OPERANDO UM HPLC NA PRÁTICA

pessoal nós vamos falar hoje sobre hplc né que é e High Performance Liquid cromatógrafo ou cromatografia líquida de alta eficiência ou de alta performance que também pode ser chamado de Clai em português né que é cromatografia líquida de alta eficiência vocês vão encontrar a sigla em inglês HPC e a sigla em português cli o que que é essa técnica ela é o nome já tá dizendo né é uma cromatografia de alta eficiência a a cromatografia é o quê é a capacidade é uma técnica que separa compostos de uma mistura complexa a depender principalmente da sua

polaridade né da sua polaridade da molécula entre o assim de uma forma muito simplificada Ok esse equipamento é um equipamento então que ele vai servir para quê quando eu quero isolar uma substância de uma mistura complexa se eu quiser por exemplo ah separar compostos de um extrato vegetal né é uma coisa que a gente trabalha bem aqui no laboratório Eu tenho um extrato onde tem várias substâncias e eu quero isolar uma da outra eu posso usar o hplc para identificar esses compostos e isolar e também fazer uma outra coisa que é muito legal que é

quantificar Ou seja eu quero saber qual é a quantidade desse composto que tem naquela mistura complexa as aplicações desse equipamento são as mais diversas possíveis por exemplo eu quero dosar vitamina no plasma humano eu quero dosar vitamina numa fruta eu quero dosar vitamina no leite eu posso fazer Ah eu posso aqui utilizar o equipamento para identificar tanto compostos mais polares como compostos mais apolares né apolares são aqueles compostos por exemplo mais parecidos com o exan certo que é um solvente orgânico os polares são aquelas substâncias mais parecidos com a água o o que que vai

[Música] eh o que que vai definir se o composto pode ou não ser medido no HPC é a resposta do composto ao detector só um exemplo açúcares né Glicose sacarose n frutose são elementos muito difíceis de serem medidos no hplc por eles não respondem muito bem à fluorescência eles não responde muito bem ao V ao V normal então assim para eu detectar um açúcar em hplc eu preciso de um detector por exemplo de índice de refração ou são detectores que são que respondem né ao ao componente que eu tô querendo detectar agora por exemplo um

flavonoide flavonoide né que muitos aqui trabalham com flavonoides é muito simples de detectar no no HPC porque o flavonoide ele tem uma excelente absorção do UV então eu consigo a partir do detector de uv fazer essa detecção essa determinação de um flavonoide qualquer composto natural que tem uma boa absorbância na região do V e do visível ele vai conseguir ser detectado muito bem aqui por esse tipo de equipamento então só pra gente só pra gente resumir então o hplc é um equipamento que serve para eu isolar identificar e quantificar substâncias de misturas complexas tá essas

misturas complexas são as minhas amostras pode ser uma amostra biológica o sangue O plasma a urina o Lico pode ser um extrato vegetal pode ser sei lá um produto finalizado né um produto pronto um alimento um medicamento tudo isso pode pode ser detectado em por hplc pode ser usado em hplc para nós farmacêuticos né a na Indústria Farmacêutica esse equipamento ele é muito utilizado por exemplo para fazer controle de qualidade de medicamentos Ou seja eu fiz uma forma farmacêutica eu quero saber se aquela forma farmacêutica tem a quantidade do elemento que eu tô dizendo que

ela tem por onde que eu vou dosar usando o hpmc né se esse esse ess esse o produto ativo né ele tá puro ele tá ele tem uma pureza adequada O equipamento também consegue me dizer isso né Nós vamos ver daqui a pouco se eu injetar o injetar o o ativo né injetar substância e eu ver que saiu um pico único lá eu vou dizer ó esse esse ativo ele tá puro e essa pureza também é uma uma característica que o equipamento pode detectar dá um pause aí que aí depois eu só queria saber se

Então nós vamos falar agora do equipamento em si né Quais são as partes do equipamento o egpc é um equipamento modular Ou seja eu posso e ter um equipamento com três com cinco com 10 módulos diferentes aí depender do meu tipo de equipamento e da do quanto de dinheiro eu tenho para comprar esses módulos por exemplo nesse equipamento Eu tenho dois detectores Mas eu posso aqui ter um detector de massas eu posso ter um detector eletroquímico eu posso ter um detector de infravermelho eu posso ter um detector de e sei lá mais variados tipos de

detector de troca iônica existem e muitos tipos de detectores mas nesse equipamento aqui o que que nós temos nós temos uma bomba essa bomba ela Qual é o objetivo dela é fazer o bombeamento da fase móvel né das fases móveis para o sistema Então essa bomba aqui é uma bomba quaternária né é uma bomba que ela tem quatro canais Então ela tem o canal A B C e D os canais eles estão identificados em cada caninho desse Ó tem uma numeração tem uma letra tá bem pequenininha aqui mas tem uma letra Então aqui o canal

a canal B canal c e canal D no caso aqui tem cinco porque o outro canal ele é para mesa do do injetor automático Tá mas assim quando a gente for ligar aqui vocês vão ver ah canal a canal B como é que eu sei escrito bem aqui assim normalmente esse tipo de equipamento a gente e aqui a gente preconiza o seguinte a gente usa o canal a na água e o canal B na fase mais Apolar a fase móvel para HPC e de fase reversa que é o que a gente tá fazendo aqui normalmente

é uma fase e a cromatografia de fase reversa é quando eu tenho a fase móvel mais polar e a fase estacionária que é a minha coluna mais Apolar tá bom isso que eu chamo de fase reversa então se a fase móvel é mais polar ela normalmente é uma mistura de água e metanol ou água e acetonitrila Tá bom então normalmente são assim 90% das vezes são os solventes que a gente usa e quando que eu uso o metanol e quando que eu uso a acetonitrila aí eu vou pras polaridades quem é mais Apolar acetonitrila ou

metanol hã quem mais Apolar acetonitrila ou metanol acetonitrila o metanol lembra meoh ele é mais parecido com água então ele é mais polar então a depender da minha substância alvo aquela substância que eu tô querendo isolar eu posso querer uma fase móvel um pouquinho mais Apolar ou um pouquinho mais polar Lembrando que como funciona a cromatografia quanto mais parecida for a minha fase móvel com a minha fase estacionária mais ela vai arrastar a substância quanto mais diferente for a minha fase móvel da minha fase estacionária mas ela vai reter a substância e eu quero que

ela corra mais rápido ou quero que ela retenha mais depende depende do Meu método tem métodos que eu quero que ela retenha mais para separar melhor ó e tem métodos que eu quero que ela corra mais rápido para sair mais rápido para afinar o pico certo então isso não é uma resposta não tem uma resposta pronta o que eu tô dizendo é que normalmente a fase móvel aqui ela é uma mistura de água e metanol ou água e acetonitrila nós usamos bem mais aqui o metanol do que acetonitrila e normalmente é o que é mais

usado mesmo normalmente é água e metanol essa água ela pode ser tamponada Ou seja eu posso alterar a o PH porque as moléculas dependendo do tipo de molécula que eu vou separar ela pode ter uma carga e essa carga vai ser influenciada pelo PH da fase móvel Eu posso também colocar modificadores de PH na fase móvel que eu já tô complicando eu falei que ia falar rápido mas já tô complicando um pouco mas é porque são muitos detalhes Mas beleza só pra gente não não se perder aqui a a fase móvel normalmente é água e

metanol ou água e acetonitrila tá pode ter os dois pode posso ter três aqui água metanol e acetonitrila essa bomba aqui ela puxa até quatro canais eu posso ter água metanol acetonitrila e o outro solvente aqui um tampão aqui se eu quiser ela vai puxar os quatro vai misturar aqui e vai jogar pro meu sistema e empurrar isso contra a minha coluna Ok normalmente a no nos métodos eu uso um sistema que eu chamo de isocrático ou Gradiente o que que é um sistema isocrático quando a composição da fase móvel ela é fixa em toda

a corrida ou seja eu pego aqui eu digo assim olha eu vou misturar 50% de água 50% de metanol e ela vai correr na minha corrida no tempo essa proporção a corrida inteira isso é isocrático eu também posso misturar o metanol com a água coloc colocar aqui no canal e dizer olha injeta e ele vai também fazer isso tá aqui como é separado a gente normalmente não faz a mistura a gente faz a mistura dentro do da bomba o sistema Gradiente é o é quando eu altero a composição da fase móvel no decorrer da corrida

então eu começo por exemplo com 5% de água e eu vou até 80% de água na corrida ou normalmente faz o contrário né a gente começa com 5% de metanol e vai até 60 70% de metanol durante a corrida para que isso lembra que eu falei quanto mais parecido é a tua a tua molécula com a a fase móvel né mais ela vai migrar então normalmente normalmente as substâncias que eu analiso aqui elas são elas são mais apolares quando eu comparo com a água claro né Elas são mais apolares do que a água então quando

eu aum diminuo essa polaridade da fase móvel eu tô empurrando a molécula mais rápido para ela sair isso às vezes é bom porque eu fazer uma corrida aqui de 50 60 minutos não é legal né não é eficiente eu vou gastar muito solvente então eu às vezes eu tendo a ter fazer com que essa essa molécula saia mais rápido e aí eu tenho que aumentar a vantagem do Gradiente também ela que favorece essa Separação das moléculas se eu trabalhar num única numa única e composição da fase móvel e a tendência que eu consiga separar menos

eu tenho uma eficiência menor do meu sistema enquanto que se eu trabalhar em Gradiente eu posso ter uma eficiência maior isso tudo era para falar as partes do equipamento né Mas vamos lá nós estamos aqui na parte da a bomba né que ela tem essa função de bombear segundo módulo é o a CBM a CBM o que que ela faz ela faz a ligação ela faz a conexão do meus módulos entre si e do e dos módulos com o meu sistema computacional com meu software tá então é esse carinha aqui a CBM então bomba CBM

E aí eu venho para um terceiro módulo aqui que é o desgaseificador o que que esse cara faz ele retira qualquer bolha de ar que tenha dentro dos solventes então Lembrando que aqui no no sistema de hpdc o líquido trabalha sobre alta pressão então ele não pode ter gás dissolvido porque ele vai influenciar nessa não vai ganhar essa pressão que eu preciso então ele precisa retirar todo esse esse gás e quem faz esse carinha chamado desgaseificador então bomba CBM desgaseificador e eu venho aqui pro meu injetor que aqui nesse caso eu tenho um injetor automático

esse injetor automático ele faz o qu as amostras elas ficam nesses vaios né eu coloco aqui ele tem uma bandeja com acho que pega aqui 100 amostras 105 amostras e eu vou colocar num determinada posição ela numerada então posição 1 2 3 4 5 6 7 e na hora de injetar eu vou dizer para ele Ó injeta a amostra da posição número um ele vai lá injeta aspira o líquido e joga no sistema então basicamente faz isso eu vou dizer quantos microlitros eu quero que ele puxe ele vai 2 microlit 5 micol 10 micol 20

micol quem vai me dizer quantos microl eu vou injetar sim eu tenho uma um limite aqui tá acho que o meu loop máximo aqui é 50 micol Então nesse equipamento eu não consigo injetar mais do que 50 micl mas os volumes normalmente em torno de 10 de 5 a 20 micol tá isso vai depender também da concentração do do meu analito na mostra se ela for uma concentração muito alta eu posso injetar menos se ela for uma concentração mais baixa eu tenho que injetar um volume maior pro conseguir detectar Eu também não posso injetar uma

quantidade muito grande porque eu saturo a minha coluna e isso diminui eficiência do sistema e tal tá vamos falando aqui das partes bomba CBM desgaseificador injetor automático aqui eu tenho do injetor ele sai pra coluna A minha coluna cromatográfica fica aqui dentro ó e aqui ela fica dentro de um forno aqui é um chama forno de coluna Qual é a qual é a a a o objetivo de ter um forno de coluna é para a coluna estar dentro de uma temperatura controlada por quê a eficiência da coluna ou seja a capacidade da coluna de separar

depende da temperatura que ela está por exemplo se eu trabalho numa na coluna hoje a 20° e amanhã eu vou para 30 ela pode dar diferença na eficiência e no tempo de separação e o hpmc a gente trabalha com tempo de separação o tempo de retenção que eu chamo é o que vai me dizer que a substância é a mesma então se hoje ela migrou em 20.6 e amanhã ela migra em 20.7 aí eu já fico em dúvida é a mesma substância eu já não vou dizer que a mesma substância tem essa diferença então isso

a e outra essa temperatura mais alta Uma temperatura de 40 G que normalmente a gente trabalha ela melhor a eficiência da coluna tá então por isso que o forno de coluna é importante dá para trabalhar sem o forno dá dá também Mas fica deficiente nesse sentido vamos de novo bomba que que é isso aqui CBM que é ess desgaseificador injetor automático forno de coluna e sai aqui do forninho ele vem pros meus detectores neste caso Eu tenho dois detectores Eu tenho um detector de uv que esse equipamento é um detector que ele é chamado de

arranjo de diodos ou Dad né que a gente chama mais é um detector Dad o que que é esse cara ele consegue detectarem todas as regiões ali do espectro entre o v e o visível entre sei lá de 200 a 800 nôm esse cara ele consegue monitorar a minha mosta então eu consigo fazer um espectro de absorbância da do Pico eu consigo por exemplo monitorar aqui em 4 5 6 7 8 9 10 comprimentos de onda ao mesmo tempo a corrida usando esse detector então ele é muito bom por exemplo para quem tá explorando que

substância é quando eu não sei que substância é eu quero tirar um espectro de absorbância daquela substância esse tipo de detector é super importante existe detector de uv que ele só lê em Pontos fixos Eu leio escolho um copio de onda e eu tenho que monitorar naquele esse não eu até monitoro em um mas se eu quiser ver os outros eu depois consigo ver tá é um detector assim é o nosso detector Coringa do hplc é o Dad serve para quase tudo né eu falei aqui que os açúcares Não não são mas é uma exceção

o resto eu consigo fazer e o outro detector também que é bem muito comum em HPC é o detector de fluorescência aqui para eu detectar nem nesse detector a substância tem que ser fluorescente ou responder ao estímulo fluorescente né então como ligar o equipamento então eu chego de manhã a primeira coisa que eu tenho que saber é preparar minha fase móvel no caso uma coisa importante tá as fases móveis para serem colocadas aqui elas precisam estar filtradas eu preciso ter certeza que aqui não tem nenhum resíduo que não tem nenhuma coisa que possa entupir o

meu sistema então normalmente a a parte a gente tem um filtro a filtro de 02 micras e eu passo toda essa fase móvel pelo sistema de filtração a própria água tem que passar e o solvente também principalmente se eu fizer uma mistura quando eu não faço mistura por exemplo tô tirando do frasco e direto para cá eu posso até não filtrar tire direto do idealizador que já passa lá na filtração Ok mas se eu fizer qualquer mistura nessa água eu teria que filtrá-la antes de colocar aqui outra a água que eu vou usar aqui preferencialmente

água do dia tá nós temos aqui uma um equipamento de zador então ah A água tá aqui não tira que tá aqui pega do deniz ador e traz ela tem que ser do mesmo dia porque a água sabe ela Funga ela né não é ela é perecível então normalmente como eu falei a gente usa aqui ess não é obrigatório Mas a nossa rotina aqui a gente usa no canal a pra água e o canal B pro solvente orgânico seja aqui metanol ou acetonitrila tá bom tenho certeza que tá com a fase móvel eu vou ligar

o meu sistema tem uma sequência correta de ligar isso aqui tá bom a última coisa que eu ligo é a minha CBM por qu porque ela vai fazer a conexão entre os módulos então eu vou começar ligando a minha bomba tá com probleminha aqui então vou começar ligando a minha bomba depois eu posso ligar o meu injetor meu forno de coluna e os meus detectores detector V fluorescência no caso se eu não for usar o fluorescência não preciso ligar tá bom lá no meu método eu vou conseguir e destacar ISO depois que eu ten ligado

os módulos eu venho e ligo a CBM tá E aí eu venho para iniciar o meu computador vou ligar o meu computador e ele vai fazer a inicialização do sistema como que a gente faz então para começar o uso uma vez que eu liguei o equipamento táo verdinho euen iniciar o programa então eu vou abrir aqui ó esse programa aqui ó LC Solution clico nele e aí eu venho aqui ó no equipamento número um aqui ó no equipamento número um e abro então o software ele vai fazer dois cliques ouviram esses dois cliques significa que

o sistema está conectado a primeira conexão da CBM com os módulos e a segunda conexão com o computador aqui o que ele tá me dizendo Ele tá dizendo que e a configuração do sistema tá diferente da configuração de hardware o que que foi isso Eu liguei mais módulos do que tá no método que está aqui porque ele sempre abe no último método que eu usei então por exemplo se eu tava usando o método que só tinha o detector de uv ou de uv e o detector fluorescência não tava ele vai dar esse erro mas aí

eu venho aqui ó e vejo Ah eu vejo Quais são os sistemas que estão aqui Exatamente isso ó ele tem a o controlador a bomba o aut s pelo forno de coluna o detector PDA e a coluna tá faltando alguma coisa aqui o que que será aparentemente não tá faltando nada tá tudo aqui controlador a bomba o autoa o forno detector a O PDA ok tá ele abriu o último método aqui ó que foi o método afl toxina aí eu tenho que para eu poder utilizar o computador aqui eu já tenho que ter um método

previamente salvo tá o meu método que aí para cada análise é um método específico então eu vou abrir o método que eu já vou utilizar ou vou criar um novo método eu tenho que configurar parâmetros para o método Digamos que eu vou utilizar um método já que está aqui Open metodo file tá vou abrir aqui o método que eu sei que já existe aqui vou procurar aqui um método ó vou pegar aqui o método cafeína Emerson tá que é um método que já existe aqui ele já vai abrir e naquelas naqueles parâmetros daquele método aí

para eu começar a usar o equipamento o que que eu preciso eu preciso de fluxo no sistema tá preciso de fluxo Ou seja eu preciso puxar minha fase móvel e fazer essa fase móvel correr pelo meu sistema o sistema lá tá parado ainda certo eu preciso fazer isso então Antes de eu começar esse fluxo eu não posso chegar aqui e já colocar o fluxo direto provavelmente isso não vai gerar fluxo eu tenho que fazer o que eu chamo de Purga o que que é essa Purga eu vou retirar puxar solvente passar esse solvente primeiro pela

bomba para que a bomba então consiga ter bombear pro resto do sistema tá então isso eu posso fazer de uma forma automática a única coisa que eu preciso fazer antes é abrir a válvula aqui ó da bomba tá então eu abro essa válvula 45º 45 aqui ó e deixa essa válvula aberta tá bom aí eu venho aqui no meu método eu vou clicar aqui nesse ícone Advanced aqui ó vem aqui eu vou lá no a purg para eu ver quais são os parâmetros que estão condicionados aqui para ele o que que ele tá me falando

ó eu vou pegar a fase móvel a e purgar por 3 minutos e a fase móvel B por G por 3 minutos A A C E A D não vou e o meu Auto Samper que é o autoinjetor também por 3 minutos ou seja ele vai fazer 9 minutos de Purga tá esse esses parâmetros eu estou primeiro checando se é isso mesmo porque vi que tava na fase D quando eu liguei ele não tava fazendo na fase a ele tava Alguém chegou aqui mudou se então o que eu quero é porg 3 minutos a fase

a 3 minutos a fase b e pgar o ajor 3 minutos isso é suficiente Normalmente sim se eu quiser deixar 5 10 15 posso deixar só que é tempo demais para eu seria o mínimo mínimo mínimo é 3 minutos para eu poder salvar o que eu fiz eu venho aqui download ó clico em download ok ele salva a informação que eu vi uma vez que eu fiz esse eu fiz a configuração do aut Samper eu vou iniciar a Purga aí eu venho aqui ó no terceiro Icone Zinho aqui ó depois do embaixo do file no

terceiro Icone Zinho A purg tá bom e clico nele a purg e dou ok ele vai começar o processo de Purga Agora eu preciso checar se realmente ele tá fazendo a purga como é que eu faço isso eu venho aqui agora vou mexer aqui ó eu venho aqui lá na minha bomba Pego aqui o o caninho da da da da purga e eu ele tem que tá saindo líquido aqui ó Nessa pontinha aqui eu tenho que olhar aqui na bomba se ele tá pur Line ó como tá ali e eu tenho que aguardar começar a

sair líquido aqui a a Purga só começa a acontecer quando ele começa a sair líquido e ele sai bastante fluxo Tá bom vamos aguardar um pouquinho pra gente ver se ele vai realmente começar a fazer a Purga ó começou tá vendo mas ele vai bem mais rápido do que isso às vezes quando o equipamento ele fica bastante tempo parado ele demora a começar essa purga tudo bem Ó pronto começou tá vendo é esse mais ou menos esse fluxo aqui que eu preciso para eu ter certeza que a Purga tá acontecendo mas tem que tá de

forma contínua tá ele não tá de forma contínua ainda significa que tinha muita bolha de ar dentro do sistema e ele não tava conseguindo fazer ó se eu não tivesse feito isso ele não vai conseguir gerar o fluxo que eu preciso então gente terminou a curga certo certo terminou a Purga O que que a gente vai fazer agora a gente precisa iniciar o fluxo do equipamento primeiro no meu método eu preciso saber qual é o fluxo final que eu vou trabalhar eu posso trabalhar por exemplo 05 06 07 08 09 1 até 1,5 ml por

minuto isso eu que determino eu que que ten que saber por exemplo se o meu método já tá determinado provavelmente esse fluxo já tá estabelecido se eu tô desenvolvendo eu vou tentar estabelecer esse fluxo mas eu tenho que saber o fluxo máximo aqui que eu vou trabalhar normalmente o fluxo padrão é 1 ml por minuto beleza eu começo aqui com 1 ml por minuto não eu começo com fluxo menor para eu ir aumentando e vendo até a questão da pressão exercida por esse fluxo no meu sistema mas a primeira coisa que eu faço Antes de

eu começar o fluxo é vir aqui na bomba ó eu venho aqui na bomba e eu fecho a válvula tá Dá um apertinho bem bacana não deixe muito folgado não fecho a válvula e aí eu venho aqui pro meu sistema Agora eu vou começar o meu fluxo Onde tá o meu fluxo bem aqui ó no Pump Cadê o meu Pump aqui ó Pump certo clico no Pump aqui ele tá low press gradient ou is isocratic Flow eu posso no isocrático aquela situação que eu vou trabalhar com uma única canal o canal a o b o

c ou D no isocrático no no low press Gradiente eu posso trabalhar de um até quatro canais tá aí a minha opção quando eu deixo no no no no Gradiente ele me dá a opção de eu trabalhar com o solvente B C e D vocês estão vendo aqui ó B C e D por quê Porque se eu posso colocar 30 de B 30 de C 30 de D e ele vai fazer essa diferença no a Ok se eu colocar 30 30 30 ele vai tirar 10% do a e 90 desses três se eu tiver trabalhando

com os dois ali que eu que eu fiz ali eu coloquei a e b se eu deixar aqui 30% de b ó se eu deixar 100% de B ele não vai tirar nada do a mas Digamos que eu vou colocar aqui ó e 30% de B quem é o b é o meu metanol né se eu deixar 30% de B ele vai tirar 70% do a 70% do a e 30% do B isso em toda a corrida porque eu ainda não organizei o meu Gradiente tá Não padronizei o meu Gradiente mas aqui é para iniciar

a minha corrida aí o que eu tenho que saber no meu método eu começo com essa proporção 30 70 100 0 10 90 eu ten que saber isso porque eu vou colocar essa proporção para ele iniciar o fluxo nessa proporção aí eu tenho que olhar lá no meu aqui ó LC time program e eu vejo no meu método qual essa proporção aqui tá vendo que é 50 5050 50 50 o meu LC time tá programado aqui ele vai usar 50 de a e 50 de b então eu volto lá na minha bomba no Pump e

eu coloco aqui 50 para ele poder salvar eu venho aqui em download ó clico em download salvar ele ainda não começou o fluxo tá eu só tô ajustando Qual é o parâmetro Inicial beleza para eu começar o fluxo é bem aqui ó Total Pump a Flow tá vendo que tá zero tá zero aí aqui que eu que eu tenho que saber qual é o fluxo que eu vou trabalhar é com 05 é com 07 075 08 1 eu tenho que saber qual é o meu máximo no caso o sistema aqui ele até guarda mas aqui

não tem essa informação eu tenho que saber na minha cabeça eu tenho que ter uma anotação extra para saber qual é o fluxo que vou trabalhar Acho que nesse método a gente trabalh com 0,85 se eu não tô enganado mas beleza aí eu vou começar o que a gente recomenda é que você para você não dar um grande solavanco na bomba você começar de forma mais paulatina você coloca por exemplo 0.2 e dar download na hora que eu der aqui ele vai começar a ah ele tá pedindo para digitar o número porque não pode ser

zero mas eu digitei o número 0.2 dá download agora ele vai começar a mandar informação do que eu pedi de fluxo para ele pra bomba aí o que eu tenho que olhar ó eu tenho que vir aqui na bomba aqui também mostra aqui ó bem aqui ó tá mostrando a pressão tá vendo ó 20 né que aqui tá uma unidade diferente mas o mais seguro mesmo é eu olhar lá na minha bomba aqui ó venho lá na bomba e olho aqui a pressão tá vendo ó e aí eu tenho que olhar outra coisa se tá

tendo o fluxo que eu coloquei quanto que eu coloquei lá 0 02 bora ver começou a ter fluxo aqui tá vendo ó tem um fluxo Zinho será que esse fluxo é 02 Por Minuto Talvez né talvez Beleza então isso significa que o meu sistema tá tá funcionando tá bom beleza significa que o meu sistema tá funcionando de novo vou repetir coloquei o fluxo esse ainda não é o meu fluxo final é só para eu chegar lá tá olhei a pressão tinha pressão e fui olhar o meu fluxo Real lá Vi que tem fluxo então sistema

tá ok porque o que que muita gente quando tá começando erra põe o fluxo aqui não presta atenção na pressão chega lá no 1 ml por minuto e depois professor eu injetei não aconteceu nada mas tu viu se tinha fluxo se tava funcionando porque o sistema ele não vai te avisar que não tem fluxo tá ele não vai te avisar isso el você vai até ver aqui que não tem pressão mas ele não avisa para você que não tem fluxo beleza feito isso eu vou subindo o meu fluxo aqui ó eu vou apagar vou colocar

04 vou dar download já L tá já tá 0400 Ah aqui vou colocar 06 aí eu posso fazer mais rápido tá bom eu posso fazer mais rápido e vou vendo que essa pressão ela vai subindo aí Tá ele vai mudando o fluxo lá e vai aumentando a pressão até eu chegar no meu 08 uma coisa que eu tenho que prestar atenção é o seguinte qual é a pressão que tá sendo exercida quando eu coloco esse fluxo tá a pressão ótima para eu trabalhar aqui na na faixa de 100 kg força por cm quadrado então quando

eu chego nessa pressão normalmente Eu já eu já paro meu fluxo 111 111 né 11 C isso ela vai demorar um pouco para estabilizar tá por isso que a gente trabalha aqui normalmente nesse fluxo de 08 até 1 075 por causa da pressão Porque quanto maior essa pressão diminui a eficiência de separação e eu também estrago a minha coluna que a minha coluna ela tem um limite ali de de pressão que ela suporta entendeu Aí vou deixar um aqui vou chegar em um para ver como é que fica lá chegar no fluxo de 1 ml

por minuto até 150 nessa coluna dá para você trabalhar é uma pressão alta é uma pressão alta mas não é algo que vai estragar o teu equipamento entendeu se você trabalhar com também diminuir a meia da coluna sim com certeza diminuir a meia vida da coluna aí beleza ó cheguei no fluxo de 1 ml por minuto o ideal é que eu venha aqui lá no meu no meu fluxo aqui ó e veja se como é que tá esse fluxo aqui ó tá vendo ele tá um fluxo aparentemente compatível tá se eu quiser ter certeza se

ele tá respondendo eu venho aqui com um endorf Zinho ponho aqui e meço um minuto e meço o volume Beleza agora qual é o o meu próximo passo então o que que fazemos agora uma vez que a gente já viu que tem fluxo né que o fluxo tá lá o fluxo que a gente colocou tem pressão no sistema eh eu vou posso poderia Teoricamente injetar a minha amostra mas antes de injetar a amostra a gente precisa saber se o sistema está estabilizado então normalmente eu vou colocar aqui o o comprimento de onda que que eu

vou trabalhar primeiro eu vou desabilitar aqui o o LC eu vou eh colocar o comprimento de on que eu vou que eu vou trabalhar por exemplo Digamos que e eu vou monitorar 280 nôm Tá eu vou clicar do lado direito do mouse eu vou vir aqui ó display settings e eu vou selecionar o comprimento de onda que eu quero monitorar se eu quiser monitorar 1 2 3 4 de onda eu posso adicionar então aqui 280 é o comprimento de onda que eu quero monitorar vou clicar em aplicar então aqui ó ele já tá monitorando aqui

o comprimento de onda só que ele não tá plotando aí eu venho aqui ó no cantinho direito plot e aperto aqui para ele plotar a linha de base que ele vai monitorar a linha de base do do meu do meu sistema se eu quiser ampliar aqui ó a escala eu venho aqui nesse maizinho ó e amplio ó Você tá vendo que o sistema ele tá bem instável tá vendo ó ele tá subindo aqui significa que ele não tá ainda numa situação basal de uso para eu usar o equipamento ele precisa est numa linha num ele

tá ele precisa estar estabilizado tá isso porque eu acabei de ligar e acabei de começar o fluxo entendeu Então ele leva aí de 30 às vezes 15 a 30 minutos para estabilizar aí só aí eu posso injetar de m com segurança né com segurança de que vai se eu quiser dar um alto zero ó eu venho bem aqui ó é aqui não tem um local aqui que eu dou alto zero aqui ó ao zero PDA na hora que eu clicar aqui ele vai levar pro zero ó aí eu espero para ver se ele vai estabilizar

ou se ele vai continuar oscilando tá Teoricamente para eu ter uma segurança de que o meu sistema tá ok ele só Pode injetar na hora que ele tiver uma linha de base bem estável ou seja não tá tendo essa nunca vai ser 100% estável mas ele não pode ter essa variação que tá tendo aqui ó ó tá vendo que ele tá subindo ali ainda então ele não se eu injetar qualquer coisa aí eu não vou ter segurança de que vai sair sair um pico confiável né É aí essa que é a questão da paciência e

do tempo de usoi eu cheguei entre eu chegar ligar e injetar minha amostra é pelo menos uma hora pelo menos uma hora é tudo certinho né como é que é o processo de injeção de uma Ostra primeiro para eu poder injetar a amostra e o equipamento precisa estar com as duas duas dois verdinhos aqui tá o LC R O PDA R eu tenho duas maneiras de injetar a amostra uma é fazer um Bet process que é um sistema onde eu cadastro as amostras antes e o sistema faz automaticamente essa injeção mas aí eu eu explico

para vocês num outro momento esse Bet e o outro é eu fazer através de uma uma injeção single start aqui ó single Start eu venho aqui clico no single start ele vai me pedir o nome da amostra eu vou colocar aqui por exemplo teste 01 eu o sample ID que também é o mesmo eu posso colocar a mesma coisa e eu tenho que colocar [Música] aqui no data file o mesmo nome tá lembrando que no data file Eu não eu tenho que deixar essa extensão aqui ó LCD então eu vou colocar o mesmo nome aqui

teste 01 ponto LCD tá então eu vou medir nesses três lugares aqui se eu quiser descrever o que que é essa amostra eu posso fazer descrever isso fica gravado aqui eu tenho que colocar o while que tá aí eu venho aqui na minha haack de amostra e tem uma numeração aqui que vai de 1 até 105 Tá eu vou dizer em qual Vaio tá aquela amostra que eu tô injetando por exemplo Digamos que eu vou colocar que tá no Vaio número um essa posição um aqui ó Beleza tem que saber disso coloco aqui o Vaio

um o volume injetado aquilo que eu tava falando para vocês eu tenho que saber no meu método Qual é o volume de injeção às vezes é 5 10 15 20 30 microl a depender do Meu método Digamos que seja 10 10 microlit o try é a hack aqui só tem uma Então ela sempre vai ser o número um tá bom feito isso eu vou colocar a minha amostra na posição que eu coloquei lá e vou colocar a hack no no equipamento Tem um detalhezinho aqui ó que parece ser bobo mas se eu não empurrar ela

fizer um cliquez inho ela não vai injetar eu tenho que apertar e fazer um clique Zinho ó certo fechei aqui ele até a ponta lá que tava o tava aberto e eu venho aqui e dou um ok o equipamento vai fazer esse barulhinho ó que é o da do injetor se ele não fizer isso ele não tá injetando A amra tá bom ele vai informando para você o que ele tá fazendo e agora ele vai ficar azul falando mostrando que já está na corrida tá tá correndo e ele começa o processo de monitoramento da minha

quando eu ponho o padrão eu escrevo né padrão é eu vou eu vou isso vou nomear a minha amostra se eu tiver fazendo essa injeção em single start vou nomear uma a uma eu também tenho aquela opção de fazer no Bet onde eu tiver 10 amostras eu já escrevo todas elas e ele faz as 10 amostras ele vai salvando nome do agora eu vou acompanhar aqui ó eu vou acompanhar aqui o o andamento da minha da minha corrida aqui ele tá monitorando o comprimento de onda que eu quero Digamos que eu quero eu queira monitorar

um outro comprimento de onda Ah é 280 e eu quero monitorar sei lá 254 eu venho clico do lado direito do mouse venho aqui em display settings seleciono o comprimento de onda e coloca aqui o comprento de on desejado 254 aplicar agora ele tá monitorando dois comprimentos de onda 280 e 254 tá a aqui embaixo ele tá monitorando é todos os comprimentos de onda entre 200 e 600 nôm por que isso porque aqui ó no no detector do detector PDA eu selecionei para ele Qual é a faixa que eu quero que ele monitore ele tá

inabilitado aqui porque ele tá em corrida né mas tá escrito aqui ó de 190 A 600 eu posso mudar isso aqui também mas fora da corrida tá uma outra coisa que eu posso mexer aqui também é nessa proporção aqui ó das Telas se eu quiser mexer aqui na proporção aqui colocar mais desse do que desse eu venho aqui em settings aqui ó aqui ó eu venho aqui e mexo e ele altera aqui a proporção entre as janelas tá vendo ó Eu quero ver mais do espectro mais do cromatograma aqui ele tá vendo menos do espectro

tá vendo ó aí menos do espectro e mais do cromatograma Então são são questões aqui que eu posso ir mexendo com o tempo provavelmente Ah tá aqui deixa eu alterar aqui só para ficar melhor pra gente ver Aqui começou a sair alguma coisa né então provavelmente aqui é uma substância que tá saindo né nesse tempo ó uma substância que tá saindo nesse tempo no caso aqui ela tá absorvendo tanto em 280 quanto em 254 né o pico aí tá muito muito legal né um pico bem Estreito simétrico né tá saindo num tempo bom 3 minutos

não sei que substância essa que eu não sabia que a amra tava aí mas assim deu certo tá funcionando como é que funciona o sistema de hplc por exemplo eu quero identificar ácido gálico na minha moto eu vou pegar um padrão de ácido gálico vou injetar ele vai sair aqui num tempo 2.89 minutos vou pegar minha m que vou injetar sair um tempo um pico em 2.89 minutos no mesmo método provavelmente é aado Então pessoal eu gostaria de mostrar para vocês eh Quais são os parâmetros que eu consigo alterar quando eu estou padronizando o meu

método analítico né eu Digamos que eu tô querendo desenvolver o método onde que eu vou lá no equipamento para mexer isso de uma forma bem simples então aqui quando eu abro o equipamento ele vai aparecer essa essa base aqui ó normal e Advanced eu vou clicar aqui no Advanced Tá bom então ele vai abrir para mim vários parâmetros Ok onde que eu vou mexer o primeiro é data aquisition né esse data aquisition Eu normalmente eu não mexo nele tá ele vai ficar exatamente como ele tá eu não preciso mexer o segundo é o LC time

program aqui eu posso mexer ou não a depender da minha corrida por exemplo se a o sistema for isocrático você vê que aqui ó eu tenho uma corrida de 10 minutos certo ele tá com 50% de B até 10 minutos 50% de b e em 10.01 controlador ele vai encerrar a corrida seria uma corrida isocrática ou seja ela vai manter a composição da fase móvel igual em toda a corrida Digamos que eu queira alterar isso como é que eu faço então Digamos que eu queira começar com 5% de B que é o solvente orgânico isso

vai até 30% de B em 5 minutos depois ele vai chegar a 60% de B em 10 minutos e ele vai terminar eh em 5% de B que é para começar uma nova corrida onde que eu mexo eu faço o seguinte eu sempre vou começar com 0 v0.01 Pump B concentration aí aqui eu coloco a percentagem de B Ok então comecei com 5% eu falei que eu queria que em 5 minutos ele fosse para 30% de B né então eu vou colocar aqui aqui o tempo ó 5 minutos B concentração de B 30% OK 30%

aí eu vou aumentar esse tempo Digamos que eu quero Eu queiro aqui em 10 minutos de novo a bomba chegue a concentração de b a 60% Ok 60% beleza e agora eu quero que em 12 minutos essa ess essa bomba B concentração volte para os meus 5% iniciais é importante que eu tenha um tempo de estabilização do método para comear uma nova corrida então eu vou colocar aqui 3 minutos em 15 minutos essa bomba B concentração vai permanecer em 5% e em 15 p01 ponto não vírgula tem que ser ponto senão ele não lê tá

5.01 aí aqui eu já vou colocar o controlador que vai parar a corrida Stop Ok então vamos ver lá como é que ficou eu venho aqui ó em draw Curve ele vai desenhar a minha curva então ele vai começar com 5% de B até 10 minutos chegando a 30 a 30% de b a 60% de B né em 10 minutos olha aí ó depois ele vai cair pros meus 5% em 12 minutos e vai permanecer Ok então aqui aí já faria uma nova injeção Então dessa forma eu consigo fazer o meu e LC time program

né A minha programação de alteração se eu quiser voltar para aquela condição Inicial Eu só faço excluir essas essas linhas aqui e volto pra minha condição Gradiente que eu estava fazendo aqui no momento que eu dou download ele vai salvar essa alteração que eu fiz no método Tá bom então aqui é o LC time program em detector a eu não mexo se eu não tiver usando fluorescência no PDA eu posso me se eu quiser Mas normalmente não é algo que eu preciso alterar aqui ó é é onde eu altero a minha temperatura da célula de

de fluxo né a célula de a temperatura da célula de fluxo do detector aqui ele tá 40º essa temperatura tem que ser a mesma Teoricamente do meu forno de coluna tá o forno tá bem aqui que a gente vai já ver então se eu tô usando o forno de coluna 40º é ideal que essa da célula seja 40º aqui eu informo para ele qual é o a faixa de onda que eu posso usar eu posso por exemplo monitorar de 200 a 800 ó de 200 a 800 nôm se eu quiser monitorar uma uma banda mais

estreita ou mais larga eu também posso modificar aqui esse d2w aqui é se eu estando os dois detectores as dois lâmpadas né a lâmpada de mercúrio e a a lâmpada de deutério no caso aqui ele tá trabalhando com os dois as duas lâmpadas do detector no forno de coluna A mesma coisa né aqui eu vou Abir posso habilitar ou não o forno e colocar a temperatura que eu desejo no caso aqui ele tá desabilitado o forno ele não tá a esquentando tá aí fica meu critério dependendo do Meu método a coluna aqui o controlador Tá

ligado não mexo o aut Samper aqui eu posso e ajustar alguns parâmetros de lavagem a altura que a agulha vai e descer no no vio né para poder pegar mais ou menos amostra aqui o volume mínimo ó aqu Ele tá é o volume de 200 microl é o mínimo que eu consigo colocar nesse tipo de Vaio para ele puxar e e aqui a altura da agulha então normalmente eu não mexo nisso A não ser que eu queira fazer algum ajuste bem fino nesse processo e o aut purg é eu já falei antes para vocês quando

eu ligo o equipamento que eu vou fazer a Purga eu ajusto aqui os tempos né posso deixar isso aqui 5 minutos ou 3 minutos né Por exemplo se eu quiser uma Purga de 5 minutos eu venho aqui no canal a no canal b e no meu autoinjetor né 5 minutos e do download para que ele faça aqui só tô ajustando os parâmetros tá a parte mais importante Aqui é do LC time program que eu vou dizer para ele se eu vou trabalhar no sistema de Gradiente ou se eu vou trabalhar no sistema de isocrático tá

então é aqui que eu faço a a o ajuste dos parâmetros para que eu possa eh desenvolver o meu método analítico Tá bom então gente eh fiz a minha corrida né terminei todo o meu o meu processo aqui no hplc e eu preciso desligar o hplc né O que que eu tenho que fazer eh então eu venho aqui ó em Advanced seleciono pup e aqui eu vejo que o meu fluxo tá 1 ml por minuto que era o meu fluxo final certo então o ideal eu isso não é obrigatório mas é algo que aqui no

laboratório a gente tem essa prática eu colocar o me solvente B 100% não desliga o equipamento e somente com água né então eu vou jogar para 100% do B que é o meu solvente orgânico no caso aqui o metanol então ponho 100% de b e clico em download Ok e agora eu vou diminuir o meu fluxo até chegar no meu fluxo zero que é para eu poder desligar o equipamento tá então aqui tá em um né eu posso poss colocar em 0,8 dou download 0,8 download Ok então ele vai diminuir a minha bomba e o

meu fluxo vai ficar 08 é lógico o ideal é que eu deixe esse 100% de antes de eu fazer essa diminuição de fluxo eu deixo correr aí pelo menos uns 5 a 10 minutos nesse fluxo de 100% de de solvente B para que a todo o sistema fique preenchido com um solvente orgânico Inclusive a minha coluna Tá bom depois desse tempinho aí pelo menos 5 minutos eu posso fazer isso aqui que eu tô mostrando para vocês vem o 08 depois eu venho para 06 download OK aí aguardo aí uns 30 segundos mais ou menos venho

para 04 Ok a pressão começa a cair ó vocês vejam que a pressão Aqui começa a cair bastante aí quando a pressão estabiliza um pouquinho aí eu já posso vir para 02 dou ok espero a pressão aqui baixar ó baixou tá vendo 4 36 33 32 pressão estabilizou aqui eu já posso vir para o zero aí chegou no zero download Ok e a minha pressão aqui também vai zerar pressão Zerou eu já posso então fechar o meu programa e desligar o equipamento OK depois que Zerou a pressão eu posso fechar o meu programa e desligar

o equipamento i