en el proceso de la traducción, luego en el transcripto primario. Por eso, una pregunta que se hacía la comunidad científica durante los años 70 y 80 es, ¿cuál es el proceso molecular que permite remover los intrones y unir los exones con tanta exactitud?
Y parte de la respuesta es que se han encontrado que secuencias en el transcripto primario, hm, denominadas secuencias con senso del splicing, van a guiar a la maquinaria molecular que va a ejecutar estos pasos de corte y empalme. Estas secuencias con senso del splicing se ubican fundamentalmente en tres sectores. en aquella región que está en la interfaz entre el exón y el intrón, un sitio que está hacia el extremo 5 prima del transcripto.
Lo llamaremos sitio dador del splicing o sitio 5 prima. Otra secuencia que está también en la interfaz entre el intron y el exón posterior, que denominaremos sitio aceptor del splicing o sitio 3 prima y nucleótidos que están en el interior del exón que se denominan sitio de ramificación. Hm.
Estas secuencias, como yo les decía, van a reclutar a la maquinaria molecular que va a ejecutar los pasos de ruptura y formación de nuevos enlaces covalentes característicos del splicing. Justamente lo que se descubrió en los años 80 fue que esta maquinaria puede hacer este trabajo con enorme precisión por su composición molecular. Estamos hablando de un conjunto de proteínas asociadas a RN pequeños que en conjunto se denomina el spliciosoma.
A las moléculas que se componen por ARNs y proteínas que forman un complejo funcional entre ARns y proteínas, se las conoce como ribonucleoproteínas y es un conjunto de ribonucleoproteínas las que conforman el spliciosoma. Hay un total de cinco ribonucleoproteínas. Cada una de ellas va a estar unida a un pequeño RN denominado ARN pequeño nuclear.
Sns, por sus siglas en inglés, small nuclear arns. H. Aquí observamos, por ejemplo, una de estas ribonucleoproteínas h que por estar asociadas a RN pequeños se las denomina en inglés SN RNPs, small nuclear ribonucleo proteins.
Y en la jerga de la investigación científica, como es una palabra difícil de leer porque no tiene vocalas, se la llama snorps. Entonces, podemos decir que el espliciosoma está compuesto de cinco snurps, cada uno de ellos compuesto por sub unidades proteicas y uno de estos cinco ARN pequeños nucleares. El reconocimiento entonces de la secuencia consenso que está entre los exones y los intrones y del sitio de ramificación es producido por complementariedad de bases entre los ARNs pequeños que forman parte de las subunidades del espliciosoma.
Y también veremos que la interacción entre las subunidades del esplayosoma entre sí también van a estar mediadas por reconocimiento, por complementariedad de bases de los ARN pequeños. entre sí. Analicemos un poco más en detalle cuáles son los mecanismos moleculares que ejecutan estas ribonucleos proteínas, es decir, el spliciosoma.
Cada evento de splicing, como hemos conceptualizado, remueve un intrón e involucra dos reacciones secuenciales de corte eh y formación de nuevos enlaces covalentes conocidas como transesterificaciones. Hm. En un primer momento, distintas subunidades del pladiciosoma, distintas ribonucleoproteínas reconocen los distintos sitios con censo, uno el sitio dador del splicing, otro el sitio de ramificación y la primera ruptura y formación de enlaces covalentes se da aquí, en donde un nucleótido particular en el sitio de ramificación forma un enlace covalente con el nucleótido que estaba en la transición entre un exón y un intrón en el sitio dador de splicing.
Esto involucrará una ruptura previa de este enlace y la formación de un enlace covalente. Un segundo. Esto generará esta esta primera reacción genera un pequeño lazo en el punto de ramificación.
Luego, la segunda transestificación se dará entre el extremo hidroxilo libre que quedó en el exón eh anterior y el límite exxón intrón posterior. Esta es la segunda transestificación que produce el splazoma. Estas reacciones están catalizadas enzimáticamente y algo notable es que esa actividad enzimática no es no está producida por las proteínas del esplicosoma, sino que está catalizada por los ARN pequeños mismos.
Y esta fue una de las primeros descubrimientos de que los moléculas de ARN también pueden funcionar como catalizadores biológicos o ribocimas. Finalmente, entonces, como consecuencia de la remoción de este intron, eh el intrón queda en forma de lazo y luego se degradará en el interior del núcleo y en el sitio en donde se produjo el empalme de los dos hexones que antes estaban separados por un intrón y ahora quedaron continuos, queda un residuo proteico, ¿si? una modificación proteica alrededor de ese sitio en donde se produjo el splicing, aquí representado en el esquema con un pequeño cuadrado rojo que se denomina complejo de unión a exones.
Hm. Recordemos a este componente molecular porque cumplirá una función que analizaremos posteriormente. Si bien el splicing se produce cada vez que se transcribe cualquier ARN eucariota y en particular cualquier ARN humano, se ha podido identificar que este proceso no ocurre exactamente del mismo modo para el mismo transcripto en distintos tejidos en los que este gen se exprese o en distintos momentos del desarrollo.
Por ejemplo, se ha visto que ciertas secuencias que, por ejemplo, pensemos en esta representación en donde tenemos un gen eucariota discontinuo compuesto por cinco hexones. Y focalicémonos en el exon número tres. Lo que se ha observado es que este gen cuando se expresa en ciertos tejidos, esta secuencia que denominamos exón se comporta como tal y está presente en ARN mensajero maduro y contribuye, por ejemplo, con sus secuencias a la codificación de los aminoácidos que finalmente van a ser traducidos a partir de la misma.
En tanto que cuando estos cuando este gen se expresa en otros tejidos, este secuencia ya no se comporta como un exón, sino que se comporta como un intrón y es removido. Hm. Y está ausente del transcripto primario.
H el efecto final es que distintos tejidos generan isoformas de una misma proteína, variantes funcionales de una misma proteína. Veámoslo con un poco más de detalle. En el caso del gen de la tropimioina, como para poner un ejemplo, que seguramente es una proteína que seguramente quienes estén haciendo histología ya la han analizado porque cumple un rol en la contracción muscular.
Sin embargo, este gen de la tropomicioina no se expresa únicamente en el músculo estriado, hm, sino que se expresa en otros tejidos. Y si uno compara cuáles son las secuencias que se comportan como exones en el músculo estriado, cuando uno compara con la secuencia del transcripto primario, notará que hay diferencias respecto de cuáles son las secuencias que se comportaron como exones en comparación con los transcriptos que se generan cuando este gen se expresa en el cerebro. Hm.
Es decir, por un lado, el concepto de splicing alternativo nos ayuda a pensar en un mecanismo mediante el cual se aumenta la capacidad codificante del genoma, porque a partir de un mismo segmento de ADN pueden generarse distintos transcriptos primarios, seguramente en tejidos distintos o en distintos momentos del desarrollo que generarán isoforas de una misma proteína, pero también nos permite relativizar de alguna manera la definición de exón o intrón, h, ya que algunas secuencias se comportan como exones en algunos tejidos y en algunos contextos particulares del desarrollo, pero no se comportan como exones en otros. ¿Cómo se regula este splicing alternativo? Este splicing alternativo, primero antes de ver los mecanismos de regulación, me gustaría mencionar en qué consiste.
No toda alteración del mecanismo de splicing ha sido observada empíricamente. La más lo más frecuente es que una secuencia que se comporta como un exón en ciertos tejidos se comporte como un intrón en otros. Y a este mecanismo se lo denomina salteo de exones.
Hm. También se puede producir la retención de un intron, es decir, una secuencia que usualmente se comporta con como un intron, no sea removida en algunos tejidos. Hm.
Y hay otros mecanismos adicionales que también han sido descrptos. La pregunta sería ahora, ¿cuáles son los mecanismos moleculares que permiten que en distintos tejidos o en distintos momentos del desarrollo, a partir de la expresión del mismo gen, se generen estas formas alternativas de splicing? Para comprender estos mecanismos moleculares, volvamos a un concepto que hemos visto hace algunos minutos, la idea de las secuencias consenso del splicing.
Que las secuencias sean consenso. Este nombre particular que le damos significa que no todas las secuencias que encontramos los límites entre los exones e intrones y las secuencias de los puntos de ramificación son exactamente idénticas en todos los exones e intrones en los distintos genes humanos, sino que hay un alto grado de similitud. Entonces, esto hace o ha podido observarse que algunas secuencias particulares tengan mayor capacidad para reclutar a la maquinaria del splicing, para reclutar a ese sitio al spliciosoma.
A esas secuencias que tienen alta afinidad por el splicosoma, las denominados las denominamos secuencias fuertes de splicing. En tanto que variantes de estas secuencias consenso que tienen una menor capacidad para reclutar al pliciosoma y que necesitan de proteínas adicionales para producir efectivamente este reclutamiento, las denominamos secuencias débiles del splicing. Con esta consideración, veamos otro aspecto de este mecanismo de regulación, la existencia de proteínas reguladoras del splicing.
Imaginemos e dos tejidos inicialmente en donde se expresa un mismo gen. Podríamos pensar en el ejemplo del gen de la tropomiosina en el músculo estriado esquelético, una célula del músculo estriado esquelético y una célula del tejido nervioso. Imaginemos que para un intrón particular, aquí representado en amarillo, posee secuencias fuertes de splicing, es decir, que por sí misma puede reclutar de manera efectiva al spliciosoma.
Si en el primer tejido no hay ninguna proteína adicional que bloquee el reconocimiento de estos sitios fuertes de splicin, el splicosoma removerá el intron y este intrón se comportará como tal y no estará representado en el transcripto maduro. Pero si en un segundo tejido en donde este mismo gen se está expresando está presente una proteína que se une a uno de los sitios consensos del splicing, ocultándolo de su reconocimiento por el spliciosoma, este intrón no podrá ser removido y pasará a comportarse como un exón, es decir, estará presente en el transcripto primario final. Algo similar pero complementario, podemos pensar en otro ejemplo en donde tenemos un intron con secuencias débiles de splicing.
Habíamos dicho que si hay secuencias con senso débiles, ellas mismas no pueden reclutar por sí mismas a la maquinaria de splicing y en ausencia en un tejido particular de proteínas adicionales que ayuden a este reclutamiento, este intrón no será removido y se comportará como un exón. estará presente en el transcripto maduro. En tanto que en un segundo tejido que contenga estas proteínas activadoras que permitan reclutar al espliciosoma, efectivamente se producirá el splicing.
Hm. En otras palabras, la existencia del splicing alternativo se debe a que distintas células de distintos tejidos o en distintos momentos del desarrollo, el repertorio de proteínas reguladoras del splicing que hay en cada uno de estos tipos celulares difiere entre sí. Entonces, como consecuencia de estos tres pasos de procesamiento, la modificación del extremo 3 prima, del extremo 5 prima y el corte y empalme de exones, las secuencias que quedan presentes en el ARN mensajero maduro son las siguientes.
En el extremo cinco prima estará el CAP o la caperusa, pero el primer nucleótido luego de la Caperusa, no es el nucleótido en donde la traducción va a comenzar, sino que hay una secuencia de nucleótidos previas al inicio de la traducción y a ese segmento que está presente en el ARN maduro y por endexónico se lo denomina región cinco prima no traducida. por sus siglas en inglés, región 5 prima UTR, untranslated region. Luego del codón que inicia la traducción, que es el codón AUG, que codifica para meteonina, está la secuencia codificante, la secuencia de codones que serán efectivamente traducidos hasta llegar a un codón stop.
Pero luego del codon stop, el ARN mensajero maduro continúa y hay una secuencia no traducida, pero en el otro extremo que se que se la denomina región 3 prima UTR y que es previa al agregado de la cola de polía que fue producto de uno de los pasos de procesamiento. Son entonces estas secuencias las que están presentes en el ARN maduro. Y déjenme adelantarles que las regiones 5 prima UTR y 3 prima UTR cumplirán un rol fundamental en regular la estabilidad del transcripto primario.
Sin embargo, esta representación idealizada del transcripto lineal no es lo que ocurre en el interior de las células, porque como hemos podido ver, los ARN se encuentran relacionados con una multiplicidad de proteínas que han ido adquiriendo a lo largo de su maduración. No solo tenemos a las proteínas de unión al CAP, el CAP Binding Complex por un lado y las proteínas de unión a la poli por el otro, sino que también tenemos otro repertorio de proteínas nucleares, entre ellas los complejos de unión exones en todos los puntos en donde se produjo un sitio de splicing. Todas estas conjunto de proteínas son necesarias para que se produzca la correcta exportación.
del ARN mensajero maduro desde el núcleo en donde se produjo hacia el citosol a través de los poros nucleares en donde va a producirse el proceso de la traducción. También estas proteínas son necesarias para que se produzca la interacción con proteínas denominadas factores de iniciación de la traducción eucariotas H y que van a permitir el comienzo de la traducción del transco. En particular, aquí observamos a dos proteínas, dos factores del inicio de la traducción.
que interactúan por un lado con el complejo de unión al CAP y por otro lado con las proteínas de unión a la cola de poli de modo tal que la configuración que permite la traducción del ARN mensajero es esta configuración circular. Esto, este aspecto particular, esta configuración particular de proteínas de unión a la RN que van a permitir su correcta exportación y traducción funciona en términos moleculares como un control de calidad de la expresión génica, ya que evita que, por ejemplo, si un ARN mensajero se rompe por un accidente molecular, se trunca, evita que esa región truncada sea exportada y traducida. Hm.
Y este es otro sentido entonces en el que podemos pensar la regulación de la expresión génica, regulando el funcionando como un control de calidad de estos productos génicos. Una vez en el citosol, el ARN mensajero en esta configuración circular que está determinada por la interacción entre las proteínas que se unen a sus extremos y los factores del inicio de la traducción, permiten el ensamblaje de las subunidades de los ribosomas sobre el mensajero y la correcta traducción del mismo. En esta imagen, lo que puede observarse es algo frecuente en los ARN mensajeros maduros que han sido exportados correctamente, que comienzan a ser traducidos de manera simultánea por muchos ribosomas.
Por supuesto, todos se ensamblan alrededor del codón de inicio de la traducción y luego avanzan. Hm. En donde uno puede ver de manera esquemática cómo va generándose la proteína.
Hm. Cada vez más larga. A medida que los ribosomas avanzan el proceso de traducción.
Un aspecto a considerar que forma parte de los mecanismos de control de calidad es el hecho de que cuando por una mutación, por ejemplo, aparece un codón stop prematuro en una proteína, esos ARNs son efectivamente degradados, no son traducidos generando una proteína más corta. Y para comprender el mecanismo por el cual se detectan los codones stop prematuros, vamos a analizar a un proceso denominado degradación de RN mensajero por secuencias de terminación prematura. Esto comúnmente se conoce, eh se lo nombra en inglés como nonsense mediated decay.
Para comprender cómo funciona este mecanismo, debemos recordar, comparemos a un a la traducción pionera, es decir, al primer proceso de traducción cuando pase el primer ribosoma que va a traducir este RN en presencia o en ausencia de este codón stop adicional. Para que comprendamos esta representación, tenemos en la izquierda un transcripto normal en donde no se está representando su configuración circular para hacerlo más simple a la representación y en donde aquí en el último de los exones antes de la cola de polía se representa con este pequeña esfera el codón stop. Aquí tenemos en en el en un transcripto que ha adquirido por una mutación un codón stop prematuro, el codón stop natural y el codón stop extra producto de esa mutación.
Como les decía, aquí está representado el ribosoma con sus subunidades 60s y 40s. Lo que ocurre en condiciones fisiológicas es que cuando se produce la primera rueda de traducción, el ribosoma al pasar por el complejo de un exones, ¿recuerdan que era ese complejo que quedaba unido en los empalmes entre dos sexones adyacentes, esto mantiene la estabilidad del transcript? Hm.
En cambio, por ejemplo, cuando hay un codón stop temprano, el ribosoma va a despegarse al encontrarse un primer codón stop y no modificará a los complejos de unión exones que están en un punto posterior. Estos complejos de unión exones no modificados por esta primera rueda de traducción que tiene el transcripto, reclutarán exonucleas que van a inducir la degradación temprana del transcripto. Dicho de otro modo, usualmente se observa que codones stop tempranos, frecuentemente en exones previos al último, inducen este mecanismo de degradación temprana y esto conduce a que la célula no produzca proteínas truncas ni utilice recursos de traducción en proteínas no funcionales.
Analicemos a continuación los mecanismos moleculares que regulan la estabilidad de los ARN mensajeros. en condiciones fisiológicas, es decir, en condiciones de ausencia de mutación. Ha podido determinarse experimentalmente que no todos los ARN mensajeros dentro de una célula tienen la misma duración en el tiempo.
Algunos se degradan más rápido y otros se degradan más lento. Es decir, sus vidas medias, el término molecular que se utiliza para definir esto, puede ser un tiempo muy corto, durar solo unos pocos minutos. Y en ese caso diremos que esos ARNs mensajeros son inestables, en tanto que hay otros debidas medias muy largas que son muy estables.
Por ejemplo, los ARNs mensajeros eh de proteínas que codifican proteínas que controlan el ciclo celular suelen ser ARN inestables. Tanto que los ARN mensajeros de proteínas abundantes que tienen importancia funcional, proteínas estructurales, por ejemplo, suelen tener vidas medias mucho más prolongadas. Esto permitió advertir que existen mecanismos dentro de las células que regulan de manera diferencial la degradación de algunos ARN versus otros.
en particular pueden proteger a un subconjunto de ARN mensajeros de la acción de exodiendonucleas o exponer a otros a las mismas y regular así de manera diferencial estas vidas medias. Parte de los mecanismos moleculares que regulan esta estabilidad suelen ser generales. Por ejemplo, la existencia, como ya hemos visto, de complejos de unión a la caperusa o de proteínas de unión a la cola de polia.
Pero también hay mecanismos que actúan de manera diferencial sobre los distintos transcriptos. Por ejemplo, pueden unirse a ellos, dependiendo de la forma tridimensional que adopten estos transcriptos, diferentes proteínas de unión ARN, RBPs, por sus siglas en inglés, RNA binding proteins. Y estas proteínas de unión a la RN pueden conferirle estabilidad o inestabilidad, ya sea si protejan o recluten al sitio del AN mensajero a las exoyendonucleasas.
Vamos a analizar con cierto detalle a continuación un mecanismo particular de regulación de la estabilidad de los ARN que está mediado por una familia de pequeños ARNs no codificantes que funcionan como reguladores posttranscripcionales de la expresión génica. se denominan micros. Estas moléculas están codificadas por el genoma y generan cuando adoptan su forma madura, pequeños eh oligonucleótidos de RN de aproximadamente 21 nucleótidos de longitud.
Estos nucleótidos en el citosol se unen a un complejo proteico denominado risk por sus siglas en inglés, que se traduce como complejo efector, complejo silenciador eh de RNA. Y lo que hace el micro RN es guiar es por el complementariedad de bases a este complejo efector un usualmente a un segmento localizado en el extremo tres prima no traducido del ARN mensajero. Entonces, dependiendo de la complementariedad o no que existe entre el micro RN y el ARN mensajero en cuestión, esto guiará o no al complejo efector de silenciamiento.
Una vez que este complejo proteico compuesto por diversas proteínas, una de ellas son las proteínas de la familia argonautas, aquí representadas con la sigla ago, se desencadenan una serie de procesos que van a reprimir la traducción de este mensajero y también van a inducir la degradación de la RN mensajero. Es decir, los microarrenes al unirse al transcripto maduro en el citosol disminuyen la vida media del transcripto y evitan que se siga traduciendo. El genoma humano posee alrededor de 2,300 genes para diferentes micro RDNs y un mismo una misma secuencia de micro RNES tiene distintos blancos moleculares, ya que regulará a todos aquellos transcriptos maduros que tengan secuencias complementarias.
a la secuencia del micro RN. Estos micro RNs entonces participan de la regulación fina de los niveles de expresión. Hm.
A diferencia de los controles pretranscripcionales y controles del inicio de la transcripción que vimos en la clase pasada, que funcionaban como una especie de interruptor, todo o nada de la expresión de un gen, los microenes funcionarán como ecualizadores, regulando a nivel fino los niveles de expresión. Este mecanismo muy novedoso cuando se lo descubrió en la década de los 90, que permitió identificar una familia de RN que interfería con la expresión de otros, se lo denominó en forma general fenómeno de interferencia de ARN. Y su descubrimiento permitió, por ejemplo, diseñar ARNs pequeños artificiales que pueden utilizarse como fármacos, ya que pueden introducirse dentro de las células.
para regular negativamente algunos transcriptos que están teniendo efectos negativos en ciertos contextos. Veamos por último la regulación de la estabilidad y la actividad de las proteínas. Una vez que las proteínas se producen, es decir, culmina la traducción en el citosol, algunos productos proteicos no son necesariamente activos, sino que solo se activan bajo condiciones particulares.
Por ejemplo, muchas modificaciones covalentes como la fosforilación cambian el estado de actividad de las proteínas o la unión de un ligando particular puede transformar a una proteína de un estado inactivo a un activo. Por ejemplo, la unión de hormonas esteroideas que ingresan al interior celular, encuentran a receptores intracelulares proteicos que solo a posterior desunión con su ligando pueden migrar al núcleo y cumplir la función de ser factores específicos de la transcripción. O muchos ejemplos de proteínas que participan en la regulación del ciclo celular que solo cuando son fosforiladas se vuelven activas.
Por ejemplo, las elicas que al ser fosfor que están localizadas en los orígenes de replicación de la células, pero que solo se vuelven activas cuando son fosforilados por los complejos CDCI clinas característicos de la fase F. Algo importante de identificar de esta regulación postraduccional es que suelen tener efectos en el muy corto plazo, es decir, las modificaciones funcionales se ejecutan en las células en el lapso de entre segundos y minutos. Y esto contrasta con modificaciones más lentas que se dan en el transcurso de horas, como son las que se requieren eh las que usualmente involucran los mecanismos de regulación del acceso a la cromatina, tal como vimos en la clase pasada.
En otras palabras, la temporalidad de los distintos mecanismos que regulan la expresión génica son diferentes. Por último, la vida media de las proteínas también está regulada activamente por las células, por un sistema que se denomina ubiquitina proteasoma. La ubiquitina es una pequeña proteína aquí representada con una pequeña esfera verde que puede ser unida, conjugada a distintos sustratos proteicos.
Mediante la unión de varias proteínas de ubiquitina, hablamos de una reacción de de poliubiquitinación. Esta reacción de conjugación de ubiquitina a distintos sustratos está llevada a cabo por un conjunto de enzimas denominadas ubiquitín ligas. Hm.
Hay tres clases diferentes de ubiquitín ligas porque la reacción requiere tres pasos. Una primera enzima activadora de tipo E1 a la que activa mediante la desfosforilación de un ATP a la ubiquitina. Esta luego transmitirá, sí, pasará mediante la conjugación de la ubiquitina a una segunda enzima, una enzima E2 y esta finalmente se la pasará a una enzima E3.
Y las E3 ubiquitín ligazas son las que van a reconocer específicamente a distintos sustratos a los cuales conjugar esta poliubiquitina. Hay distintas clases de tres ligas. en distintos tipos celulares que reconocerán distintos sustratos y esto es lo que le confiere la especificidad a la reacción de poliubiquitinación.
Además, pensemos que las etesligazas pueden estar en estados inactivos o activos, por ejemplo, mediante fosforilaciones. O sea, que solo bajo ciertas condiciones particulares de la célula, esta reacción de polioviquitinación de ciertos sustratos va a llevarse adelante. ¿Cuál es el efecto final sobre una proteína al agregársele esta cadena de poliubiquitinas?
El resultado es su degradación por parte de un complejo proteico que tiene actividad de proteasa y que es muy abundante en las células, pero que solo reconoce como sustratos a proteínas que están extensamente polipubiquitinadas. Un ejemplo frecuente que hemos visto ya en eh ustedes en otras clases es la degradación de las cisclinas que regulan la actividad de las quinazas dependientes de ciclinas en la regulación de la progresión del ciclo celular. La cantidad de moléculas de ciclina varía a lo largo del ciclo justamente porque ante determinadas señales intracelulares se activan las C3 ligazas que unen poliubiquitinas.
a las moléculas de ciclina y conducen a su degradación por el proteasoma. A modo de conclusión de esta clase, me gustaría reflexionar con ustedes las distintas manifestaciones de la regulación de la expresión génica que hemos visto en la clase anterior y en esta. Un primer aspecto para comprender a que denominamos regulación de la expresión génica es el conjunto de mecanismos que regulan el nivel, es decir, la cantidad de un determinado producto génico.
La regulación prestranscripcional y del inicio de la transcripción que analizamos la clase pasada o el efecto de los micro RNs terminan regulando si hay o no producto génico y la cantidad de los mismos. son ejemplos de esta aspecto de la regulación de la expresión gémica, pero otros mecanismos regulan el nivel de actividad del producto génico como los mecanismos posttraduccionales de proteínas, ¿no? La fosforilación de una proteína puede transformarla de activa a inactiva.
Y aquí tenemos una modificación que regula la actividad de un producto génico. También analizamos mecanismos que regulan ya no la cantidad, sino la calidad del producto génico. Cuando analizamos el splicing alternativo, observamos que estos procesos regulatorios permitían generar isoformas proteicas distintas a partir de un procesamiento diferencial de un mismo transcripto primario.
Y por último también vimos mecanismos moleculares que cumplen la función de controlar la calidad de un producto génico cuando analizamos los efectos que tienen las modificaciones en los extremos 5 prima y 3 prima de la RN o los mecanismos de nonsense mediated decay que degradaban a un transcripto cuando tenían un codrano son ejemplos de este último tipo de regulación del expresión génica.
