Hola, ¿cómo están? En la clase de hoy vamos a analizar diversas técnicas de biología molecular que se utilizan en el contexto de la genética médica y que tienen como objetivo detectar distintas variantes alélicas presentes en nuestro genoma. En la primera parte de la clase nos vamos a concentrar en variantes de la técnica de PCR y cuál es para entender cuál es el fundamento de esta técnica y de sus Variaciones en distintos escenarios que se pueden presentar en el contexto de la genética médica. Y en la segunda parte vamos a analizar las técnicas basadas en la
secuenciación de ADN. Tanto en un caso como en el otro, el objetivo será entender, por un lado los fundamentos moleculares de cada una de estas técnicas y también el contexto médico y clínico en donde estas técnicas eh se vuelven necesarias, comprendiendo en cada caso Qué información aportan en cada uno de estos contextos. Vamos a comenzar repasando a lo que han visto seguramente en clases anteriores, que son los fundamentos de la técnica de PCR, que son las siglas eh en inglés de reacción en cadena de la polimerasa, esta técnica que fuera desarrollada en los años 80
por el bioquímico Carry Mulis y que recibió gracias a esto el Premio Nobel De química en el año 1993. 3 es una técnica que permite la amplificación de un segmento específico de ADN partiendo de una mezcla compleja. Hm. Es por lo tanto, la reproducción de una reacción química en donde lo que ocurre es la polimerización de ácidos nucleicos. Un aspecto, una ventaja de esta técnica es que uno puede diseñar eh la técnica de PCR para amplificar un segmento específico del genoma, por más que lo Que sea utilizado como molde inicial sea el ADN genómico total.
Hm. Y esta técnica puede entonces, a pesar de partir de un molde extensísimo, el ADN genómico total, por ejemplo, extraído a partir de una muestra de sangre periférica u otro material biológico, amplificar específicamente un único segmento de ADN de esa muestra. En esta reacción en cadena de la polimerasa, los elementos que se introducen para producirla son, como ya Vimos, el ADN genómico extraído de un paciente que constituye el molde de la reacción de polimerización. La enzima ADN polimerasa se usa una ADN polimerasa de origen bacteriano, TAC polimerasa, porque es termorresistente. Y para que esta enzima,
que es la enzima que polimerizará eh los sustratos para en las reacciones de amplificación, eh necesita como sustratos a los DNTPs, es decir, Deóxidonucleótidos, de adenina, tinina, citosina y guanina. Y también necesitará de primers o cebadores que en breve veremos y repasaremos cuál es la función que cumplen en esta reacción. Para que la ADN polimerasa pueda funcionar, esta enzima requiere de un buffer, una solución amortiguadora que mantenga estable el pH de la solución y de cationes divalentes de magnesio, ya que actúa como cofactor preservando la estructura Tridimensional activa de la ADN polimerasa. Volvamos a poner
el acento sobre los DNTPS y los primers como requerimientos moleculares de la actividad de la ADN polimerasa. Decíamos recién entonces que estos desoxirribonucleósidos trifofatos de adenina, timina, guanina y citosina son los sustratos que polimerizará la ADN polimerasa dependiendo del molde que se ha utilizado durante la replicación. Y estos moléculas se encuentran en amplio exceso en la reacción para que esta proceda de manera rápida y efectiva. Recordemos que para la todas las ADN polimeras, incluidas la TAC polimerasa, que es la polimerasa de origen bacteriano que se utiliza aquí, no pueden sintetizar de novo. Hm. Por un
lado, necesitan una hebra de ADN. de cadena simple como molde de polimerización y por otro lado, al no sintetizar de de novoo, esto implica que No pueden comenzar de cero una hebra nueva aún teniendo un molde, sino que la actividad enzimática se restringe a elar hebra preexistente previamente apareada al molde y en particular el aspecto el grupo químico que es necesario para esta reacción de polimerización de la polimerasa es que el último nucleótido que ha sido incorporado a esta eh hebra preapareada tengo un extremo tres primas hidroxilolibre, ya que este grupo Hidroxilo en la posición
tres prima eh es el requerimiento necesario para que en la reacción de polimerización se incorpore el próximo núcleo y el nuevo núcleo nucleótido nuevamente tendrá este extremo tres primer hidroxilolibre que permitirá la incorporación del nucleótido subsiguiente. Justamente los primers cumplen esta función ser un segmento de ADN, ya que los primers que se utilizan Durante la polimerización eh que ocurre en la PCR son de ADN para que sean más estables, confieren este esta hebra previamente apareada que luego será el reacción de polimerización, pero no es la única función de los primers, sino que además de cumplir
ese requerimiento que permite la funcionalidad de las ADN polimeras de la reacción, los primers cumplen otra función determinando cuál es la región Que se va a amplificar. Es decir, tienen además la función de conferir la especificidad de cuál es el segmento de ADN que va a amplificarse en esa reacción. Esto es así porque en cada reacción de PCR se utilizan eh como mínimo un par de primers. Hm. Uno de esos primers se une a una de las hebras de ADN y el otro primer se une a la hebra complementaria. Hm. Cuando estos primers son elados
durante la reacción de polimerización, estos primers setean el límite de las hebras nuevas y por ende cuando en la próximo ciclo de amplificación sean utilizados ellos mismos como moldes, darán un punto fijo de finalización a esa reacción de amplificación. La reacción de PCR consiste en una serie de ciclos de amplificación en donde cada uno de estos ciclos tiene tres pasos. Hm. El primer paso implica la desnaturalización del ADN, llevando durante un corto tiempo la reacción a 95º. Esto permite que el ADN genómico, por ejemplo, y luego todos los productos de amplificación a medida que las
reacciones avanzan se desnaturalicen. Es decir, que el ADN en doble cadena se separe en hebras simples, ya que el molde tiene que estar en hebra simple Para que pueda ser sustrato de amplificación por la ADN polimerasa. En el segundo paso, la temperatura baja hasta temperaturas que van entre los 50 y 70º, dependiendo de la composición de los primers, porque esta temperatura más baja permite que se hibriden, que se unan los primers h a las hebras de ADN. Y luego en el tercer paso, que típicamente ocurre a 72 gr, que es la temperatura óptima de polimerización
de la TAC polimeras. Se produce la elongación, la polimerización efectiva de esos fragmentos. Hm. Cuando estos ciclos se repiten muchas veces, lo que termina generándose es una amplificación que es exponencial. Y la exponencialidad está dada porque en cada uno de estos ciclos la cantidad de molde de aquella región que específicamente se va a amplificar se duplica. H. Entonces, en cada ciclo Se tiene el doble de la cantidad de moldes que se tenía en el anterior. Hm. como se ponen en exceso dentro de ese tubo de de NTPs, moléculas de TAC polimeras eh y primers, la
reacción ocurre amplificándose exponencialmente y después de 30 ciclos, por ejemplo, habrá 1000 millones de moléculas de ADN específicamente amplificadas, haciendo que el ADN genómico que pusimos inicialmente sea una contaminación Minúscula. respecto de el enorme producto de amplificación a lo largo de estos ciclos. Por lo tanto, se piensa que el hacia el final de la reacción de PCR tenemos un segmento de ADN amplificado con miles de millones de copias que se encuentra virtualmente puro. ¿Cómo se visualizan estos productos de amplificación? Usualmente se utiliza una técnica que es la electroforesis en gel de ácidos Nucleicos. La electroforesis
implica someter a moléculas cargadas a un campo eléctrico para que migren en función de sus cargas. Como ustedes saben, las moléculas de ácidos nucleicos están cargadas negativamente debido a que los grupos fosfato que contienen su rebón nuucleótido se encuentran eh con carga eléctrica neta negativa y migrarán hacia el electrodo positivo en esta reacción De separación de moléculas. Esta electroforesis no ocurre en un medio líquido, sino en un gel. H y este gel, si lo viéramos microscópicamente, está construido por una matriz de es un polímero que forma una matriz de poros, una matriz porosa. Y cuando
uno somete entonces a las moléculas de ácidos nucleicos a que migren h en una solución a través de esta matriz porosa, lo que ocurre es que los fragmentos más Pequeños pueden atravesar con mayor facilidad esta red de poros que los fragmentos más grandes que chocarán un mayor número de veces contra los tabiques de este gel y tendrán una velocidad más retardada. El efecto final entonces es que la electroforesis permite separar a los fragmentos de ADN según su tamaño. Para visualizar eh los fragmentos de ADN dentro del gel, se utiliza una Molécula como promuro de tío,
que es un intercalante de bases. es una molécula que tiene un tamaño tal que puede meterse entre medio de dos pares de bases sucesivos del ADN. Hm. Y una de las propiedades de esta molécula de bromuro de tibio es que cuando es iluminada por los ultravioletas emite fluorescencia. Entonces, si dentro de la matriz del gel introdujimos moléculas de un colorante como promuro de tio y luego revelamos el Gel con luz ultravioleta, veremos que se han separado, o sea, veremos marcas fluorescentes allí donde habría ADN. En esta foto de este gel observamos que se han sembrado
distintas muestras en cada una de las calles de este gel. Por ejemplo, en la primera calle y en la última calle se sembró se sembraron marcadores de peso molecular, es decir, una mezcla prefabricada de distintos tamaños de moléculas de ADN que sirven luego para Estimar cuál es el tamaño de la molécula que fue el producto de la reacción de PCR. Imaginemos que aquí corrimos cuatro reacciones, 1 2 3 y cuatro. Podemos ver que en las tres primeras hubo producto de amplificación y podríamos estimar el tamaño de ese producto de amplificación comparándolo con los marcadores de
peso molecular, en tanto que en el último en la última reacción no hubo ningún producto de amplificación. A veces estas imágenes obtenidas del Revelado de los geles suelen invertirse digitalmente, hm, mostrándonos bandas oscuras sobre un fondo claro, ya que esto suele ser más cómodo para nuestros ojos, para la visualización de nuestros ojos, pero ambos tipos de visualizaciones son frecuentes en trabajos de investigación y en libros de texto. Me gustaría contarles que existen alternativas en Electroforés para visualizar los productos de amplificación y la electroforesis puede Realizarse a veces en un capilar. Hm. Es decir, el sistema
es equivalente, hay un electroforesis en el sentido de que se aplica un campo eléctrico y hay un polo negativo y un polo positivo, pero ahora el gel está eh constituido dentro de un pequeño delgado tubo capilar. Hm. Pero también es una matriz porosa. Y cuando se separan las moléculas de ADN En función de su tamaño con el mismo principio que vimos recién, la visualización se produce porque en un punto determinado de este capilar hay un detector h que permite que nos dará una serie de picos de fluorescencia cuando pasen las moléculas de ADN marcadas fluorescentemente,
ya sea por un intercalante de bases u otro método de detección. Y el resultado de esta electroforesis capilar usualmente lo Observamos digitalmente en la forma de un electroferograma. Hm. Pero análogamente estos picos representan lo que en un gel serían dos bandas. Hm. En donde la aquí la altura de los picos implica la intensidad de fluorescencia de las bandas y lo que está representado en el eje X es la separación según el tamaño. O sea, que ambos tipos de informaciones pueden obtenerse por electroforesis en gel o por electroforesis capilar. En el primer Caso es la visualización
del gel y la interpretación del patrón de bandas, lo que es informativo y en el segundo caso es la interpretación del electroferograma correspondiente. Aquí vemos un ejemplo más en donde vemos en la parte superior un electroferograma correspondiente a una reacción de PCR en donde había un único producto de amplificación, un único amplicón, ese es El nombre técnico que le damos y eso permite explicar este único pico. En cambio, en un segundo ejemplo, imaginemos que en otra reacción de PCR se generaron dos productos de amplificación distintos y esto se observa como una serie de dos picos.
Hm. A continuación, ya habiendo visto los fundamentos de la técnica de PCR, cuáles son los reactivos que una reacción básica de este tipo conlleva y cuáles son los modos de visualización de Los productos de PCR, vamos a intentar comprender los usos de esta técnica en el contexto de la genética médica. Es decir, pensando que vamos a utilizar esta técnica para determinar la presencia o no de determinadas variantes alélicas. Algo importante a considerar es que la PCR es una técnica basada en hipótesis, es decir, que si la estamos utilizando en el contexto médico o clínico es
porque estamos buscando una variante Alélica en particular. Es decir, el contexto clínico nos debería sugerir que estamos pensando en buscar variantes alélicas de un determinado gen e incluso dentro de un mismo gen que estamos buscando una cierta eh mutación en particular. Hm. Ya que el diseño de los primers en esta técnica requiere haber eh hipotetizado sobre la naturaleza de de estas causas de nuestro cuadro clínico. Veamos un ejemplo en el contexto de una eh entidad monogénica Como la fibrosis quística. No nos meteremos en los detalles de esta patología, eh, pero déjenme adelantarles que ya sabemos
que hay una sintomatología de ciertos niños y niñas que permite sospechar de esta entidad que se caracteriza por el taponamiento mucoso de múltiples conductos y que sabemos además que se origina por variantes patogénicas en un gen de un canal de cloruros denominado CFTR y que la mutación más frecuente en la población que origina esta patología es una mutación que se denomina fenilalanina 508 del, en donde una delesión de tres nucleótidos en el gen en un exón, en una región estrictamente codificante tiene como correlato la delesión de un codón que codifica para el aminoácido. fenilalanina y
que esta ausencia de este aminoácido tiene Consecuencias eh negativas para la función proteica. Entonces, si hay un paciente que tiene signos clínicos compatibles con la fibrosis quística, podría ser útil, dado que se sabe que en muchísimos pacientes eh esta variante alélica particular que implica la delesión de la filalananina es la que esté presente, que uno vaya a buscar si está presente o ausente esta de lesión de fenilalanina en esta posición Específica del gen de CFTR. Entonces, en este contexto me gustaría mostrarles como la eh PCR convencional puede ser muy útil para detectar inserciones o de
lesiones como en este caso e orientadas por una hipótesis de la clínica. Para eso, ya que sabemos cuál es el gen del cual queremos explorar si contiene o no esta inserción o de lesión, podemos diseñar un par de primers porque Conocemos la secuencia del genoma humano y podemos entonces acceder a ella mediante bases de datos y utilizarla para eh diseñar nuestros primers y los diseñaremos en una región flanqueante a la posición en donde puede estar o no la delesión. Aquí en este ejemplo estamos eh esquematizando en la parte superior una variante alélica que no contiene
a la de lesión eh en cuestión y otra que sí la Tiene. Notemos que como los primers están en una región flanqueante, en ambos casos, en ambas variantes alélicas, los primers pueden unirse y podrán generar amplicones, es decir, reacciones de amplificación en ambos casos. Hm. Pero los productos de amplificación van a ser levemente distintos, ya que si los comparamos entre sí, el producto de amplificación de la variante que no contiene la delesión Tendrá tres nucleótidos de más respecto de la variante que sí posee la delesión. Si bien esta diferencia en tres nucleótidos es pequeña, pueden
utilizarse geles poliacrilamida, que es un gel diferente al gel de agarrosa, para poder discriminar estas diferencias. Hm. O sea, que en una matriz de gel de poliacrilamida, la electroforesis que separará a las moléculas según su tamaño puede ocurrir del mismo modo. Y Analicemos entonces eh el resultado de esta PCR, imaginando que obtuvimos muestras biológicas, quizás por sangre, muestras de sangre periférica, de miembros de una familia en donde algunos de ellos mostraban signos clínicos de fibrosisquística y se quería explorar la presencia o no de esta delesión particular en el gen CFTR. Concentrémonos, por ejemplo, en el
individuo número cuatro. Hm. El individuo número cuatro tiene un único producto de amplificación. Hm. Y si lo comparamos con el individuo número dos, que también tiene un único eh fragmento amplicón, producto de amplificación, si los comparamos entre sí, podemos decir que el producto de amplificación del individuo cuatro tiene mayor tamaño en pares de bases que el producto de amplificación de dos, porque como habíamos dicho, los fragmentos más pequeños migran más en el gel, pueden Atravesar la matriz porosa con menor dificultad que los fragmentos más grandes. Entonces, considerando, tendríamos que hacer ahora consideraciones respecto de la
estructura del genoma humano para saber qué es lo que ha ocurrido allí. Tenemos que considerar, por ejemplo, la naturaleza diploide de nuestro genoma, que nosotros tenemos dos variantes alélicas, una de origen materno y otra De origen paterno para cada uno de los genes. Si tenemos tanto en los individuo dos como en el individuo cuatro un único producto de amplificación, diremos que la variante materna y paterna se están comportando del mismo modo, están generando el mismo tipo de producto de amplificación. Hm. Ahora bien, ¿cómo comprender un producto de amplificación de mayor tamaño respecto de menor tamaño?
En el contexto de esta PCR, en donde usamos primers para amplificar un cierto segmento del gen de CFTR, uno podría decir que el individuo 4, como tiene los tamaños más grandes, sus dos variantes alélicas, la materna y la paterna, eran variantes alélicas sin la delesión de fenilalanina. 508, en tanto que el individuo 2 tiene sus dos variantes alélicas con la de lesión. Por eso vemos un único producto de amplificación producto de esos dos variantes alélicas que fueron Utilizadas como molde durante la PCR, pero que generaron el mismo producto de amplificación. En oposición a estos casos,
los individuos 1 y 3 tienen dos productos de amplificación, uno más grande y uno más pequeño. Hm. Y entonces podemos pensar que en esos individuos una de las variantes salélicas tiene y la otra no, la delesión. Hm. O sea, que la delesión estaría en heterociigosis en estos dos individuos. Con lo que vimos hasta aquí, podríamos pensar entonces que dado que las inserciones y de lesiones pueden generar amplicones, es decir, productos de amplificación de distinto tamaño que luego serán separados por electroforesis en gel, podemos comprender por qué la PCR puede usarse para detectar inserciones y lesiones.
Ahora, ¿qué pasaría si nosotros queremos detectar otro tipo de variantes Alélicas? Por ejemplo, aquellas provocadas por una mutación de sustitución en donde no habrá entonces diferencias de tamaño entre eh los productos de amplificación. Para para detectar variantes eh alélicas provocadas por mutaciones de sustitución, hay que utilizar variantes de la técnica de la PCR h específicamente diseñadas para detectar estas Sustituciones. Y una de estas variaciones es la PCR aleloespecífica, h que está específicamente diseñada para este fin. ¿Cuál es la característica del diseño que permite esto? Imaginemos que tenemos dos variantes alélicas que difieren en un en
una mutación puntual, es decir, en la misma región en donde una variante alélica tiene el par AT, otra variante alélica en esa misma posición de ese mismo gen Tiene el nucleótido del par de bases CG. Aquí la clave es diseñar un par de primers en donde uno de ellos h se una específicamente en su extremo tres prima hidroxilo, aquel que necesariamente tiene que estar apareado al molde para que se produzca la amplificación. Tenemos que diseñar ese primer para que sea también alelo específico. Es decir, si lo diseñamos de modo tal que Solo pueda unirse a
una de las variantes alélicas, en la otra variante alélica habrá un mal apareamiento en este punto. Y esto implica que por más que el otro primer esté unido, una de las variantes alélicas no podrá amplificar durante la reacción de PCR y la otra sí. Hm. Entonces, en función de si hay o no producto de amplificación, uno podría inferir cuál de las dos variantes alélicas estaba presente. Por Ejemplo, si tomamos muestra de cinco pacientes para determinar cuál de las dos variantes alélicas poseían y tenemos estos resultados, aquí vemos una calle como resultado de la electroforesis en
gel revelado de un marcador de peso molecular, pero la PCR del paciente 1 y del paciente dos y del 5 nos dan un producto de amplificación. Podemos decir que ellos tenían por lo menos una variante alélica en su genoma de tipo CG. Ahora, lo que podemos decir también Es que los individuos 3 y cu aparentemente no tenían ninguna variante SG en su genoma. Usualmente estas PCR lo específicas para tener la información completa necesitan hacer otra PCR para detectar la otra variante. Hm. Por ejemplo, si con los con el ADN genómico de los mismos pacientes usamos
primers para detectar la otra variante, es decir, primers que puedan unirse cuando esté la el dinucleótido AT, pero No el dinucleótido CG. Aquí completamos la información. Por ejemplo, vemos que los individuos 3 y cuatro, que antes no mostraban señal de amplificación, ahora muestran. Entonces podemos decir que las dos variantes alélicas, la de origen materno y paterno, de los individuos 3 y 4 tenían una variante alélica AT y no tenían ninguna CG. Pero, ¿qué podemos decir, por ejemplo, del individuo uno que tiene Producto de amplificación tanto en una PCR como en la otra? En este caso,
probablemente este individuo sea heterocigote, es decir, tenga una variante alélica de un origen parental de tipo CG y otra variante AT. Por es por ende, en ambos casos hubo producto de amplificación. Hm. Les dejo para pensar a ustedes cuál será la configuración genética en términos de estas variantes del individuo 5, que presenta amplificación aquí y no aquí. Déjenme contarles que además existe otra variante de la técnica de PCR denominada PCR RFLP que se utiliza para detectar variantes alélicas eh con mutaciones puntuales de sustitución, es decir, que defieren una respecto de la otra en una eh
mutación de sustitución. Esta sigla RFL es siglas en inglés de polimorfismos en la longitud de fragmentos de restricción. Y esto alude a la utilización en el contexto de la investigación de unas endonucleas, se llaman enzimas de restricción, que son endonucleas de origen bacteriano que pueden clivar al ADN en secuencias específicas. En este caso, si uno quiere diferenciar dos variantes alélicas, por ejemplo, veamos que esta variante difiere en este Punto. Hm. Acá hay at y acá hay ta. Es decir, hay una sustitución en un punto particular. Quien diseña esta técnica tiene que inferir si en el
contexto en donde estamos la donde está la las variación que uno quiere detectar si esto contiene alguna secuencia de reconocimiento de alguna enzima de restricción. Si uno va a las bases de datos y compara las secuencias de reconocimiento de las enzimas de Restricción y encuentra que esta variación afecta a uno de estos sitios, uno podrá decir lo siguiente. Por ejemplo, en este caso hay una enzima de restricción que es D1 que puede cortar, o sea, tiene un sitio de reconocimiento en la varia en aquel aquella variante alélica que tenía AT en esta posición, pero cuando
ese nucleótido se sustituye por su inverso TA, ya la enzima de restricción no puede Cortar. Haberse dado cuenta de este aspecto nos permite diseñar una PCR en combinación con una reacción de corte con esta enzima de restricción que nos permitirá eventualmente, y este es nuestro objetivo, distinguir a estas variantes alélicas. En particular, determinar cuáles son las variantes alélicas que tiene algún individuo eh que nosotros estemos analizando. Para eso simplemente se Diseñan primers. que flanqueen el sitio de restricción donde está la variante que estamos buscando. Y como estos primers no afectan o no se unen la
región potencialmente polimórfica, se unen tanto en una variante alélica como en la otra. H al amplificar por PCR, en ambos casos, obtendremos tamaños, productos de amplificación del mismo tamaño. Y como segundo paso característico de esta Técnica es los tratamos con la enzima de restricción a los productos de amplificación de la PCR. Entonces, imaginemos qué es lo que ocurre en el primer paso. Los dos variantes alélicas se amplifican por PCR. Tenemos en cada tubo de PCR millones y millones de copias de estos productos de amplificación que son iguales en tamaño. Ahora bien, cuando los tratamos con
encima de restricción, solo uno de Los fragmentos puede ser cortado y el otro permanecerá sin ser cortado porque la variante alélica justamente afectaba el sitio de restricción de esta enzima. Y ahora entonces tenemos un polimorfismo en la longitud de los fragmentos. Hm. De allí el nombre de la técnica y nosotros sabemos que fragmentos de ADN de distintos tamaños pueden ser separados mediante la técnica de electroforesis. Interpretemos nuevamente Cinco pacientes que hemos explorado su constitución genética gracias a esta técnica. Recordemos entonces que la variante alélica que aquí llamamos AT, era aquella que conservaba el sitio de
restricción y podía ser clivada generando estos dos fragmentos en tanto que la variante TA no iba a ser sustrato de esta reacción de restricción y nos iba a generar un fragmento más largo. Por ejemplo, si pensamos en el Paciente número cuatro, que tiene un único producto de amplificación de gran tamaño, Hm. porque es el que menos migra. Podemos decir que el individuo cuatro tenía una variante alélica materna y paterna con la variante de tipo TA, ya que son los fragmentos más grandes los que no son sustratos de la enzima de restricción. Hm. En cambio, si
pensamos en el individuo uno, en donde tenemos dos fragmentos de Restricción y ambos son de menor tamaño que aquel que habíamos encontrado en el individuo cuatro, h, podemos pensar que este individuo solo tenía variantes alélicas de tipo AT que generaban estos dos fragmentos distintos entre sí, pero en ambos casos menores a la de la otra variante alélica. Hm. Y el caso más complejo de interpretar lo tenemos en los individuos 3 y 5, en donde vemos tres productos de amplificación en el gel. Y en este caso lo que interpretamos es que estos individuos tenían una única
variante alélica TA, que fue la que no fue cortada por encima de restricción y generó el fragmento de mayor tamaño. Y la otra variante alélica era de tipo AT, que sí fue fragmentada y generó los fragmentos de menor tamaño. Me gustaría ahora contarles otra aplicación. de la PCR, que es la PCR multiplex, en un contexto muy particular, en el contexto De la genética forense, en donde en este caso no es un contexto patológico, sino lo que se intenta es determinar variantes genéticas que permitan establecer relaciones biológicas entre individuos, por ejemplo, relaciones de filiación. Hm. Y
en este contexto, usualmente lo que se exploran son regiones muy polimórficas de nuestro genoma, que son las repeticiones en Tandem cortas, strs o short tandem repeats, usualmente representadas por elementos denominados microsatélites que hemos analizado en el seminario número nueve. Estas eh estos microsatélites, estas repeticiones cortas en tandem se comportan como variantes alélicas, es decir, todos los seres humanos en la misma posición de determinados cromosomas poseemos una variante de origen materno y y de origen paterno de Estas regiones repetitivas. Y como son muy polimórficas, difieren entre sí muy frecuentemente en el número exacto de repeticiones que
posee cada una. Hm. Y como cada uno de nosotros recibió estas variantes, una de origen materno y otra de origen paterno, si uno explora, por ejemplo, para un eh para uno de estos microsatélites en particular, probablemente una de esas variantes alélicas deberíamos encontrarlo en Nuestra madre biológica y y el otra variante alélica deberíamos encontrarlo en nuestro padre biológico Para aumentar la fidelidad de estos análisis, por ejemplo, de filiación, no se analiza un único microsatélite, sino que ya en el año 1997 el FBI estandarizó un procedimiento que analiza 13 secuencias eh de mini microsatélites Dispersos a
lo largo de distintos cromosomas humanos. Entonces, las inferencias no solo estarán basadas en un único microsatélite, sino en múltiples eh loki, múltiples posiciones cromosómicas que están en distintos cromosomas. Estos nombres que vemos aquí, TPOX, D8S 1179, BA, etcétera, son los nombres particulares de regiones repetitivas en tandem. que Son muy polimórficas en la población humana, pero que todos los humanos en esas posiciones de esos cromosomas tenemos ese microsatélite. Entonces, quería contarles que esta técnica de PCR multiplex se aplica para hacer un análisis de la longitud de estas regiones, para determinar eh el número de repeticiones que
tiene cada uno de estos microsatélites en una reacción simple al Mismo tiempo. ¿Cuál es la clave? eh a qué a qué aspecto específico de la PCR multiplex, que a diferencia de las PCRs clásicas en donde usábamos un par de primers para amplificar eh aquellas regiones del genoma que queríamos amplificar. En este caso vamos a utilizar muchos pares de primers distintos, cada uno de ellos diseñados para amplificar uno de estos microsatélites en particular, es decir, La región flanqueante que permite amplificar aquel microsatélite que está en cada uno de los cromosomas que analizamos. Justamente como esta reacción
es compleja, porque va van a mezclarse en un mismo tubo amplicones provenientes de distintos genes, de distintos pares de primers, suelen utilizarse para visualizar los productos de amplificación fluoróforos, h moléculas ligadas a los primers, h que van a Emitir fluorescencia en distintos colores, permitiendo entonces diferenciar por color a los distintos productos de PCR. H, como esta reacción es muy compleja, porque tenemos eh por lo menos 13 productos de amplificación distinto, lo que se utiliza es utilizar los mismos fluoróforos para algunos genes que tienen amplicones de tamaños distintos. De modo tal de que combinando estas diferencias
de tamaño con Diferencias en fluoróforos, podemos obtener la información total. Usualmente se combina esta PCR multiplex con la electroforesis capilar para luego detectar los distintos productos tal como vimos. Y en el detector pueden detectarse las fluorescencias provenientes de los distintos colores h que utilizamos en los fluoróforos de los distintos pares de primers. Les muestro un ejemplo aquí en este electroferograma. Como resultado de haber utilizado múltiples pares de primers con fluoróforos distintos, obtenemos una serie de picos con distintos colores. Recordemos que en el eje vertical la altura de los picos implica la intensidad de la fluorescencia
de cada uno de esos productos de amplificación y en el eje horizontal se separan estos picos en función del tamaño del amplón. Hm. Digitalmente uno puede separar estas señales de distintos colores para hacer un análisis más detallado. Por ejemplo, aquí vemos como separamos el canal de los de aquellos productos de amplificación que tenían un fluoróforo azul en la parte superior y en la parte inferior el canal de aquellos fluorósforos verdes. Notemos que por cómo fueron diseñados los primers, uno puede Saber en qué región obtendremos los productos de amplificación de un microsatélite en particular. Por ejemplo,
de este microsatélite en particular tenemos dos productos de amplificación. Vemos dos picos. H en este caso, para este microsatélite particular, este individuo que analizamos tenía un microsatélite de 12 repeticiones y otro de 13 de este en particular. En Cambio, para este otro microsatélite de este mismo individuo, tenemos un único pico. Esto, ¿qué quiere decir? Que la variante alélica materna y paterna tenían el mismo número de repeticiones. Hm. Entonces, combinando la información de estos múltiples pares de primers asociados a diferentes fluoróforos, uno puede eh conocer el número de repeticiones exactos que un individuo tiene para cada
uno de estas regiones de repeticiones en Tandem y compararlo entonces con potenciales eh sujetos probables eh padres o madres biológicas y determinar la probabilidad de que exista o no una afiliación biológica entre ellos. Por último, me gustaría contarles eh esta última variante de la técnica de PCR que vamos a analizar hoy, que es la TPPCR por triplet prime PCR y que se utiliza en el diagnóstico genético de enfermedades por expansión de tripletes. Este es un conjunto de enfermedades Monogénicas denominadas no clásicas que serán analizadas en profundidad. en un próximo seminario, pero que se caracterizan por
la expansión de una repetición de tres nucleótidos dentro del gen afectado. Entonces, en la población existen variantes alélicas que tienen un rango normal de repeticiones, es decir, no patogénicas. Y estas, por ejemplo, en este caso particular, los individuos no afectados En su variante alélica materna y opaterna tienen entre 5 y 50 repeticiones de este trinucleótido. Una característica de esta enfermedad es que hay algunos individuos que tienen una variante alélica denominada de premutación con un número mayor de repeticiones. Y la premutación se caracteriza por el hecho de que aquellos que portan esta premutación no presentan signos
y síntomas de la entidad patológica, pero Tienen mucha probabilidad de que en sus gametas se produzca una expansión de la mutación h de mayor rango que sí esté asociada luego en la próxima generación a la aparición de signos y síntomas. Como ustedes verán, esta técnica lo que intenta determinar en el contexto en donde hay una hipótesis de que hay una enfermedad de expansión de tripletes detrás de los signos y síntomas de algunos miembros de una familia, es Determinar si un individuo es portador de variantes alélicas con expansiones dentro del rango normal, dentro del rango de
la premutación o de la mutación patogénica. Y ustedes podrán preguntarse, ¿por qué la PCR convencional no podría discriminarlo? Ya que hemos visto que las inserciones, por ejemplo, que las variaciones en la longitud podían ser detectadas por la técnica de PCR. Pero si bien desde el punto de vista teórico eso es así, hay problemas específicos que aparecen para la PCR convencional a la hora de detectar eh expansiones de tripletes. En este caso vemos como ejemplo al gen FMR1, que es uno de los que puede tener en su región 5 prima UTR esta enorme expansión de tripletes.
Decíamos que la limitación de la PCR convencional a la hora de detectar los productos de amplificación de estos Alelos expandidos se da por el hecho de que estas regiones que contienen múltiples repeticiones suelen ser un contexto difícil para que la ADN polimerasa que se utiliza en estas reacciones pueda efectivamente llegar a amplificar todo el fragmento. Y esto origina una serie de errores, una serie de fragmentos no totales del fragmento potencialmente expandido, amplificar, que tienen como consecuencia que no se pueda producir efectivamente la Duplicación de los moldes de ciclo a ciclo y que hacia el final
de la PCR no observemos ningún producto de amplificación en el caso de haber tenido en el molde un alelo expandido. Dicho de manera simple, la PCR falla y no logra amplificar. Cuando solo ponemos un par de primers flanqueando la región potencialmente expandida, no logra amplificar ese fragmento. Hm. Entonces, Si un individuo diploide tiene una variante alélica de un origen parental sin amplificación, esto será amplificado. Pero si tiene como otra variante alélico un aléelo eh expandido, no habrá producto de amplificación y como en el gel solo se verá el producto de amplificación de la variante no
expandida, ahí hay un resultado enmascarado. Estos problemas originalmente se resolvían con una Técnica diferente que era la técnica de southern blood que no veremos aquí porque es una técnica que está siendo dejada en desuso, pero variaciones de la técnica de PCR permitieron solucionar el problema. Para evitar los problemas de la falta de amplificación que se produce con la expansión de tripletes cuando intentamos determinarla con la PCR convencional, esta variante de la PCR utiliza tres primers. Uno de ellos, actuando como primer forward, es Decir, en una de las hebras, se coloca en la región flanqueante de
la amplificación. Luego se utiliza un segundo primer que va a ser complementario a la región de las repeticiones y un tercer primer que va a funcionar como primers reverse, es decir, en la dirección opuesta que va a eh unirse a la hebra complementaria. Consideremos que la utilización de estos tres primers, en particular, el primer que se une a las regiones de las Repeticiones tiene la siguiente particularidad. Este primer puede unirse en cualquier lugar de la región de las repeticiones, generando productos de amplificación diversos cuando genere amplicones eh en combinación con el primer que mira en
la dirección opuesta. Entonces, pensemos que en la reacción de PCR tenemos millones de moléculas que están actuando como moldes y muchas reacciones que se producen simultáneamente. En consecuencia, uno Esperará a partir de esta configuración que se generen, por ejemplo, productos de amplificación eh de distintas longitudes, como decíamos recién, cuando actúa el primer de la repetición y algunos de longitud completa cuando actúen los dos primers flanqueantes. En consecuencia, eh esta técnica tiene la ventaja de que va a permitir estimar la presencia o no de estas variantes Alélicas expandidas eh por dos metodologías. Hm. Por un lado,
eh intentaremos ver si hay amplificación del producto de expansión completo, pero tendremos eh como ayuda en esta técnica la presencia de una serie de fragmentos de distintos tamaños que abarquen las distintas regiones de la repetición. Los resultados de la TPPCR suelen ser analizados mediante una electroforesis capilar. Recordemos que Eh estos resultados de la electrforisis capilar usualmente se visualizan en estos gráficos denominados electroferogramas, en donde en el eje vertical observamos que la altura de los picos eh refleja el nivel de intensidad de fluorescencia de señal, h la presencia de productos de amplificación y su intensidad. Y
en el eje horizontal lo que vemos es la variación en los tamaños de esos productos de amplificación. En este Caso, eh estamos observando distintos rangos de longitudes de esos productos que nos permiten clasificarlos a estas variantes alélicas en la zona normal de premutación o de mutación eh totalmente expandida. Analicemos cómo se ven los resultados en el caso de una variante alélica que posee repeticiones de trinucleótidos en el rango normal. Aquí vemos por un lado un intenso producto de amplificación de la Variante alélica en el rango normal, que es el producto de amplificación de los dos
pares de primers que están en las regiones flanqueantes. Hm. Y también vemos una serie de picos en forma de una escalera que son los producidos por los productos de amplificación en donde actúa el primer que puede unirse a la región de las repeticiones y que por ende puede dar distintos productos de amplificación. Pero toda esta escalera de picos está en también en el Restringida al rango normal porque el rango de repeticiones que poseen esos alelos es relativamente limitado. ¿Cómo se observa? el el resultado del electroferograma cuando hay un individuo que posee una variante premutada, es
decir, con un rango intermedio de expansión de tripletes. En primer lugar, vemos que la serie de picos eh que se produce como consecuencia de los distintos Fragmentos amplificados a partir del primer que se une a la región de repeticiones es más amplia. Sí, tenemos un rango mayor de amplificación de esos productos y además vemos una señal más fuerte eh del producto de amplificación mayor, el producido por aquellos primers que flanquean la región de la repetición, que está centrado en un mayor peso molecular. Hm. Aquí no vemos un pico único porque usualmente mientras más extenso es
el Fragmento a proliferar ocurren una mayor cantidad de errores en los productos de PCR. Hm. También vemos que la altura del pico ha disminuido respecto de la vez anterior, justamente porque es menos eficiente ese producto de amplificación y la cantidad de producto total que obtendremos será menor y su intensidad de fluorescencia, la altura del pico, también será menor. Por último, comparemos esto con un portador de una variante alélica con Expansión completa, en donde vemos que mientras mayor sea el la región expandida, la región de picos hm que se produce como producto de la amplificación del
primer que se unía a la región de repeticiones abarca un rango de pesos moleculares mucho más amplio y vemos que el pico que corresponde a la amplificación de la región región completa tiene menor altura. Esto quiere decir que la eficiencia de su producción es menor. Se Produjeron se produjo en menor cantidad, pero el tamaño de ese producto total es mayor que antes y está en la región de mutación completa. En síntesis, esta técnica TP PCR es una adaptación específica de la técnica de PCR para detectar variantes alélicas por expansión de tripletes. En esta segunda parte
de la clase vamos a estudiar las técnicas basadas en la secuenciación de ADN que se utilizan en el contexto de la Genética médica. Este conjunto de técnicas se focalizan en determinar el orden de pares de bases que están presentes en un fragmento determinado de ADN. Y dentro de este conjunto de metodologías vamos a analizar en primer lugar el método de secuenciación desarrollado por Frederik Sanger, que obtuvo el Premio Nobel de Química en 1980 gracias a este desarrollo y que, como veremos, fue la Metodología que se utilizó para producir la primera secuenciación del genoma humano en
el contexto del proyecto genoma humano. Luego abordaremos desarrollos posteriores de los últimos 15 a 20 años que basados en los métodos de secuenciación de Sanger permitieron expandirlo y que se denominan en conjunto metodologías de secuenciación de alto rendimiento, también conocidas como next generation sequencing o high throughput Sequencing. Para comprender la metodología de la secuenciación de Sanger, tenemos que volver a analizar algunos mecanismos moleculares que están implicados en la polimerización de los ácidos nucleicos, ya que es la bioquímica particular de la polimerización la que utilizó Sanger como fundamento de su técnica. Recordemos nuevamente que durante el
proceso de polimerización de nucleicos, la ADN Polimerasa utiliza una hebra de ADN en simple cadena como molde, pero que no puede polimerizar de novo, sino que solo puede extender una hebra previamente apareada que tenga un extremo tres prima hidroxilolibre. vemos en el sector derecho de la diapositiva con mayor detalle molecular a este extremo tres prima hidroxilo. Estamos viendo que el último nucleótido agregado a una cadena en la posición tres prima del azúcar tiene un grupo Hidroxilo que será utilizado para formar un nuevo enlace covalente con el nucleótido entrante, formando un enlace fosfodiéster, eh permitiendo la
incorporación del nuevo núcleotó. Luego el que funcionará como próximo nuevo nucleótido terminal de la cadena tendrá a su vez otro extremo tres prima hidroxilo que funcionará del siguiente del del de modo similar, es decir, permitiendo la incorporación del Nucleótido subsiguiente. Teniendo en cuenta esto, Sanger ideo utilizar variantes de los nucleótidos que impidiesen el desarrollo de la polimerización. Aquí vemos un nucleótido estándar que tiene el grupo hidroxilo asociado al carbono 3 prima del azúcar y una variante que fue la que utilizó Sanger que se denominan dideoxi ribonucleóxidos trifoosfatu donde se carece de este grupo hidroxilo en
Posición tres prima. Si uno en una reacción de polimerización invitro agrega estos dideoxi nucleótidos, es decir, nucleótidos que carecen de este extremo tres primo hidróxilo, una vez que estos son incorporados, finalizan la polimerización porque ningún nucleótido podrá incorporarse uniéndose a ello, ya que carecen de este grupo funcional que permitía la incorporación del nuevo nucleótido. ¿Cómo entonces esta Bioquímica particular le permitió a Sanger idear una metodología para la secuenciación de los ácidos nucleicos? Pensemos en una reacción de polimerización que ocurre en un eh tubo de laboratorio. Así se introduce los sustratos de la polimerización, una ADN
polimerasa, los DNTPs, es decir, desoxirribonucleótidos de adenina, guanina, citosina y Timina y cantidades pequeñas de dideoxucleótidos de las cuatro clases. Hm. Además, pensemos que estos diveoxinucleótidos, que están en cantidades mucho más pequeñas que el resto de los nucleótidos naturales, van a estar marcados cada uno de ellos con un fluoróforo diferente. Por otro lado, se agrega el molde, que será un fragmento de ADN del cual se quiere determinar la secuencia De bases que posee. Ustedes pensarán que será necesario la información eh de la secuencia de este fragmento para diseñar un primer necesario para introducir eh como
condición de posibilidad de funcionamiento del ADN polimerasa. Eh, un truco bioquímico que se utilizó en este contexto fue agregar químicamente en el extremo de la molécula de ADN que se quería Secuenciar, es decir, de la cual se desconocía aún su secuencia de nucleótidos, un fragmento de ADN que aquí estamos representando con esta línea verde de secuencia conocida. M cuando se une químicamente este fragmento de secuencia conocida, uno podrá diseñar un primer complementario, esta secuencia conocida y que permita actuar entonces como iniciador de la polimerización de la región que aún se desconoce. Aquí no estoy representando,
Pero imaginemos entonces que un primer complementario a esta región conocida diseñada por el investigador se agrega también a esta reacción de polimerización. Pensemos entonces en esta reacción que si bien nosotros estamos representando a la hebra en cadena simple, que originalmente esta hebra se encuentra en cadena doble, pero que solo vamos a utilizar un único primer hencia de la PCR que se pegue a La hebra que va a ser utilizada como molde. Hm. Imaginemos como segunda instancia para complejizar la representación de lo que está ocurriendo aquí, que esta reacción está ocurriendo millones de veces dentro de
este tubo en forma paralela. Esto, ¿qué quiere decir? Que no hay una única ADN polimerasa y un único conjunto de estos núcleótidos, sino que estos componentes están por millones y el molde y los primers también se Encuentran por millones. Entonces, imaginemos que comienza la reacción de polimerización y entonces eh los primers que aquí no estamos representando se unen a la región conocida que fue adherida en un extremo de la molécula y comienza la polimerización. Como la mayoría de los componentes naturales están en exceso, lo más probable es que en la mayoría de los millones de
moléculas que tenemos como Molde, la polimerización ocurra de manera completa. Pero en algunas de las moléculas dentro de ese tubo, por azar, la ADN polimerasa puede poner justo en el primer nucleótido a polimerizar un dideoxi. Y en esa molécula que se polimerizó con ese dideoxi, allí terminará la polimerización de esa molécula. No podré incorporar ningún núcleótido más. Lo mismo ocurrirá con la segunda posición. La mayoría de las Moléculas siguen su polimerización, pero habrá un subconjunto pequeño que justo incorporarán por azar en el la segunda posición de polimerización se mete un dideoxi nucleótido que será complementario
al molde y será polimerizado y termina la polimerización. Esto ocurrirá entonces de manera seguida en cada una de las posiciones de la polimerización y cuando esta reacción termine en ese tubo tendremos una mezcla Compleja de moléculas totalmente polimerizadas, es decir, que no incorporaron ningún dideoxi, pero habrá seguramente un subconjunto de moléculas que han terminado en cada una de las posiciones posibles dentro de la polimerización. Y esto ocurre porque son millones y millones de moléculas las que participaron dentro de la polimerización. Y entonces estadísticamente es lo más probable es Que en todas las posiciones haya por
lo menos un subconjunto de moléculas representadas. Esto, ¿qué significa? que todas estas moléculas en las cuales se interrumpió en distintas partes su polimerización tendrán distintas longitudes. Hm. Variarán en su longitud de uno en uno. Y nosotros sabemos que una técnica para separar a las moléculas de ADN según su tamaño es la electroforesis. Hm. la electroforesis en una matriz porosa, por ejemplo, en un Gel de agarosa o en un capilar que tenga una matriz porosa. Y al separar estos fragmentos según su tamaño, cada uno de los fragmentos, podremos identificar cuál es el nucleótido que estaba al
final, porque cada uno de ellos emitía una luz fluorescente dependiendo del fluoróforo que haya sido utilizado, marcando ese de modo tal que analizando según su tamaño los eh la luz Emitida por cada uno de estos floróforos podrá reconstruir la secuencia de nucleótidos que componía a ese fragmento. Este procedimiento usualmente se realiza utilizando no un electroforesis en gel común, sino un electroforesis capilar, tal cual analizamos en la primera parte de la clase. Y los resultados se observan como estos Electroferogramas, en donde observamos una serie de picos de fluorescencia que nosotros ahora sabemos que cada una de
las posiciones implica un fragmento que difiere en un nucleótido de longitud respecto del otro. Y el tipo de luz fluorescente que se observa en cada una de estas posiciones permite ser decodificado digitalmente eh con la naturaleza de alguno de los nucleótidos, ya que los Distintos fluoróforos reportan a cada uno de los cuatro nucleótidos del ADN. Y de este modo podemos obtener digitalmente, luego de esta análisis del de la electroforis capilar, la secuencia de nucleótidos eh del fragmento que fue analizado por la secuenciación de Sanger. Observemos esta particularidad. Pensemos que hemos obtenido mediante la secuenciación de
Sanger de un gen en particular de tres Individuos tres resultados distintos. Estos tres individuos tienen altas similitudes en esta región eh de un del gen en particular que fue analizado, pero el individuo que está representado en el en el electroferograma superior en esta posición tiene un nucleótido de adenina. Hm. En cambio, el individuo que está representado en el electroferograma inferior, en esta misma posición tiene un nucleótido de guanina. Es decir, esta técnica por un lado nos permite Distinguir variantes alélicas que están presentes en distintos individuos, pero me gustaría señalar al individuo que está representado por
el electroferograma del medio, en donde en esta misma posición aparecen dos picos de manera simultánea. Un fluoróforo que reporta que en esa posición hay adenina y otro fluoróforo que reporta que en esa misma posición hay guanina. Para interpretar correctamente este electroferograma, tenemos que recordar Que nuestro material genético es diploide. Entonces, podría ocurrir que si las variantes alélicas maternas y paternas difieren en su secuencia, en una misma posición aparecerán dos picos eh diferentes. En otras palabras, esta este doble pico que está siendo representado en el electroferrama del medio nos está indicando un individuo que tiene esta
variante alélica en heterosigosis. Este método de secuenciación de Sanger Fue ampliamente utilizado hasta el año 2000, pero una de sus particularidades que puede pensarse como una limitación es que por cada experimento de Sanger se secuencia una única clase de molécula. ¿Sí? Por ejemplo, puede secuenciarse un exón particular de un gen o un gen si este gen es pequeño por vezes. Hm. Y si bien tiene una alta fidelidad en la secuenciación, sus costos son relativamente elevados. Hm. O sea, esto implica que solo se utiliza si hay Alguna razón clínica para sospechar que hay alguna variante eh
relevante en un gen en particular. Hm. Porque solo orientándonos por la clínica o por esta hipótesis iremos a secuenciar ese gen o ese exón de ese gen de manera determinada. Hm. Es decir, no aplicaríamos la técnica de secuenciación de Sanger si tenemos una hipótesis mucho más general de que podría haber una variante patogénica en el genoma, pero Desconocemos cuál es el gen en cuestión. Para este otro tipo de preguntas, eh, podrían ser más adecuadas variantes basadas en la secuenciación de Sanger, que son los métodos de secuenciación de alto rendimiento. ¿Cuál es la diferencia fundamental? que
a diferencia de en secuenciaba un única una única clase de moléculas por vez, en esta clase de métodos se secuencian millones de moléculas en paralelo y podrían Secuenciar, por ejemplo, el genoma completo de un individuo a un costo relativamente accesible y en tiempos mucho más cortos. Si bien nosotros no vamos a analizar nuestro objetivo de la materia, analizar la bioquímica de el procedimiento de secuenciación de alto rendimiento, este implica extracción de ADN de un individuo, la fragmentación de estas moléculas de ADN, la secuenciación de de los fragmentos en paralelo y luego Un análisis bioinformático en
donde los fragmentos secuencia ados se alinean con el genoma completo de referencia que está en las bases de datos públicamente disponibles y esto permite inferir cuáles son las diferencias que se encontraron en un individuo del cual se extrajo el ADN y se hizo este procedimiento en comparación con el genoma humano de referencia. Esta metodología de manera creciente se está utilizando en el contexto de la genética Médica y tiene la dificultad de que se encuentran muchas variantes respecto del genoma humano de referencia, pero no siempre es simple determinar si esas variaciones que fueron encontrados tienen una
relación causal con la patología o si son simplemente variantes no patogénicas eh que reflejan la diversidad genética de la población. Hm. Me gustaría finalmente mencionar respecto de esta técnica que no solo permite hacer secuenciaciones del genoma Completo, sino que en algunos contextos podrían secuenciarse subconjuntos del genoma. Por ejemplo, solo quedarnos con las regiones exónicas del genoma, que son un porcentaje mucho menor y que permiten focalizarnos en las variaciones que ocurren en aquellas regiones codificantes del genoma. Para terminar esta clase, me gustaría poner en contexto los eh cuáles serían algunas situaciones en donde todas las técnicas
que hemos Analizado hoy podrían ser relevantes. Por ejemplo, pensemos que estamos en el diagnóstico molecular de entidades monogénicas. Una primera pregunta es si la clínica, los signos y síntomas de el individuo que nos ha consultado nos indujo a pensar en en que hay un gen particular que es el responsable de los signos y síntomas que presenta el individuo. y por la historia previa, porque ya hay Descripto síndromes o características clínicas que nos sugieren fuertemente una patología, estaremos eh en ciertas condiciones de de hacer un diagnóstico molecular que son diferentes de si no tenemos, por ejemplo,
una hipótesis fuerte. Si no lo tenemos, probablemente tenemos que utilizar una técnica libre de hipótesis, ¿sí? una técnica no sesgada como la secuenciación de alto rendimiento. Hm. Y allí eventualmente encontraremos o no Variantes en ese individuo que difieren quizás del genoma humano de referencia. Hm. Y podríamos eh elaborar una hipótesis respecto de si esa variante es causal para producir la patología. Por ejemplo, podríamos corroborar esa hipótesis si se ha encontrado esta misma variante en otros individuos que tienen los mismos signos y síntomas o si en el contexto de la investigación básica se ha demostrado alguna
consecuencia funcional negativa De la aparición de esa variante en la función proteica, por ejemplo, si es que esa variante está en una región codificante. Pero imaginemos el otro escenario que los signos y síntomas eh nos permiten elaborar una hipótesis respecto de cuál es el gen que está involucrado en esta enfermedad. La siguiente pregunta es si hay mutaciones frecuentes que ya están descrptas para ese gen. Y en el caso de que no haya Mutaciones frecuentemente descrptas, uno podría hacer una secuenciación de sanger de ese gen y nuevamente ver en ese gen en particular en que fue
sugerido por mi hipótesis clínica si hay variantes eh respecto del genoma humano de referencia o no y si esas variantes han sido reportadas como patogénicas o no. Pero en el caso de haber mutaciones frecuentes o de que ya se hayan encontrado por otras metodologías cuáles son las mutaciones presentes en una Familia particular, podría utilizar técnicas más sesgadas. O sea, si yo busco una mutación o una variante alélica en particular, podría utilizar las técnicas basadas en PCR dependiendo de la naturaleza de esa mutación. Por ejemplo, hemos visto que si la mutación eh que estamos buscando es
de inserción o de delesión, podríamos hacer una PCR convencional. Dado que la diferencia en el tamaño de los productos De amplificación, los amplicones podrían reportarnos esas diferencias alélicas. Vimos que en el caso de las mutaciones de sustitución, las variantes de la técnica de PCR adecuadas son, por ejemplo, la PCR aleloes específica o la PCR RFLP. Y en el caso particular de que nuestro contexto clínico implique pensar en que hay una enfermedad por expansión de tripletes, utilizaríamos la TPPCR, la Triple Prime PCR, ya que la otra técnica Eh no basada en PCR, la técnica de South
and Blood, es una técnica que eh si bien en algunos contextos se sigue utilizando, cada vez cae más en desuso por sus dificultades de implementación. También vimos que eh o una variante de la técnica de PCR, en particular la PCR multiplex, se utiliza en el contexto molecular de la genética forense. Aquí no hay una entidad patológica en juego, sino que lo que se busca es determinar cuál es el Perfil de repeticiones en tandem cortat, en particular de los microsatélites, en el contexto de las técnicas de filiación, por ejemplo, u otras técnicas asociados a la genética
forense. Con esto terminamos la clase de hoy y nos veremos en un próximo encuentro. Yeah.
