PCR: Reacción en cadena de la polimerasa [TEÓRICO Y PRÁCTICO]

en 1986 el bioquímico estadounidense kary mullis desarrolló un método de laboratorio que permite multiplicar enormemente el número de moléculas de adn de una muestra desconocida de tamaño ínfimo la técnica llamada reacción en cadena de la polimerasa o pcr por sus siglas en inglés le valió el premio nobel en 1993 siete años después de publicar sus resultados experimentales en el vídeo de hoy vamos a ver la pcr reacción en cadena de la polimerasa vamos a ver primero una parte teórica y al final del vídeo una parte práctica bienvenidos a una nueva edición de nutrimentos la pcr

se vale de un proceso que ocurre en forma permanente en los sistemas vivos y que hemos analizado en detalle en la serie del adn y su replicación la duplicación del adn por medio de ciclos de desnaturalización copiado y re aparentó de la doble cadena de adn que se quiere amplificar en unas pocas horas y sin necesidad de usar células vivas se pueden obtener millones de copias in vitro para poner en práctica esta técnica se requiere sintetizar dos fragmentos cortos de adn complementarios al comienzo y al final de la secuencia específica que se quiere amplificar llamados

cebadores o prime art para entender esto mejor vamos a representarlo gráficamente cada una de estas líneas representa una de las hebras de adn complementarias de nuestra muestra puede ser una muestra de adn de una persona de una planta de un animal de una bacteria o de un virus por ejemplo lo primero que hacemos es elegir un fragmento de todo este genoma que queramos amplificar puede ser un fragmento corto como por ejemplo de 50 pares de bases o menos o más largo como de dos mil pares de bases el fragmento que elijamos amplificar va a depender

del objetivo que tengamos para hacer la pcr una vez que tenemos elegida la secuencia a amplificar debemos sintetizar los prime er que son pequeños fragmentos de adn simple cadena de alrededor de 20 pares de bases complementarios a la zona el comienzo y el final de la zona de interés y de esta manera la delimitan los dos primeros tendrán secuencias diferentes ya que serán complementarios a distintas zonas del adn para diferenciarlos se los denomina prime air forward y 1er rivers hay que considerar que el producto final de la pcr incluye a las zonas complementarias a los

prime ans una vez que tenemos los primers la muestra de adn se coloca en una solución que contiene adn polimerasa los cuatro nucleótidos en cantidad y los primers mencionados el método se basa en la repetición cíclica de tres reacciones sucesivas primero ocurre la desnaturalización la solución se calienta para que las dos cadenas de adn se separen la temperatura de la cual la doble hélice se desnaturaliza depende tanto del largo del fragmento como del contenido de hesse mientras mayor sea el contenido de jefe mayor debe ser la temperatura de desnaturalización y mientras mayor sea el largo

del adn molde mayor debe ser el tiempo de desnaturalización en general la temperatura utilizada es 94 grados ya que a lo largo de 30 ciclos es la máxima temperatura que las enzimas comúnmente usadas pueden soportar sin una pérdida sensible de actividad para una pcr estándar se recomiendan 30 a 45 segundos a 94 grados luego viene la etapa de hibridación o deán y link en la que la temperatura se reduce para permitir que los primers se aparecen por complementariedad de bases con el adn mol de la temperatura de hibridación o any link es crítica dado que

una alta temperatura de any link impedirá que el primer aparece con el adn molde mientras que una baja temperatura favorecerá el apareamiento consecuencias que no son 100% complementarias dando como resultado amplificaciones inespecíficas este parámetro debe ser determinado experimentalmente y depende del contenido de hesse y ate de los primers y de su longitud en general suele rondar los 55 a 60 grados centígrados por último en la etapa de polimerización la adn polimerasa cataliza la síntesis simultánea de las dos cadenas a partir de cada fragmento que actúa como primer la polimerización o extensión se realiza de 68

a 72 grados dependiendo de la enzima utilizada y se calcula un minuto por cada 1000 pares de bases a amplificar al cabo del primer ciclo de tres reacciones el fragmento de adn elegido se ha duplicado y por lo tanto se ha duplicado la cantidad de adn molde disponible para el segundo ciclo lo mismo ocurre después de cada ciclo de replicación y así se produce una amplificación exponencial de moléculas ahora veamos los factores que afectan la eficiencia y especificidad de la pcr de los tantos factores que pueden afectar la eficiencia y la especificidad de una pcr

el más crítico es el diseño de los primers dado que un olivo nucleótido de 15 bases estaría representado por azar una única vez en un genoma como el humano y en pos de la especificidad de la pcr los primers son típicamente sintetizados como oligonucleótidos de 15 a 24 bases de cualquier manera es altamente recomendable cerciorarse mediante una búsqueda en la base de datos apropiada de que los primers de interés no amplifican ninguna otra secuencia que la deseada si bien existen numerosas recomendaciones para un diseño de tramarsa exitoso las cuales pueden ser consultadas en varios libros

internet etcétera hoy en día existen numerosos programas muchos de ellos gratuitos que los diseñan automáticamente basándose en criterios termodinámicos y estructurales el éxito de esta técnica depende del uso de una adn polimerasa que no sea desnaturalizada por los repetidos ciclos de calentamiento esta enzima se aisló originalmente de la bacteria termófila termos acuáticos de ahí su nombre tag de enea polimerasa y luego han ido surgiendo diferentes variantes todas las enzimas utilizadas poseen la actividad de polimerasa 5 prima tres primas y algunas poseen además actividad exo nucleasa 5 prima 3 prima o actividad exxon nuclear 3 prima

5 prima es decir actividad correctora o profería las distintas enzimas utilizadas poseen distintas process y vida des tasas de error y dejan distintos tipos de extremos todas las adn polimerasas termoestables requieren de cationes dehiba lentes para su actividad en general magnesio y en menor medida manganeso los cuatro tipos de nucleótidos trifosfato adn tps y los primers son capaces de interaccionar con el magnesio por lo que la modalidad de este último debe ser mayor que la polaridad del grupo fosfato aportada por los de ntp si primers de esta manera la concentración óptima de magnesio debe ser

analizada empíricamente en cada caso siendo un buen punto de partida 15 mínimo la clásicamente se utiliza un buffer comercial que ya viene preparado a veces este buffer puede atraer incluido el magnesio y no hace falta agregar aparte en la reacción una típica reacción de pcr contiene cantidades equipo lares 200 a 250 micro molar de cada uno de los 4 de ntp s que son las bases que va agregando la tag polimerasa a medida que avanza la reacción la solución madre desde n tps debe estar guardada a menos 20 grados en pequeñas alícuotas para evitar repetidos

ciclos de congelado y descongelado debido a la amplificación exponencial la pcr es una técnica muy sensible que permite detectar secuencias que se encuentran mínimamente representadas en una muestra por ejemplo se pueden amplificar segmentos de adn humanos a partir de las pocas células foliculares que rodean a un solo pelo la pcr resulta muy útil en el diagnóstico del adn en otras palabras en la comprobación de la presencia de un gen o de una mutación en un gen específico oa nivel preparativo en la amplificación de un segmento determinado por este motivo la técnica de pcr se usa

para la detección de enfermedades hereditarias la identificación de huellas genéticas que se usan mucho en el ámbito forense el clonado de genes las pruebas de paternidad y el diagnóstico de enfermedades infecciosas como el co vida desde la creación de la técnica de pcr sus aplicaciones se multiplican día a día y su gran versatilidad promete más y nuevos usos en los más diversos campos de la biología y la medicina ya vimos la teoría ahora vamos al laboratorio virtual y vamos a ver cómo sería el procedimiento de la pcr en la práctica luego de colocarnos todos los

instrumentos de protección tenemos que preparar el área de trabajo con los materiales que necesitaremos si no estás familiarizado con los instrumentos del laboratorio te recomiendo que veas primero las partes 1 y 2 de los vídeos de instrumentos de laboratorio al inicio de esta serie como es muy importante que la mezcla de reacción no se contamine con ningún adn que no sea el de interés puede realizarse la primera parte del procedimiento dentro de una cabina de pcr que funciona con la misma lógica que los flujos laminar es que vimos en la segunda parte de los vídeos

de instrumentos de laboratorio dentro de la cabina vamos a ubicar las pipetas automáticas los racks con tips un descarte para tirar los tips usados y una gravilla con los tubos de los reactivos y los tubos eppendorf vacíos donde haremos la reacción de pcr ya mencionamos antes cuáles son los elementos necesarios para hacer la pcr el buffer con magnesio la mezcla en partes iguales de los cuatro de ntp s los primers la tag polimerasa y la muestra de adn que contiene el fragmento que queremos amplificar que se llama adn templado o molde iremos repitiendo la cantidad

correspondiente de cada uno de estos elementos dentro de un tubo de pendón teniendo en cuenta que es importante mezclar bien todos los reactivos antes de pipe t ar generalmente se realiza lo que se llama una master mix que es una mezcla de reacción de mayor volumen para evitar los errores de ppt o que generan los volúmenes muy pequeños esto sirve además cuando se hacen duplicados o triplicados ya que asegura que todos los tubos tengan exactamente la misma cantidad de todos los reactivos o cuando se quiere modificar una sola variable manteniendo las demás constantes en este

caso será una master mix con todos los elementos menos uno el cual se agregará de forma individual y diferenciada en cada uno de los tubos individuales de reacción aquí vemos un ejemplo de protocolo de una pcr donde se indica la cantidad de cada uno de los reactivos que tendrá cada muestra individual tengamos en cuenta que esto es sólo un ejemplo y que cada reacción requiere una puesta a punto donde pueden modificarse diferentes variables en este ejemplo también se calcula la cantidad de apipé t ar para hacer una master mix que permita generar 10 muestras siempre

se calcula un además por lo menos por el error de pipe t o para que sobre un poco una vez hecha la master mix se trasvasa la cantidad de microlitros necesarios a tubos de 0.2 mililitros para comenzar la reacción el volumen final de reacción suele ser entre 15 a 50 microlitros si vamos a llenar muchos tubos o pósitos de una placa con la misma master mix se puede utilizar una pipeta multicanal en este paso para optimizar el tiempo cuando ya tenemos todos los tubos listos se ubican dentro de un termociclador como el que vimos en

la segunda parte de instrumentos de laboratorio se programa de acuerdo al protocolo de amplificación que queramos hacer y se comienza este es un ejemplo de protocolo de amplificación de 35 ciclos como vimos al principio incluye la temperatura de desnaturalización la temperatura de annie link y la temperatura de extensión además hay una incubación inicial que asegura que todo el adn esté desnaturalizado al comienzo de la reacción y agregamos un segundo a 25 grados al final para que todas las muestras bajen su temperatura rápidamente cuando terminan los ciclos esto es opcional una vez terminada la pcr si

todo salió bien y el fragmento de interés estaba presente en el adn templado tendremos los tubos con millones de copias de ese fragmento pero para poder visualizarlo de alguna manera tenemos que continuar con otra técnica la electroforesis en gel de agarosa que veremos en el próximo vídeo de esta serie si este vídeo te sirvió para aprender o comprender mejor este tema o si simplemente te gustó por favor dale like it' e invitó a suscribirte al canal para poder tener a mano mucha más información porque lo que sabes influencia tu destino [Música]