Introdução à citometria de fluxo

em rede nacional de especialistas em terapias avançadas um projeto da Agência Nacional de Vigilância Sanitária em cooperação técnica com programa das Nações Unidas para o desenvolvimento e executado pela Universidade Federal do Rio de Janeiro introdução a citometria de fluxo é e nesta apresentação abordaremos As definições Quando utilizar a citometria de fluxo o sistema de funcionamento as aplicações no contexto de produtos de terapia avançada e o seu só fim a citometria de fluxo é uma técnica que nos permite avaliar qualitativamente e quantitativamente propriedades físicas e biológicas de células ou partículas em suspensão que são conduzidos em

alta velocidade por um sistema de fluidos e interceptados uma uma por um ou mais laser dessa forma essa técnica permite avaliar rapidamente múltiplas características individuais e populações celulares heterogêneas de um grande número de células ou partículas com altíssima sensibilidade especificidade reprodutibilidade estatística podem ser analisados por citometria de fluxo partículas que sejam colocadas em suspensão dentro de uma determinada faixa de diâmetro que irá variar de equipamento para equipamento para grande parte dos equipamentos ficam entre 0. 2 e 50 micrômetros dessa forma tipo os celulares dos mais diversos podem ser analisados por essa técnica e sejam eles

civis e fixados provenientes de isolamento a fresco ou culturas in vitro aderentes desde que previamente desagregados ou em suspensão tecidos desde que submetidos a procedimentos de desagregação enzimática ou mecânica também podem ser analisados assim como partículas menores que zero ponto dois micrômetros como citocinas presentes no soro fatores de crescimento ou vesículas extracelulares por exemplo desde que protocolo os adequados sejam Escolhidos e assim tanto características intrínsecas quando características extrínsecas das células como tamanho granulosidade pigmentação alto fluorescência viabilidade conteúdo de DNA estrutura de membrana celular e citoesqueleto receptores internos e externos podem ser analisadas por esta técnica

a citometria de fluxo permite também a avaliação de processos tais como a atividade enzimática metabolização de fármacos ou compostos ativação celular apoptose 5 no celular e eficiência de transfecção ou transmissão a estas análises podem ser ainda crescidas avaliação de respostas de forma curso temporal eu desligo essa ver se eu te ligar de entender sobre o funcionamento Geral do equipamento nos auxilia a compreender e analisar criticamente os dados gerados dividiremos seu funcionamento didaticamente em três sistemas sendo eles o sistema de fluidos o sistema ótico e o sistema eletrônico o sistema de fluidos conduz As populações heterogêneas

de células ou partículas em suspensão até a câmara de fluxo na câmara de fluxo o espaço que comporta a solução contendo as células o partículas vai sendo gradativamente acumulado até que estas sejam alinhadas em fila indiana chamada o foco hidrodinâmico permitindo que as células ou partículas sejam interceptados um apelo laser no local chamado de ponto de interrogação e o sistema óptico do setor metro de fluxo é composto por fontes de emissão usilaser espelhos e prismas que os conduziram ao ponto de interrogação e o conjunto de filtros lentes e espelhos que compõem o sistema de captura

cada laser possui um único comprimento de onda que pode variar do ultravioleta até o infravermelho quando a célula atingir o ponto de interrogação ela é interceptado por um ou mais laser essa incidência causar ao espalhamento da luz que será captada por detectores posicionados frontalmente em ângulo de 2 a 20 graus em relação à fonte de emissão e detectores posicionados a 90° dessa fonte caso as células ou partículas estejam marcadas com fluoróforos ou Expressa em moléculas fluorescentes estas serão as citadas pelo laser EA fluorescência emitida também será captada a intensidade do espalhamento da luz é proporcionada

por características morfológicas da Serra o sendo detectada pelos parâmetros full load scatter fsc e sai descarta ssc Este espalhamento é dependente da combinação de alguns fatores como comprimento da onda da fonte de iluminação do ângulo de interceptação do laser e do índice de refração da partícula assim como o do meio onde a partícula está em nessa o fsc pode fornecer uma estimativa do tamanho ou volume das partículas e o ssc de sua complexidade que são determinadas por sua grandiosidade e estruturas internas mas relembramos que sua definição é bem mais Ampla assim partículas menores tendem a

causar um espalhamento menor da luz que partículas maiores por exemplo células pequenas e com citoplasma pouco complexo com os linfócitos serão representados com menores valores de f s c e s s c quando comparados a neutrófilos e além de características morfológicas o especialista pode identificar antígenos de interesse por sua marcação com diversos por óculos o mesmo captar a expressão de moléculas fluorescentes que foram translúcidas ou transfectadas em vidro ou em vivo o único laser é capaz de citar uma gama de moléculas ou por óculos e conjunto de espelhos e filtros óticos conseguirá captar a fluorescência

emitida por cada um deles dessa forma um citômetro de fluxo equipado com poucos laser pode ser capaz de identificar dezenas de características intrínsecas ou extrínsecas da célula ou particular alvo e o citômetro de fluxo possui ainda um sistema eletrônico que amplifica essas informações captadas pelo sistema ótico e converte em sinais eletrônicos de forma proporcional ao espalhamento da luz e intensidade do sinal de fluorescência gerado Tais dados captados e amplificados podem ser mostrados usando diferentes representações gráficas sendo as formas mais frequentes os histogramas dotplot e conturbados utilizamos histogramas quando o nosso objetivo é avaliar uma única

característica da população estudada teremos no eixo Y o número de vezes que determinado evento foi captado e no eixo X a intensidade de expressão do antígeno alvo de forma que quanto mais à direita neste eixo maior será a expressão do Alvo na população de interesse e os blogs permitem analisar simultaneamente duas características de determinada população de forma que é possível identificar populações que co expressam duas moléculas que expressam somente uma delas e até que não Expressa o hino uma das duas os desse plots e contra o Blocks além da avaliação de duas características simultaneamente acrescentam

a essa informação a ideia de quantidade de partículas estudadas de forma que as áreas mais densas representam maior concentração de partículas os autores apresentam rápido a saturação de pontos e quando trabalha-se com grande quantidade de eventos a informação de concentração é perdida utilizando essa representação gráfica as análises de dados são realizadas através de um sistema hierárquico um dia por seleção de populações de interesse chamadas Gates é possível identificar diversas sobre populações dentro de uma amostra heterogênea o software fornecer e faz estatísticas relacionadas a todos os games criados de forma que o especialista poderá avaliar a

frequência de determinada sobre população dentro da amostra Total ou dentro de uma subpopulação de interesse analisar a média ou mediana de intensidade de fluorescência de determinada molécula e avaliar um número absoluto de eventos captados em um determinado tempo as aplicações em produtos de terapia avançada e no contexto dos produtos de terapia avançada a citometria de fluxo pode ser utilizada em todas as etapas de desenvolvimento e validação de um produto podemos por exemplo na fase de fabricação avaliar e quantificar a expressão de receptor quimérico em células Carter validando o processo de edição gênica realizado em vidro

na fase de avaliação de atividade biológica podemos observar por exemplo A Resposta imune induzida pelo produto de terapia avançada tanto in vivo quanto in vitro on sua capacidade de induzir a apoptose ou proliferação de células alvo análises indiretas também podem ser realizadas caso o produto de terapia avançada interfiram na cinética de ativação de uma determinada enzima por citometria de fluxo é possível quantificar a expressão de seu substrato o produto por exemplo nos desenvolvimentos clínico e não Clínico podemos monitorar a presença de um círculo antes ou até mesmo avaliar a intensidade e duração de uma tempestade

de citocinas produzidas após a administração do produto de terapia avançada fazendo um paralelo devido a seu poder estatístico um desenho experimental utilizado na clínica para identificação de doença residual mínima pode ser aplicado para avaliação de tempo de permanência de um produto de terapia avançada circulante no organismo desde que tenhamos um antígeno alvo chamado marcador para realizar esta avaliação alguns citômetro de fluxo possuem a capacidade de isolar fisicamente populações de interesse processual chamado de seus altos neste processo as partículas que tem o perfil imunofenotipico desejado após passarem pelo? São isoladas em pequenas gotículas Essas gotículas são

eletricamente carregadas e percorrem um campo magnético fixo de acordo com a carga elétrica recebida elas são atraídas a Avenidas desviando-se do fecho central por onde foram inicialmente interceptados pelo laser e sendo coletadas em tubos coletores precisamente posicionados de acordo com o grau de desvio do fecho Central proporcionados pelo campo magnético no contexto dos pt.as a ferramenta de seus sorte hein pode ser utilizada na seleção física de partículas alvo em inúmeras aplicações como por exemplo isolar somente as células karatê que apresentem maior expressão da molécula alvo pela estratégia de hierarquia de Gates ou isolar somente as

células que foram translúcidas com determinada sequência terapêutica de interesse ou ainda selecionar células circulantes com perfil tumoral que surgiram após a administração de um produto de terapia avançada nós vemos então que o experimento disse que eu me teria de fluxo começa com desenho experimental que abrange tanto a escolha do painel de anticorpos que será utilizado visando Minimizar sobreposição de espectros de fluorescência quanto à escolha de controles adequados para realização do experimento com Esta etapa concluída as células são Preparadas em soluções single Cell e marcadas quando necessário com anticorpos de interesse nesta fase é importante atentar-se

para marcações inespecíficas utilizando as soluções de bloqueio mais adequadas para cada situação para evitá-las aquisição dos dados dos citômetro de fluxo é a próxima etapa onde o pesquisador deve atentar-se para os controles de qualidade tanto do equipamento quanto da amostra a estratégia de análise de quentes já deve ter sido bem definida incluindo a avaliação de viabilidade celular assim como o número necessário de eventos a serem adquiridos é estatisticamente os dados observados principalmente em caso de eventos raros por 100 para que os dados sejam analisadas as possíveis sobreposições de espectro de fluorescência devem ser corrigidas por

ajustes de compensação de sinal os dados devem ser analisados seguindo uma estratégia de Gates de forma que o posicionamento deles seja aplicado a todas as amostras os resultados obtidos serão apresentados da forma gráfica que melhor representar o fenômeno observado é