Citometria de Fluxo PARTE I

e fala pessoal tudo bem hoje a hora vai ser substituto meio triste fluxo e hoje divide essa aula em duas partes ficar muito puxado por um dia só então vamos lá citometria de fluxo então é uma técnica né que para você utilizar você precisa de um citômetro de fluxo e esse aparelho a são camilo nós conseguimos comprar um com nosso projeto da fapesp em um aparelho que é caro só ele custou 53 mil dólares então o aparelho que é bastante importante porém é caro e hoje a gente vai aprender como feito os gráficos estão me

deste fluxo para que que serve essa técnica né então com a citometria de fluxo gente pode ser utilizado para fazer identificação avaliação diferenciação células e de outras características também como por exemplo conteúdos de rna e dna você está presente fazer a parte de de proliferação de material genético das células aumentou ou diminuiu dna a receptores de superfície e ação a cebola imunofenotipagem produção de citocinas e apoptose obviamente que a gente não aprender tudo nessas duas aulas que dividir mas pelo menos uma ideia geral a citometria a gente vai sair dessa aula tendo mostra um mês

de fluxo também é utilizada para contar examinar e classificar partículas microscópicas em suspensão em um líquido e influxo as partículas para a gente o que a gente faz chamar de partículas na grande maioria das vezes são células essas células ficar soltas uma uma uma desvantagem da citometria de fluxo é que a gente só consegue analisar células quando não estão compondo um tecido se ela ficar soltas então dá por ele por exemplo para ver a célula da pele são todas muito lindinhos a não ser a não ser que consiga fazer um jeito de descer o tecido

deixar as células individuais aí sim eu posso usar citometria de fluxo caso contrário não não sempre células individuais e passou vendas a técnica logicamente preciso do aparelho que é o citômetro de fluxo eu não consigo a sentimento de ser feliz então passa aí a senhora detecção de substâncias fluorescentes né tratante nós usamos fluorocromos geralmente esses urocromos também são acoplados a anticorpos então lembra lá na aula de elisa que eu tenho um anticorpo coplado a mão em cima então aqui a gente faz o que umas corpo ele acoplado a um fluorocromo e é com sorocamirim vítima

em comprimentos de onda luminosa então o aparelho tem como detectar isso além disso se torna consegue fazer uma purificação celular a partir de uma solução heterogênea de células por exemplo esse aula do sangue e essa célula em vários títulos desse desse grupo de servos tem vários tipos celulares digamos que me interessa purificado ali apenas ir em postos b ou as células teve existe como fazer isso procedimento de fluxo sem e essa essa é uma técnica dentro da citometria que é chamada de cell sorting a separação celular e se também seja fluxo tem como princípio básico

o emprego então joão radiação laser a gente vai ver que tem diferentes leis eles que podem interceptar células são direcionadas para excitação do grobo os urocromos então ao serem excitados por esse laser eles emitem uma luz que dependendo do comprimento de onda possui certas características característica uma cor característica assim a gente pode pesquisar informações biológicas moleculares bioquímicas das células que estão em suspensão o e-mail é um tampão nos coloca aquelas ela para ela não estourar bom então aqui tem um desenho de um citômetro de fluxo não é sensitômetro entao ele faz o que ele colé

coleta os dados filtra e converte do isso aí e pulso elétrico é uma data então o sistema computacional para computador e a parte do computador a gente consegue matar os nossos gráficos citometria de força eu não tipo de gráfico max.com simplesmente gráfico de pontos eu acho que você já deve ter visto é gráficos semelhantes a esses em alguns artigos científicos porém é na aula de hoje e a próxima vamos aprender a interpretar esse tipo de gráfico de citometria de fluxo e então como é que acontece né aqui eu vou colocar meu público com células nas

células tentar suspensão eu falei antes geralmente a gente coloca é um dos 10 a sexta células em um ml de gps dessa solução salina mas aí as proporções podem variar de acordo com o protocolo de cada laboratório então essas células são enviadas por esse capilar para dentro do seu tópico e lá dentro ele vai encontrar uma estrutura é chamada de flor céu essa aqui ó e a flor o céu como se fosse o coração dos sintomas lá na flor céu ela para receber esse banho de tampão e a flow cell a linha essas células para

que elas sejam direcionadas por laser uma alma a gente olhar que ela estão todas misturadas aqui né em baixo e aí comprascomércio a seguir e chega na flor céu lá na na fosse ao e esse tampão e o alinhamento dessas células uma enfermeira uma alma para encontrarem o laser bom então aqui eu tenho é a força que eu falei adianta as células aqui eu tinha presença do laser e esse laser então ao interceptar célula a luz do laser é desviada e a partir daí a gente consegue determinar algumas características essas ao quando o laser atinge

a célula eu tenho detectores que fazem a detecção deste desvio da luz do laser quando a a célula interceptado por ele logicamente a célula possa tá com fluorescência ou não e aí as características vão variando em ao longo da aula a gente vai explicando melhor tudo isso como é que isso funciona bom então dependendo do citometro da mostra o fluxo pode ser dessas células por segundo ou até 10 mil células por segundo medicamento costumo falar que eu vou fazer que nem carga é isso em seus carros que são mais baratos e fazem algumas funções e

tem aqueles carros mais caros né com a direção e tem bluetooth tem ou seja quanto mais acessórios tem o carro mais caro ele vai ficar assimetria é algo semelhante a gente tem sintomas que fazem as leituras básicas e tem sintomas que fazem muito mais coisas no aparelho só então eu tenho citometros que fazer muito mais coisas no aparelho só acaba sendo muito mais caro né e as mais coisas tá bom então como que as células alteram face de laser que incide sobre elas né é umas uma parte do fecha desviado levemente pela célula a luz

desfiada atingir o detector que é chamado de full out scatter ou apenas a sigla que é fsc e traduzido em português seguir dispersão frontal mas geralmente no lápis laboratórios e gente fala a sigla fsc e uma parte do feixe do laser desviado fortemente pela célula essa luz desviado atingir os detectores chamados de sites que ter ou ssc que traduzido português de inspeção lateral a gente vai entender receberá nos próximos slides os varden isso então fsce ssc bom então eu estava as características do fsc dados gerado a partir desse detector fornece qual informação para gente é

fornecer informação com relação ao tamanho da serra a mãe da se tem uma célula é menor e essa célula aqui ela é muito maior né que a gente sabe que o nosso sangue por exemplo eu tenho células com diferentes tamanhos exemplo tem aí mas fica pequenininha aí tem um link sócio tem um pouco maior que é márcia aí eu tenho os monócitos são maiores redes de postos aí eu tenho os granulócitos e são ainda maiores e mais eu não gosto que os linfócitos por exemplo então eu consigo fazer uma diferença de tamanho da célula usando

o apenas um laser sem fluorescência e a usando o detector fsc que dessa noção de tamanho para ver como é que isso funciona bom então eu tenho aqui quando laser incide que não tem a célula ângulo surgiu no céu eu tive desligue da luz laser não sem dizer então desvio eu tive foi 10 nenhum porém quando a gente encontra uma célula e as ela desse tamanho por exemplo laser atinja ela e quando o laser atinge deve ter desviado de um tanto vai delimitar pela membrana plasmática da célula concordo que vai dar o tamanho da célula

e aí nesse caso eu botei o número aqui eu qualquer número 3 aí e eu posso usar uma célula um pouco maior por exemplo aqui o sinop por exemplo quando a luz do laser atinja essa célula vai ter uma multiplicação também porém comercial é maior ou o laser vai se desviado de uma maneira maior também a célula houve o desvio e o desvio da luz foi sete nossa célula anterior era muito falsa como ele era menor eu coloquei o dizia três e aqui com as ela é um pouco maior que um granulócito é um ele

eosinófilo eu coloquei com desvio da luz valor 7 pra gente poder montar um gráfico com isso ah e só lembrando que até aqui a gente sabe que eu falei para vocês que a citometria a gente observa a compostos fluorescentes mas por enquanto eu já tenho dois dados o tamanho da célula por enquanto são desculpa tem dado que é o tamanho das células se ela menor ou se ela é é maior sem o uso de florescência apenas a incidência da luz do laser na célula as escalas tamanho como é que ficaria a célula menor aqui três

e a célula maior aqui em 7 e o dado geraldo a partir do detector ssc que ao side scatter fornece informação sobre a granulosidade da célula quando eu falo de granulosidade alguém posso falar de complexidade interna significa isso né as células não sabe que dentro delas eu tenho lá organelas vários grânulos tem um lucros e social e tem células tem muito mais grana não se muito mais organelas que outras células então eu falo que essas células tem muito mais conteúdo no seu citoplasma de grânulos independente do seu tamanho tá e falo que essa célula é

muito mais granulosa então quando a luz do laser atinja célula logicamente caminho branca da serra é de lipídios e proteínas essa membrana é transparente a luz do laser quando passa por essa os ela delimita o tamanho da célula pelo pela delimitação da própria membrana plasmática porém quando laser também penetra na célula a luz do laser penetra na célula essa e vai encontrar um novo que essas grandes encontrar organela vai comprar um monte de coisinha lá dentro e cada coisinha que o laser a luz do laser encontra no interior da célula e isso faz com que

eu tenho desvio da louça é uma maneira mais forte e aí vai dar uma noção do que para gente noção da complexidade dela dessa célula ou simplesmente uma noção de granulosidade dessa célula para ver como isso funciona bom então aqui sim céu passa da luz qual foi o dizia aqui na verdade marcelo porém quanto tem aqui a presença de uma célula quantidade x aqui tiramos ela fez um leis ela atingiu ela essa célula teve um desvio da luz e aí eu coloquei aqui o valor de 2 do ssc que eu tô vendo que granulosidade não

tô vendo mais o fsc o fsc é o tamanho ssc é a complexidade interna ou grande velocidade dessa célula e aí cê tem uma outra célula com mais grânulos e o laser atinge essa célula quando atinge eu vou ter um dizer diferente porque tem mais grana do que a célula anterior concordo então aqui eu coloquei o desvio forte da luz como sendo o valor 5 tá bom então o dado geraldo eu acho detector ssc fornece a informação que eu já falei antes sobre a grandiosidade opção então escalar o que marcelo a menos gasosa aqui na

escala 2 e na célula mais eu não goza que nem escala 5 e então como seria um gráfico de tamanho programa o cidade lembrando que esse gráfico instrumentos de fluxo é o gráfico eu não estou usando adolescência ainda vou fazer um gráfico que é um gráfico de pontos sobre o gráfico de ponto sentimento de dot-plot e nesse gráfico eu tô usando apenas duas características o tamanho da célula ea sua grandiosidade então como que estaria esse clássico então para células que são menores elas estão localizados nessa região é de tamanho 3 e que não poderão novidade

dois para as células que são um pouco maiores essas células localizaria hoje é só se ela quer maior mas se localizar o tamanho 7mb oleosidade cinco então se fosse fazer um gráfico de tamanho eu quero velocidade esse gráfico seria mais ou menos assim mas não é assim que a gente vê no gráfico de citometria de fluxo né pra gente ver os pontinhos cada pontinhos gráfico dot-plot representa uma célula o gráfico que eu fiz isso para vocês entenderem aonde passa a população celular bom então ao por exemplo eu tenho um grupo de células a purificados aqui

no tubinho temos que essas células são sejam linfócitos todos os mesmo tá mais usando a grande velocidade essa célula apareceriam como desse gráfico desapareceriam nessa região aqui ó tamanho 3 e grandiosidade 2 o que tá aparecendo aos poucos porque assim aos poucos que vai aparecendo no setor dentro pouquinho e agora que digamos que eu tenho uma purificação de outra célula tenho que células mais maiores mais grandiosas são eu pus eosinófilos então digamos que essas células aqui assim purificados por exemplo tá e vou passar elas não citometros a ver justamente tamanho ea grandiosidade hoje que apareceria

essa população de célula né mas ele tá piscando então essas células em tamanho 7 e a sua cremosidade e volta de 5 a partir daí eu tenho que relações se eu posso aplicação purificado então nesse gráfico ela apareceria um nessa região lembrando que cada pontinho representa uma célula é isso eu tiver essas duas células misturadas né então aí marcelo aqui é menor em uma célula que é maior na célula que é mais granulosa na selva que é menos eu não oro todas ministradas no tubo ea população heterogênea eu teria que a população menor granulosa e

a população maior e mais perigosa e aí olá seja muito mais para cima essas células estão meu gráfico maiores são essas células quanto mais votado do gráfico as células pa direita o maior a minha seu desculpa quanto mais locado para a direita maior a minha célula quanto mais para cima da minha célula mas granulosa minha céu mais para baixo menos eu não gosto a populações diferentes dote plantas diferentes e agora na população totalmente heterogêneo aqui de simulação aqui sejam população agora do tá corrente sanguínea peguei lá o paciente colocar uma pessoa qualquer peguei o sangue

e vou passar no sintomas essa população é saber é como se distribuir e é isso um gráfico de tamanho o grandiosidade ou ss fsc por ssc bom então gráfico ficaria assim eu tenho tamanho você e aqui eu tenho a grandiosidade que o ssc são conto mais pra cima a minha célula mas eu não gosto quanto mais para baixo nos grandiosa quanto mais para a direita maior a minha célula quanto mais à esquerda menor e minha população celular certo e quando a gente olhar um gráfico assim esse é o mesmo gráfico tá que a gente na

figura anterior só gritar é colorido tá pintado quando a gente olha um citômetro de fluxo não aparece assim colorido a gente só consegue colorir depois na hora de fazer as análises graças a gente vai colocar na cor que a gente quer então eu tenho aqui se fosse corrente sanguínea né uma amostra de corrente sanguínea e aqui embaixo sua população aqui debaixo a gente mais população de linfócitos as menores e menos danosos da população mediana são chamadas de monócitos e um pouquinho maior que o que mais granuloso que a gente fósforos e aqui essa população aqui

de cima tem os meus granulócitos tenho entendeu próprio cinófilo mastócitos são todas aquelas células maiores e mais grandiosas os nossos nos nossos e os leucócitos leucócitos são menores e menos velozes então a gente pegar o sangue de todo mundo né se as pessoas não tiverem com nenhum tipo de doença leucemia e altere a população sanguínea geralmente esse gráfico você parecido com todo mundo população de linfócitos monócitos e granulócitos lembrando que para fazer esse gráfico de fsc por ssc tamanho problema velocidade eu não tô usando fluorescente é apenas as características da própria célula no caso o

tamanho ea grandiosidade e não se eu quiser analisar o coração de tamanho e complexidades são parecidos né porém são células diferentes então aqui nesse tubo por exemplo eu tenho que as células com célula de e nesse tubo aqui tem marcelo costumam de célula t sabe se ela ter esse a voltei ela sim o mesmo tamanho a mesma complexidade interna mesmo cremosidade como é que diferencia essas células então dá para fazer isso eu não consigo diferenciar apenas elas também vão usar para são iguais com relação ao tamanho da animosidade como é que eu faria isso é

né se eu fosse pegar esse gráfico aqui ó essa população tão população de p estaria localizada nessa região aqui enquanto a população de células t serão localizadas onde nessa região aqui a senhor então se eu fizesse apenas um gráfico de tamanho pequeno velocidade tanto para beber lá até e veria que ambas as populações neste gráfico estariam no mesmo lugar eu não sabia quem é um e quem é outra né populações de tamanho e complexidade que são parecidos não podem ser diferenciados apenas pela análise de fsc por ssc e como é como estão tão então contam

a gente vai diferenciar célula um parâmetros mais específicos que o tamanho ea sua grandiosidade para isso vamos utilizar e a fluorescência na licença aqui que é o principal justamente analisar a sua de ciências e a sua essências ela geralmente estão associadas a anticorpos monoclonais então se tem lá o anticorpo anti cd3 da selva anticorpo anti cd45 da célula antes e mate um mente antes de 220 então os anticorpos monoclonais conjugados com durocromo cê tem uma infinidade deles então vou ter que ir no catálogo da uma pesquisada para saber qual é o anticorpo com qual for

o fluorocromo vou comprar para utilizar no meu experimento é comum você fazer associação a que o sorocromo aos anticorpos que são fronteiras então você tem alguma de corpo conjugado eu falei aquela no começo da aula do teste de elisa mas vamos falar de novo lembra que no teste de elisa eu uso o anticorpo monoclonal conjugado com a enzima pois bem o que eu estou fluorescence porque não é mais ele sim é um teste de fluxo o chrome esse foi cromos inicialmente se encontram em repouso eles são excitados por uma fonte luminosa que nosso caso é

o leis e tá cortado o citômetro e eles emitem uma luz de comprimento de onda que são características a cor característica 1 bom então o nosso citometros que a gente encontra no mercado é todos eles eles possuem um laser que a compra como qualquer tipo de citometria é o argônio agora porque o laser argônio que a maioria dos cromos é excitado por esse laser agora esse laser produz um a luz azul e tem um comprimento de onda de 488 nanômetros e é os outros foram cromos que não podem ser excitados pelo laser argônio eles são

excitados por outros tipos de laser então tem um blazer azul d405 nanômetros eu tenho laser helio-neonio 636 nanômetros e o laser ultravioleta de 355 nanômetros bom então dependendo do meu aparelho ele ficou que estava comparando os sintomas com carro então tem lá você tá muito mais simples esses mais simples todos terão laser argônio e aí conforme os sintomas vai tendo mais leis eles dentro dele nesse desse equipamento mais caro vai ficar do aparelho se toma ele faz mais coisas ele consegue ver uma quantidade de soro cromos maior é bom a gente entender como funciona essa

esse processo de excitação do flor o chrome então aqui eu tenho o espectro de comprimentos de onda de excitação e de emissão do fixe o fixa um sorocromo e a cor verde ele ficção a sigla né que é para o para o isotiocianato de fluoresceína e se fixe ele é excitado pelo laser argônio de 488 novas está aqui ó 488 uma vamos aqui é certa ele não falei que era azul e eu olhava essa escala aqui ó tá justamente o pico máximo aqui é a cor azul então para eu esse tal fixe ou isotiocianato de

fluoresceína eu preciso de um laser argônio então denise vai lá e esse tal fci quando o fixe fica excitado ele vai emitir uma outra um outro comprimento de onda e esse e essa bolsa é a luz bom então a emissão máxima do fixo de 525 manómetros que a justamente esse ópio fico já tava escala de verde então o que que eu tenho aqui eu tenho esses pectus conflitos de onda de excitação do fixe para ele ser citado lista de uma lista de 488 nanômetros e quando ele é citado ele vai emitir e na onda de

525 na mortes é tão sorocromo são essencialmente compostos fluorescentes que absorvem a energia luminosa em determinado comprimento de onda e emitem luz no comprimento de onda maior esses dois processos são chamados então de excitação e de emissão é mais escuro pode ser utilizado na marcação da citometria porém para eu fazer isso eu preciso conhecer as propriedades de excitação e de emissão de cada fluorocromo para poder escolher as combinações corretas que não posso escolher fluorocromos que tenho a emissão iguais uns aos outros então antes de comprar os meus anticorpos são caríssimos conjugados com fluorescência eu tenho

dar uma estudada para saber qual o tipo de anticorpo com qual fluorescência eu vou comprar para não gastar dinheiro à toa então por exemplo aqui nessa tabela eu marquei dois foram cromos que eu não posso usar junto então por exemplo tem aqui o texas red fica marcado aqui e o iodeto de propídeo ambos eles são excitados laser argônio que vai de 488 na momento certo aqui ó e quando eles emitem aí missão deles é tipo é de 600 no caso do e615 nanômetros e no caso do iodeto de propídeo é de 617 na mão metros

então vocês percebem que é muito próximo inclusive a cor que ele gera lá que e aqui é a mesma cor seu usar dois anticorpos monoclonais e cada um é tipo normal contra coisas diferentes nas população de célula mas com fluorocromos diferentes no caso texas red iodeto de propídeo porém os valores de emissão deles são iguais eu não posso usar esses das urnas como juntos concordam porque como é que eu vou saber que é um e como é que vou saber quem é o outro sendo que a emissão quando eles são excitados pelo argônio eles têm

missões que são muito próximos muito 615 e o outro de 117 nações não consigo saber a diferença então para fazer uma combinação de diferentes fluorocromos e tem que conhecer as propriedades esse sorocaba o que propriedade são essas justamente a emissão que se for o cromo tem após a sua situação pelo laser para ver se tinham aqui eu marquei três foram cromos que eu posso usar junto então por exemplo os três ó tanto fiz a fico eritrina eles pensam excitados pelo argônio de 488 nanômetros beleza só que a emissão deles são diferentes então o fixo ele

vai ter uma missão de 525 manômetro manómetros na cor verde o pe ou a fiorentina 538 manómetros na cor amarela e o psp d675 na metros na cor vermelha então são combinações que eu posso usar sim só se eu quiser fazer várias marcações a mesma amostra de célula eu posso usar vários anticorpos monoclonais com vários foram copos porém a conhecer a propriedade direção dos meus cromos após a sua excitação que seres bater em forem juntos ou muito próximos eu não consigo diferenciar quem é um e quem é o outro por isso tem que conhecer as

propriedades tanto de 14 do outro bom então para fazer um processo de imunofenotipagem por citometria de fluxo que eu vou ter vou até a presença de anticorpo monoclonal conjugado com fluorescência com sorocromo mais a selva e vou o a população celular que eu quero descobrir se tenho não aquela aquele marcador cujo qual o anticorpo parece ligar nela faço um processo de incubação né que pode variar de acordo com o protocolo meia hora 40 minutos tem que trocar quer cubação em apenas 15 minutos sempre tocar os criar tempo bastante de uma hora aí depende aí eu

faço o processo de detecção e leva essa minha mostra o aparelho veja então quais as porcentagens de células que expressam esse marcador é né mas eu não vejo marcador né o marcador eu não tô vendo que eu tô vendo tô vendo que a fluorescência então se perdendo a fluorescência isso me indica ela tem um marcador por exemplo por exemplo digamos que essa aqui sejam a célula b eu sei que toda a célula b e o marcador na sua membrana que é chamado dp220 é um marcador zinho que está ali então digamos que esse anticorpo aqui

é uma de corpo antes de 220 ou seja ele vai ligar onde em todas as células que tiverem que o p220 com marcador de célula b não liguei nos marcador que eu te colocar específico eu acho que o nosso canal quando eu pego essa célula com excesso de corpo grudado nele e o anticorpo tá com o cabo fluorescência o que vejo nas não é exatamente ob220 eu vejo a florescência do anticorpo mas eu sei que o que cê what corpo é um anticorpo anti dedo e ele tá com decência verde por exemplo que você também

na flor essência verde não anticorpo isso me diz indiretamente que aquela célula tem o que o p220 entenderam gente toma tô vendo a molécula propriamente dita que a mulher come de fluorescência nem corpo tem florescência mas o que que eu tô fazendo tô conjugando o fluorocromo ao anticorpo e como eu sei onde e se ficou por liga no nosso exemplo é o p220 então quando eu ver no no aparelho citômetro de fluxo a célula marcada da cor verde um ter nossa flor essência isso indica que a célula tem então o p220 hum hum claro tá

bom então digamos que eu tenho aqui ó um grupo de células é e essas células estão são é um grupo heterogêneo de células são todas juntas todas juntas um pouco então tem celular se saber se é você e a célula dele e eu coloquei alguns marcadores né cês tão vendo aqui que a célula a ela possui um marcador x esse azulzinho as células b possui também marcado x nas além disso ruim possui marcador y e as células se possui apenas marcador y já na célula de uma célula contém marcador nenhum e aí aqui embaixo tem

o que eu tenho os anticorpos né de corpo antes x e esse escutar conjugado com 50 étnico e essa coisinha e aqui eu tenho outra de corpo esse corpo é um corpo ante o antígeno x nectarina célula e está conjugado oficial isso tiocianato de tecido depois já sei lá 6 a ação tem esses dois anticorpos coloquei junto com essa população de célula que que vai acontecer acontecer isso aqui ó as células que possuem o seu marcador zinho ali x o anticorpo anti x conjugado com pf vai se ligar as células que possuem os dois marcadores

com essas células b por exemplo vai ligar tanto o anticorpo anti x quanto anticorpo anti y e nas células se eu só tenho y a superfície né o antígeno o episódio na verdade então o o anticorpo que vai se ligar é apenas o anticorpo anti y conjugado a pizza e a célula de ela como ela não possui nenhum desses dois marcadores não vai se ligar de coco nem provavelmente lá tem outros marcadores mas aí na hora da análise interessando um desses dois marcadores o x e y e a gente viu que eu tenho células tem

apenas 1 e selvas que tem os dois e células que não tem nenhum dos dois é bom gente é vou ficar por aqui por hoje para não me estender e aí na próxima aula a gente vai discutir como funciona melhor essas marcações um abraço