¿Qué es y cómo funciona la PCR?

La famosa PCR, de l'anglès Polymerase Chain Reaction o Reacció en Cadena de la Polimerasa en català, és una tècnica comunament usada en biologia molecular per multiplicar ràpidament un fragment específic d'ADN començant amb una quantitat mínima d'aquest. Tot i que, idees similars van apareixer en 1971, la PCR va ser ideada pel bioquímic Kary Mullis el 1983, el que li va valdre el premi Nobel de química una dècada més tard. La importància d'aquesta tècnica resta en què, mitjançant una quantitat molt petita d'una molècula d'ADN d'interès, podem aconseguir milions de còpies, però com ho fem?

Els ingredients bàsics per a preparar una reacció de PCR són: el fragment d'ADN motlle, que volem amplificar; dNTPs o, dit d'una altra manera, les peces bàsiques d'una molècula d'ADN; 2 encebadors complementaris a les brins de l'ADN motlle; ADN polimerasa, un enzim encarregada de sintetitzar molècules d'ADN a partir de dNTPs. Aquest enzim ha de ser termoestable, per això la més comunament usada és la Taq polimerasa. Ions bivalents, com Magnesi o Manganès, que ajuden a la feina de la ADN polimerasa.

Una vegada coneixem els ingredients bàsics, anem a preparar el còctel! Una reacció de PCR consta de 25-45 cicles. Cada cicle consistirà en 2-3 passos o canvis de temperatura, en aquest exemple farem servir 3 canvis de temperatura per cicle.

Comencem amb el primer cicle! El pas inicial consisteix en la desnaturalització de l'ADN o, dit d'una altra manera, la separació de les 2 brins que el componen. Aquest pas sol realitzar a una temperatura de 94ºC.

El següent pas és l'hibridació, la qual passa a una temperatura més baixa; aquesta temperatura dependrà dels encebadors, però acostuma a ser entre 45-68ºC i sol trigar 15-60 segons. En aquest pas els encebadors s'uniran a la seva seqüència complementària de l'ADN motlle. El pas final de l'cicle és l'elongació.

En aquest, l'ADN polimerasa sintetitzarà una cadena complementària a l'ADN motlle utilitzant els dNTPs lliures. La síntesi prendrà com a punt d'inici l'encebador i treballarà en direcció 5 '-> 3'. La temperatura d'aquest pas dependrà de l'ADN polimerasa utilitzada, en el cas de la Taq polimerasa utilitzarem temperatures d'aproximadament 68ºC.

Els passos de desnaturalització, hibridació i elongació constitueixen un cicle. Després de l'últim cicle i per assegurar-nos que tot l'ADN ha estat amplificat, es realitza una elongació final, que dura entre 5 i 15 minuts. Un cop finalitzada la reacció, aquesta es pot conservar per un temps indefinit a 4ºC.

Un cop coneixem com funciona la PCR, parlem de les seves aplicacions. Aquesta tècnica es fa servir rutinàriament en diferents àrees com: en investigació, en medicina amb fins diagnòstics, en paleontologia, en ciències forenses. Per il·lustrar-ho millor vegem un exemple: Imaginem que volem estudiar la presència d'un virus en una mostra humana.

Si coneixem el genoma del virus, el primer que hem de fer és buscar una regió que sigui específica d'aquest i que no trobem en el genoma humà. Un cop tenim aquesta regió, dissenyarem diferents encebadors per poder amplificar. En el cas que la persona estigui infectada pel virus, mitjançant una PCR podrem amplificar i detectar la regió de l'ADN viral prèviament seleccionada mentre que, si aquesta persona no es troba infectada, a falta d'un ADN motlle, no hi haurà amplificació de material genètic i tampoc serà detectable.

Encara que en aquest vídeo hem cobert els conceptes bàsics de la PCR, hi ha desenes de variacions d'aquesta tècnica. Podem fer petites modificacions en el protocol bàsic, o bé podem canviar components, com la polimerasa utilitzada o la concentració d'ions bivalents; fins i tot és possible afegir passos abans o després de la reacció de PCR com, per exemple, en cas de treballar amb ARN en comptes d'ADN. Com hem vist, la PCR és una tècnica increïblement versàtil i amb infinitat d'aplicacions en diferents camps.