Aula de citometria de fluxo

E aí E aí é bom pessoal hoje a gente vai conversar um pouquinho sobre citometria de fluxo acredito que esse não seja um tema novo você já tiveram esse tema e outras disciplinas sobre os fundamentos da citometria e simetria não é algo específico da da Hematologia nós utilizamos a a citometria na emato Principalmente agora nessa área de imunofenotipagem que vocês tão vendo com Diogo então a gente traz aqui uma revisão desses conceitos que Muito provavelmente você já viram em outros em outras disciplinas A gente vai tentar revisar sobre a citometria nas aplicações e dá um

direcionamento na imunofenotipagem de leucemias que vocês tão vendo com o restante o bebê Então qual é a ideia desde o início da disciplina até agora nós trabalhamos com morfologia a gente veio aí né revisando com você as aspecto o citoplasma isso durante lucro tipo de grânulo colar coração desses grãos só que a gente tem que lembrar que existe uma fase antes dessas células caíram sangue periférico dentro da medula óssea e que essas células são morfologicamente e e diferenciadas e para que a gente consiga complementar o diagnóstico das leucemias por exemplo é importante nós sabermos que

sendo é essa vamos ver alguns exemplos essa foto que tá cortada né a gente tem a célula-tronco essa célula tronco ela passa por várias etapas de mitose e diferenciação é o que que essa diferenciação a gente vai vir com mais detalhes até que cessam as mitológicas e a célula Teoricamente já com aspecto específico características de núcleo citoplasma está pronta para sair da medula óssea e cair na corrente circulatória então que a gente o programa com o a morfologia final da célula eu consigo diferenciar o que que é um erro sinopse de quem é o nosso

que é um neutrófilo segmentado com muita tranquilidade mas o mesmo esquema agora representado na forma de desenho A gente tem uma a célula-tronco uma etapa muito importante dentro da medula óssea de muita mitose e diferenciação eu vejo assim nós pegarmos está linha de amadurecimento morfologicamente essas células são iguais todas elas têm um aspecto de plástico que a célula que a gente vem trabalhando agora mas eu sei que por exemplo essa célula ela sofreu ela é mais imatura ou seja ela sofre um amadurecimento e ela é diferente senão eu colocaria uma única célula aqui e vocês

estão vendo que que são as leucemias por exemplo as leucemias as células para o seu processo de diferenciação Ela continua se dividindo de um é aleatória de uma forma desorganizada de uma forma autônoma mas ela para ela se divide sofre mitose mas ela não consegue continuar o seu eixo de diferenciação certo então aqui eu coloquei um desenho né a gente tem outro procedimentado e nós temos a dois bastinhas uma célula nuclear Uno tello proeminente a pergunta que primeiro a gente vai lá o dar no hemograma presença de 10 porcento de placas trinta por cento de

glace oitenta por cento de do as praticamente noventa porcento de Plus mas na continuação do processo de investigação médico que ele quer saber bem É o braço mas que basta É isso que eu tô dizendo para vocês eu tô dizendo que essas ela com esse aspecto com esta morfologia ela pode vamos representar aqui ela pode ser uma célula que está no eixo de diferenciação no troço mas ela pode ser uma célula que tá no eixo diferenciação dos Oi Márcia eu parou por exemplo a etapa de diferenciação nessa e tal bom então mostrando mais de uma

forma mais quantitativa que a gente tem aqui nessa fotografia né Nós temos muitos laços talvez tenhamos células almas e nós meu próprio segmentado mas é um sangue periférico e tá completamente invadido pela presença da célula e Natura pela presença dos laços e de novo vem a pergunta que Plus 3 missão lymphoblasts e são mieloblasto isso é um precursor de hemácias e são precursores de plaquetas pela morfologia eu não tenho como afirmar isso para o médico então eu preciso que nós tenhamos técnicas e imunologicas para que eu consigo dizer isso é um plástico Mas isso é

um laço precursor de uma sinopse precursor de uma o nosso precursor de uma hemácia a eles que a gente vai ver que a citometria nos ajuda muito nessa diferenças como começar tá dando o aspecto bem inicial do citometria de fluxo com que isso começou a ser pensado e na verdade Aonde isso foi desenvolvido então ele lá eu já tô na etapa de linfoblastos então se nós olharmos anterior a isso eu tenho a célula trouxe diferenciou no ramo linfóide no ramo mieloide nós estamos aqui falando do ramo linfóide tudo bem esse linfoblasto na medula óssea ele

pode se diferenciar e vai se diferenciar recebendo sinais específicos né e linfócito b e o linfócito b quando ativado chega na forma de próximos claro que morfologicamente a gente já conversou entre um linfócito e um plasmócito morfologicamente eu consigo caracterizar esse hemograma mas afirmar que aquele linfócito que eu tô batendo no hemograma você tiver um linfócito b ou se aquilo um linfócito t mas ainda se for do grupo da e eu tô falando de um linfócito t citotóxico ou se eu tô falando de um linfócito t auxiliar o ter Helga nosso olho não consegue distinguir

nós liberamos do hemograma trinta por cento de refós quarenta por cento de linfócitos mas quantos daqueles reforçam B são te help esse Totó os células NK não faz parte do hemograma isso para isso a gente vai usar nude foi a caracterização de linfócitos suco costas infosita áreas que muito alavancou e trouxe a citometria para dentro laboratório tornou um equipamento que a gente já vai ver que a gente pagamento de grande porte hoje em equipamentos compactos e de grande utilidade na monitorização de alguns pacientes principalmente pacientes HIV positivos a novamente ó aqui a gente já trabalhou

com essas fotografias lá então aqui tem linfócitos atípicos aqui diferentes morfologias aqui outros linfócitos é mas a pergunta é por exemplo se nós pegarmos estas células né linfócitos e fósforo pequeno linfócito médio ele fosse até grandes e glandulares e população é essa que eu posso afirmar se esse é um linfócito B CTT real pelo que se torna não não podemos afirmar somente Claro os linfócitos atípicos a gente sabe que estão em Poços T citotóxicos mas isso pelo conceito do Infante D é muito bem então existem cada uma dessas ela sejam elas maduras ou seja na

sua fase de diferenciação essas células tem proteínas específicas na sua na maioria na sua superfície tá E essas proteínas na superfície nós chamamos de CD ou cluster de diferenciação Então hoje nós temos um número enorme né a caracterização dessas populações de células da sua seus precursores e aqui representado então por exemplo o linfócito b todas essas são são clusters que existem desde quando eu tenho um linfócito B imaturo até uma célula B maduras na corrente circulatória se eu tô falando olha para pincelar né então a CDA cd19 você D20 CD 22 vocês vão ver que

aparecem som em linfócitos B quando o olho ele fosse ser e eu não vou nem entrando se a ter real pelo excitotóxico tem marcadores clássicos como o CD1 cd2 CD3 at CD oito aqui nem representados e de três que é um marcador clássico de linfócitos B olha os marcadores de célula NK 156/157 do nós temos esses painéis conhecidos e nós conseguimos então se eu tenho um Pool de células e eu coloco na citometria eu consigo zerbone dar marcando Dr 19 gente a isso são marcadores de uma célula b e tá marcando 3257 estão marcadores clássicos

de uma célula e tá então clusters de diferenciação então aqui representado Isso aqui é uma célula é a outra gemia de uma célula B near desde uma célula Tron uma célula bem imatura vejam ela recebe o sinal o fatores de crescimento ela recebe o sinal logo depois de célula-tronco você será um linfócito b então essa célula vai passar por diferentes etapas de e vamos ver o que que acontece com essas ela olha lá né então aqui eu tenho no extremo uma célula 1b Maduro e aqui o início da sua capa de diferenciação vamos ver esses

marcadores clássicos então a começa aparecer H ele a br br br e o Dr acompanha toda a ontogenia de uma célula bc34 a quando ele é uma célula bem madura cd34 mas vejam que quando ela já começa a amadurecer você tem 34 some então isso é muito importante marcadores que podem existir ainda quando uma célula B imatura mas quando já é uma célula B madura esse marcador não existe mais caro a gente acompanha evolução da célula vejam aqui logo nem isso são poucos os marcadores E aí tu começa por exemplo no mercado intermediário é lindo

Dr você desce olha lá quem aparece de 19 você d20cd 38 marcadores muito importante de celular dele e quando a célula Beta O duro é que ela sai da medula para cair no sangue periférico ela tem marcadores específicos vejam aquela não tem mais o cd34 mas ela continua tendo 19 21 22 então a gente conhece esses marcadores já adiantando para vocês você de 34 ele não é um marcador linhagem específico a gente vai rico 74 aparece também em outras populações de cela ele é um marcador de imaturidade para vocês terem uma ideia a célula-tronco aquelas

ela ele potente capaz de diferenciar em qualquer uma dela a célula-tronco é cd34 positivas então 134 é um grande e marcador de imaturidade que vão ver que as células começam com marcador cd34 o 34 some e Começam a surgir os outros marcadores e são específicos da sua alinhar E se nós fizermos a mesma o mesmo tipo de relação com linfócito T novamente Ó eu aqui a gente teria célula-tronco E essas ela recebe o sinal você será uma linfócito T help você será o linfócito t citotóxico quando eu digo que recebe o sinal Claro existe algo

na periferia que tá fazendo a indução da produção em maior quantidade dessas células Tá então vamos ver a mesma ideia olha lá o cd34 que eu falei para você só então a célula ter a célula B no início era cd34 essa também a 134 beijão 3434 pimba sobre o cd34 e as células já maduras não são essas de 34 positivas Olha quem aparece numa fase bem Inicial também de uma célula t c D7 C D7 C D7 e aqui eu tenho a grande diferenciação o que eu tenho tecido tóxico e aqui eu tenho terrestre vejam

que eles são se de sete mas claro e outros marcadores que dão o nome específico as suas ela vamos trazer isso aqui que são esses marcadores né são as proteínas que darão a função para essas ela eu quando eu falar no linfócito dele pense 19br é porque ele tem a função como linfócitos B na Resposta imune específica quando eu falo no tecido tóxico eu digo a ele SP3 CD set e é uma cabeça lá ter mas ele acendeu oito então você deu oito o que vai dar né é uma das grandes moléculas o CD que

vai dar função para ele ser um tecido tóxico Olha quando eu olho can help ele é 34 37 o outro também há 13 7 mas ele é CD4 Então você de quatro é um marcador de linfócito T réu chá é assim que a gente vai trabalhando em qual a ideia de montagem fazer uma simetria do Frozen pra que uma representação dos primeiros sintomas que surgiram ali pelos anos 50 a 40 50 equipamentos enorme de grande porte Opa muitas vezes quase uma sala inteira e hoje né versões modernas Inclusive citometro só de 13 cores eles estão

cada vez mais compactos e cada vez a Copa mais diferentes laser o a capacidade multiparamétrica que é uma grande vantagem dos planetas o que que é citometria de fluxo então uma método de análise citológica através do equipamento equipado com um raio laser né uma fonte de raio negro que a gente já viu quando ver 13 cores pode ser Associação de dois três meses diferentes que permite identificar caracterizar contar e separar e a separação física de células em suspensão que que significa em pó a partir da coleta de amostras a gente já vai vir que materiais

a gente pode passar na sua alegria pode ser medula óssea sempre espere diferente então o que a gente tem quando a gente tem um aspirado de medula óssea então a agulha vai puxar através de dentro das trabéculas da medula óssea ela vai puxar então aqui a gente sabe que é o local rico em uma mistura dentro da medula nós temos todos as células os precursores célula-tronco e já células diferenciadas essas ela vai estar caindo você que prefere se ele fosse fazer uma lâmina desse material que foi aspirado pela seringa seria esse aspecto quase impossível que

a gente fazer uma contagem diferencial da gente conseguir caracterizar que células nessa e a gente tem que lembrar aqui o exame de medula óssea assim como hemograma o médico ali libera uma contagem diferencial mas imagine que se eu tivesse cheio de blastos seria difícil da gente trabalhar com caracterização individualizada então o material Olha lá então a partir desse material que saiu é do aspirado de medula óssea vejo as células todas elas misturadas elas vão passar né para o stream peixe elas vão passar uma a uma entanto parte de uma suspensão e tu limita essa suspensão

cada uma dessas células da sua atenção vou passar uma uma na frente desse raio laser e existem detectores que vão começar a caracterizavam que seu é essa que tá passando primeiros grandes paramos de são preconizados bom é o tamanho da célula Tá passando e a complexidade a o grau a quantidade de grânulos que tem o citoplasma dessas célula EA partir disso então são gerados gráficos então eu já tenho a partir da suspensão eu já sei quantas células de tamanho pequeno de baixa complexidade quantas células de tamanho grande e de uma hora complexidade isso né pessoal

e a pode é seco eu posso trabalhar o sangue periférico medula óssea com sangue de cordão com material de aférese eu posso ter aspirado de líquido líquidos biológicos líquido pleural líquido de ascite através de análise de linfonodos tumores sólidos a gente tem um muitas vezes uma peça e eu consigo a partir de uma célula de um de um órgão físico como se fosse ou é um linfonodo a gente injeta meio de cultura eu consigo transformar em eu consigo extrair aquelas células Então dentro do bico nós transformam isso uma forma respira consigo trabalhar na análise por

citometria e células de cultivo celular tá Então olha lá tô aqui a gente Então na verdade a gente vai estar caracterizando que clusters né e proteínas existem Então olha só o tipo de é a riqueza de informações que a gente pode ter através da citometria de fluxo né então eu tenho ó eu primeiro vou ter uma ideia do tamanho das células que estão naquela suspensão ou ter uma ideia da complexidade dessas células e eu posso trabalhar o apanágio DNA eu posso trabalhar proteínas receptoras na superfície essas células o antígenos celulares o enzimas que existem nessa

célula com citocinas ou com a diferença na área de metabolismo Então são muitas as utilidades das plantas de frutas no dia a dia a gente vai trabalhar muito aqui Direcionar para antígenos celulares que a parte da imunofenotipagem de meus amigos Então olha lá né então eu tenho a minha célula eu sei que esse CDs eles estão o citoplasma ou na superficial intranucleares e o que a gente vai fazer além de caracterizar o tamanho EA complexidade da célula olha logo que a gente pode caracterizar eu posso jogar umas corpo um antes e de um anticorpo marcado

com uma substância fluorescente então além do tamanho da complexidade eu posso dizer essas ela é de pequeno da mãe de baixa complexidade e tenho CD A CDB cdc e aí eu consigo num painel saber bom a célula pequena o baixa complexidade e que tem esse conjunto de clusters é um linfócito b ou é o precursor de uma Selma b não tem outros marcadores então é um precursor de uma célula t e real pertence Tokyo é um precursor de uma nosso é um monoblasto já é uma o nosso Mais maduro então é o conjunto de CDs

que tem naquela célula que caracteriza Quais são as células que tem naquela suspensão que eu tô injetando na rivânia do que a representação né então a célula passando na frente do raio laser Primeiro ela emite é diferente ela faz uma dispersão de luz então existe um e se chama de power IFSC que a esse raio que mede o tamanho da célula Então dependendo do tamanho da célula a luz emitida exatamente na frente né Dani caracterizavam Marcelo de pequeno da mãe ou é uma célula de grande tamanho e os AIDS é ter que são esses raios

laterais que são projetados são através da complexidade Na quantidade de grânulos que tem então Imaginem esse raio laser batendo chegando no Win fosse tu ele vai dizer que uma célula pequena e linfócito tem grana ou não e de baixa complexidade se esse raio laser se o que estiver passando na frente ao mesa foram neutrófilo segmentado a gente sabe que o neutrófilo é maior e ele tem muito grânulos citoplasmáticos ele tem uma complexidade maior ele vai ter um tipo de raio lateral emitido diferente da representada aqui certo e a partir então desses detectores nós começamos a

plotar gráficos Esse é um dot-plot e esse é um gráfico se vocês lembrarem né ou se vocês é um gráfico que tem lá no laudo do hemograma aquela folha de equipamento que a gente tem colocado para vocês tá então o hemograma os alunos equipamento de automação do hemograma eles têm um sistema de citometria de fluxo acoplado aos equipamentos então com isso né eu consigo dizer bolsa Eu vegetal hemograma na máquina lembra que a gente tem principalmente linfócitos monócitos e neutrófilos e olha lá R1 provavelmente são linfócitos uma célula o eixo do x nesse caso médio

tamanho Oi e o eixo do Y mede complexidade então é uma célula de baixo tamanho de baixa complexidade são os linfócitos uma célula de tamanho maior e de complexidade intermediária monóxido eor3 uma célula também de tamanho maior maior complexidade muito Grano são os neutrófilos tá então assim se você se projetar isso lá no hemograma é a 5 equipamento consegue fazer a contagem diferencial porque ele é grupo né ele determina o ambiente determina uma região e dentro dessa região em relação ao 100% X por cento são em Foz X por cento são os nossos dias por

cento são neutrófilos segmentados e claro que ainda tem Josenópolis os basófilos que a automação consegue contar tá é exatamente isso que a gente tem a gente tem uma suspensão de células são injetados equipamento as células passam uma uma na frente de um raio laser existem detectores o que dá representada aqui é que além do tamanho da publicidade da publicidade a gente pode fazer uma reação bancada uma reação de imunofluorescência direta e eu posso marcar então além de dizer o tamanho complexidade eu posso dizer que clancy's que tem na superfície das células que eu tô analisando

tá Então essa é a representação né a gente faz a reação antígeno-anticorpo aonde esses antes CDs estão a casco substância fluorescente quando o raio laser bate essa célula Ele ativa Essa florescência ela passa a ser brilhante no caso aqui uma folha ciência ver tá aqui são fotos de microscopia mostrando essas colorações Se a gente fosse colocar esse lâmina né então eu tenho células marcadas com a fluorescência vermelha uma flor Essência verde e vejam aqui a parcela marcada com fluorescência vermelha com flor Essência verde que a microscopia não tem condições da gente fazer as análises mas

as prometer o que somos da Então esse padrão de análises multiparamétricos aqui é a mesma coisa ó PSOL são células que tem uma fluorescência vermelha tem uma folha flor Essência Verde então tem clusters e só por esse sistema de passagem de células uma uma com detector específicos da cor da adolescência e são capazes de caracterizar aqui são os urocromos que nós temos disponíveis no mercado e os laser esqueçam a capazes de né o comprimento de onda do laser que vai ativar aquela fluorescência tão Hortênsias reconhecidas isotiocianato de fluoresceína FPC fico eritrina da percep if tá

então são é como os equipamentos são e os laser que eles têm comprimentos de ônibus laser e os fluorocromos que nós compramos os monoclonais no mercado doença é realmente a representação né então a suspensão de Selma que passou por uma reação de imunofluorescência direta passando uma uma na frente do raio laser a medição então de tamanho complexidade e também a distribuição então todas as células eu tenho flor colocou CD marcado com azul se demarcado o por Celina o CD marcado com vermelho então quantas células foram marcadas e sumir da representatividade quantitativa do tipo de células

e naquela suspensão a novamente a ideia né então vejam uma suspensão aonde essas células estão misturadas aí nós marcamos hoje corpo e nós conseguimos através de detectores caracterizar plantas tem a fluorescência perdi tantas tem a fluorescência laranja plantas tem a fluorescência vermelha e a representações que vocês vem nos artigos dos livros eu posso ter uma representação aonde eu mostro a cada uma das florescências de forma individualizada que é na forma de histograma eu posso olhar duas florescências ao mesmo tempo que o dot-plot ou existe também a representação de três problemas obras são bem moderna eu

consigo olhar três a fluorescência simultaneamente tá então aqui só realmente para gente reforçar o que que a gente tem filhos bolsa um monoácido isso é Márcia Isso é uma plaqueta além da informação o Nossa eu sei que uma nós se tu tem é um marcador clássico de monócitos na sua superfície de 14 eu sei que as hemácias na sua superfície tem glicoforina então se eu tiver um marcador antes cd14 uma flor Essência eu consigo fazer essas análises eu sei que a plaqueta tem 161 eu sei que o neutrófilo segmentado tem que ser de 16 e

vejam esses marcadores eles não se repetem 14 é Manu O que é marcador de a massa cd16 que marcador de neutrófilos assim a gente vai fazer uma diferença tá então vamo molhar um pouquinho as aplicações que a gente tem justamente da citometria de fluxo que eu falei para vocês não é só para e mato né mas para nós né marca citometria entrou realmente com uma ferramenta muito importante então imunofenotipagem me forçar então a caracterização de suas populações linfocitárias comentei com vocês não é hemograma eu não consigo dizer quem é b e quem é real porque

a pessoa tóxica é a célula ele tá mas tem muitas doenças muitas situações em que eu preciso caracterizar quantos não dá o resultado Global dermograma trinta por cento de linfócitos 2500 células por microlitro Sé o médico e quer saber muito bem desenhada por cento de 2.500 uniforme mas quando sou réu quando são ver porque exemplo clássico 400 infectados com vírus da guarda é aonde o HIV a porta de entrada é a molécula CD4 e o HIV destrói e a justamente essa destruição CD4 que faz com que as infecções oportunistas lembram-se de quando a gente falou

lá no áudio processos infecciosos é é linha de frente é ele que começa depois do neutrófilo depois de chamar o nosso é o te rapper e continua né que monta toda a resposta desse paciente que não tem CD4 está completamente esposo ele não consegue montar e não consegue finalizar E aí vem as infecções oportunistas então eu não posso dar para o médico soldado grupo mas eu tenho que dizer ele tem tanto de ser de quatro o número de CD4 dele tá normal não ele está com o número baixo de ser dentro das políticas de antirretrovirais

para o estadiamento da doença é outra coisa tem as deficiências congênitas então crianças que nascem apresentam infecções repetitivas muitas vezes a senhor deficiência são as causas genéticas A então a gente precisa dizer esta criança não consegue produzir o t-rex e Fausto B para isso eu preciso instalar quantificação Então olha lá novamente a representação né seu esquema normal essas células tanto ter help tanto me fosse o tem como como eu posso ver o início da sua diferenciação é na medula óssea através da célula-tronco lembrando né que o linfócito b ele começa na medula e ele se

ele fica pronta na medula e vai direto sem periferio e o linfócito t ele passa por um estágio intermediário no último e continua seu diferenciação quando ele está pronto no último aí ele vai para órgãos linfoides periféricos onde ficam armazenados e quando necessário que são rapidamente mobilizados né então aqui a gente consegue ver tá então começa o linfócito b ganhando perdendo bom saber que tem uma célula B pronta Unifor se tu te começa na medula passa por último Olha que interessante né ele vai ser no futuro ou help esse de quatro ou cd8 que tecido

top mas vejo que não é etapa intermediária antes disso ele tem as dois clusters na mesma cela ele é CD4 e cd8 simultaneamente até que por sinalizações ele vai se definir boas e reta Então você de quatro eu superei citotóxicos transferência de oito lá neste formato eles serem armazenadas em órgãos linfoides periféricos tá bom então Realmente foi um grande a lava alavancador para que a simetria entrasse nos Laboratórios sair dos laboratórios de pesquisa Grazi foi a necessidade de codificar CD4 e cd8 para pacientes HIV positivos eu vou ver um exemplo né Então olha lá então

eu pego o sangue periférico de um paciente marco com CD4 cd8 um objeto no equipamento e peço que que tá minhas fazer essas separações tá Então olha lá então ao injetar o sangue periférico eu tenho linfócitos monócitos e granulócitos e como eu marquei com CD4 cd8 eu peço para o sistema me dizer quem é no eixo dos X quem é cd8 no eixo do Y quem é a cb4 equem é marcador CD4 e cd8 tá E ele separa muito bem uma veja o que ele começou marcando eu que seleciona primeiro dentro da região de linfócitos

quantos é muito quando são citotóxicos e quantos são CD4 quando sessão Helga vejam que nessa casa ela 48 no sangue periférico não existe vou voltar lá onde é que tem essa célula no último no último eu tenho uma célula duplamente marcada mas a célula pronta é quatro ou ela é oito como a gente tá mostrando aqui um exemplo de um sangue normal então esses linfócitos eu selecionei Eles serão ou 4 ou Oi Então essa é a representação né se nos separarmos as suas quatro grandes grupos Neo três grandes grupos de células eu tenho o eixo

do X Quem é cd8 então aqui tem cytotox no eixo do Y quem é CD4 então a população 64 essa população aqui que marca 27 por cento ela não é nem 64 um mês e deu oi Nós pensamos que aqui estão os linfócitos a b e as células NK II e o exemplo de um paciente né da quantificação de CD4 e cd8 para pacientes HIV positivo então nesses primeiros três quadrantes uma situação normal aonde eu tenho sangue periférico aonde eu paciente tem CD4 e ele tem cd8 adequadamente certo aqui a 13 e 4 é a

população de help a olha um paciente HIV positivo né mesma coisa né marcação de sangue periférico mas olha só que interessante ele tem cv8 mas ele não tem ó vamos comparar a população de CD4 do paciente que não tem um 64 de quem tem né quando eu faço a marcação três e quatro ó até o azulzinho que seria para marcar o réu pelo específico daquele paciente o gráfico mostra e tá quase Zerado eu esse é o caminho clássico de um paciente HIV positiva onde o vírus HIV ele infere das células CD4 e ele mata essas

células CD4 E assim a gente consegue quantificar a gente consegue dar esperamos IPMet é muito bem depois de olhar quantificação de sua populações linfocitárias outra grande aplicação para nós na hemato é a quantificação de células-tronco lembra lá por vocês falaram sobre hematopoese o a quantidade de célula-tronco a gente tem de na medula no sangue periférico né na corrente circulatória a gente sabe que essa quantidade é na ordem de menos de um por cento então de novo né todas as ferramentas que nós temos de hemograma de medula o grama praticamente impossível como é que a gente

vai contar uma célula 04008 do centro eu preciso realmente uma tecnologia imunológica específica para poder pensar essa célula específica e quantificado toda né e deu uma quantificação células-tronco ela é muito precisa e hoje é por citometria de fluxo que a gente faz a nice o desenho né o desenho ele já é muito representativo Então esse primeiro gráfico lanche do X cd34 tá e o sai discreta ele a complexidade vejam marcado de vermelho eu consigo de uma forma muito precisa separar as células-tronco do resto todo você ter uma ideia só que muitas vezes a mais de

100 mil eventos e objeto e o outro 100 mil células e o sistema consegue determinar nessa sem os elas quantas ela passou que eram cd34 lembra que a gente falou cd34 lá que eram marcador de imaturidade na hora não resultado a pessoal 045 por cento é o percentual dessas células cd34 as vermelhinhas frente a 100 mil eventos Então realmente só uma tecnologia dessas é capaz de sem parar não teria condições por métodos colorimétricos em lâmina comum de fazer esse tipo de análise o mesmo né aqui mais a nível Oi Isa a quantificação de células mesenquimais

mesenquimais eu pego muito experimento com cultura de célula e olha lá está falando de uma população 0,09 olhos pontinhos Vermelho nos quatro gráficos então a precisão do sistema que consegue caracterizar bom nesta população que a gente está analisando seja o material de Cultura existe menos de um por cento da população específica no para separar e se vocês olharem lá também naqueles a gente falou aqui além de contar essas células minhas em quantidades Muito pequenas o sintoma alguns sintomas também podem separar o que pode dar um sinal para equipamento que atende Jetta o material o equipamento

ele contém tudismo as que são cd34 eu quero coletar recolher separar e do coloca um frasco e do separa daquele material essas população 10 400 000 por quê Porque tu pode ter um outro experimento que tu continua a partir dali Bom agora eu vou fazer uma nova cultura das células cd34 positivas que eu estimulei que eu comecei lá no meu primeiro experimento muito bem terceira grande aplicação da sua meta de fluxo de novo para nós né é muito importante o diagnóstico fazer o cinismo então vocês estão conversando sobre isso nas aulas com o professor Diogo

né ou irão conversar de uma maneira mais detalhada e você sabe em que a imunofenotipagem é uma grande ferramenta no diagnóstico das leucemias seu paciente vento na clínica a partir da Clínica ele tem um hemograma muitas vezes ficar de braços ele tem o mesmo holograma também infiltrado de blastos e a etapa seguinte o médico nos perguntam muito bem laço lilás o mesmo tanto que a gente caracterize a linhagem celular dessas células é citometria se presta muito bem para isso tá Então olha lá e a linhagem e determina maturação celular eu consigo de exatamente onde foi

o momento da parada da diferenciação e também a monitorização terapêutica né doença residual mínima depois de ter feito o diagnóstico de ele está em tratamento eu consigo rastrear se ainda existem o carácter dizer qual era a célula mais Negra e eu consigo ir acompanhando ao longo da quimioterapia no tratamento se ainda tem algum resíduo daquela célula que eu conheço muito bem o fenótipo dela vocês viram quando a gente falou que tava 74 eu consigo pegar quantidades Muito pequenas lá não tem outros netos também mas também que se presta bastante para isso a aqui eu retorno

novamente os gráficos que nós temos a bancada Então essa é a diferenciação de uma célula AB eu vamos lá então ela você de 34 lá que tem um aqui ó aqui nesse povo da esquerda vocês pensam que depois da célula-tronco é uma célula que já tá comprometida com linhagem ver bem imatura e ela a diferenciação até está pronta para cair no sangue prefere eu vejo no início de uma célula B ela é cd34 ela sd10 e começa a presença do CD 19 grandes marcadores de uma célula B né veja o que ao longo da sua

caminhada ela perde o cd34 Né o CD 19 ganha muita expressão a célula bem madura tem esse de 19 o CD de Asas ele fica numa fase intermediária e some veja se Vocês pegaram linfócito B maduro por fazer uma marcação do sangue periférico o que que eu espero encontrar então cd19 cd20 um pouco se vê 38 Aqui não está representado uma Saga ele a Dr são marcadores clássicos de uma célula dele e olha só mas confuso né mas sou marcadores da linhagem granulocítica ela mieloblasto promielócito menta bastão a dessas células Eles já têm caracterização morfológica

a gente consegue determinar no hemograma mas aqui a gente tem marcadores muitas vezes a Daniela oblação muito importante falar o 34br 1333 todos são marcadores de Mas calma mieloide ou se fazer a mesma coisa com monócitos E aí o marcador clássico Acer de 14 cd36 então E jogaram com esses marcadores vão ver o marcador tal tal tal e não deu os outros então eu consigo jogando nesses gráficos caracterizar a linhagem e o ponto de parada dessas tá aqui só pra vocês verem como a gente consegue fazer essas diferenças ações essa é uma distribuição de uma

medula óssea normal o azulzinho então né são as células cd34 positivas e olha lá o início do método comparativo essa uma distribuição normal e olha que a população Azul mostrando que tem células diferentes do padrão normal da lista é o primeiro passo para a gente fazer essas lindas tiras fortes aqui também uma outra representação de cariótipo alterado estou aqui em cima lá como é o comportamento dessa célula no a medula normal usando 3445 Dá um beijão que ele faz essa onda né o 34 a 38 Olha o paciente que tá com uma leucemia bi ou

seja ele tá com a medula completamente infiltrada B Jockey o que que eu esperaria essa medula do paciente estivesse normal e este comportamento celular vejam que nós temos maciçamente uma monotonia celular nós temos um padrão além da monotonia a monoclonalidade Ou seja é uma medula totalmente infiltrada por blastos o padrão normal e Eu não estudo de plaquetas e hemácias também né Vocês viram lá na primeira área sobre a hemostasia muitas vezes a dificuldade então também as plaquetas em marcadores clássicos os eritrócitos tem marcadores clássicos e eu também algumas trombocitopenia da hemoglobinúria paroxística noturna é muito

importante a a citometria nos ajudam muito nessas análise de diferenciais tá estudos cinéticos também só que já não entra tanto muito amassar é muito nível de pesquisa mas eu consigo ver aqui por exemplo imagine eu tenho uma célula ou determinado estado né e eu estimula essas ela isso aqui muita nível de Cultura coloca uma substância para estimular para ela entrar em divisão para ela expressar marcadores expressar citocinas EA gente consegue muito bem determinar isso por citometria e por último também uma outra grande aplicação a mais doce bom então a gente sabe que essas células né

Elas podem estar no seu estado estático ou elas podem estar em pena mitose e banho na divisão celular EA gente também consegue caracterizar essas células estão estão entrando em um grande percentual de divisão celular tá bom pessoal A ideia era justamente essa né era a gente passar um pouquinho da desse conceito retomar o conceito que eu entrei trazer um pouquinho para o lado da Hematologia como que a gente utiliza isso Lembrando que eu que os equipamentos de automação eles têm citometros eles usam a citometria dentro da análise diferencial no leucograma no dia a dia do

laboratório para que a gente tem um sintoma do específico mas tem que lembrar que eles estão no dia a dia do laboratório tá bom Um abraço