REACCIÓN EN CADENA DE POLIMERASA (PCR): Etapas, Tipos, Preparación y Aplicaciones | Bioquímica

Hola Qué tal mi nombre es José Chávez estudiante de tercer año de la carrera medicina de la universidad peruana cedia en esta oportunidad hablaremos sobre el diagnóstico molecular de enfermedades orientado a la aplicación de la reacción en cadena de la polimerasa o más conocida como pcr para esta oportunidad los objetivos son comprender los principios básicos de la pcr distinguir los tipos de pcr destacar medidas de seguridad para evitar contaminaciones en el labatorio en la pcr y explorar usos médicos y biológicos de esta misma el índice es el siguiente Qué es pcr bueno por sus siglas

en inglés significan polymerized Chain reaction o reacción en cadena de la polimerasa no de esta enzima llamada polimerasa bueno eh en términos generales esta Va a ser una técnica que va a amplificar va a replicar fragmentos específicos de moléculas de ADN ahora bien de su nombre podemos deducir que esta Va a utilizar la enzima Tac polimerasa para poder sintetizar nuevas cadenas a partir de una muestra obviamente empleando primers para que puedan estos unirse a regiones flanquean de la secuencia deseada como podemos ver aquí en la imagen se va a usar una cadena en el molde

con una secuencia de interés la cual nosotros queremos replicar también primers eh desoxinucleótidos trifosfatos también vamos a utilizar la enzima polimerasa y va a pasar por todo un ciclo que este va a repetirse para poder obtener distintas copias o amplicones de la cadena de ADN o mejor dicho de la secuencia ADN que nosotros queremos obtener Okay ahora vamos a hablar sobre la replicación hay que recordar el capítulo de replicación para poder entender Esto del pcr como nosotros y la mayoría Sabemos que esta es una etapa donde se dan la creación de copias exactas de cadenas

de ADN ahora bien Vamos a ver que aquí eh usualmente lo que pasa es que las cebras se van a separar y van a servir de moldes no para poder crear nuevas cadenas entonces aquí vamos a destacar la participación de una enzima conocida como la ADN polimerasa que está presente en células animales y junto con la utilización de primers que son los puntos de inicio vamos a ver que la ad polimerasa es responsable de esta síntesis de estas nuevas caenas de ADN ya que van a Añadir nucleótidos uno por uno a la cadena nueva no

a esta cadena creciente ad y se van a incorporar solo aquellos en donde pues veamos que sean complementarios al molde ahora bien Okay ahora vamos a hablar sobre las etapas de la pcr como podemos ver acá vamos a encontrar una un esquema general de una reacción en cadena de la polimerasa en la cual tiene tres pasos principales el de la denatura el de la hibridación y de la extensión como podemos notar aquí lo que podríamos decir los ingredientes son este las cadenas de ADN vamos a ver que los también se han fabricado primers eh tenemos

la enzima Tac polimerasa y los nucleótidos que van a ser usado como como bloques de construcción no de las futuras cadenas Bueno vamos a hablar ahora de la del primer paso de la den naturación en este caso tenemos que e el an lo que va a hacer es calentarse a una alta temperatura eh más o menos a los 94 o 98 gr entre ese Rango aquí por ejemplo en la imagen vemos que está a unos 95 gr está dentro de la temperatura óptima de esta etapa y lo que va a pasar aquí producto de estas

altas temperaturas es que se van a romper los puentes de hidrógeno y se van a separar las dos hebras que van a actuar en las siguientes etapas como plantillas para las siguientes copias no que van que van a realizarse ahora bien la siguiente etapa es la de la hibridación en la hibridación vamos a ver que la temperatura va a disminuir las cebras se van a tener que enfriar en unas en temperaturas Como por ejemplo entre 42 o 78 grc para permitir que pues los primers se puedan unir de manera específica a las regiones franque anes

de las secuencias que nosotros deseamos obtener en este caso en la imagen podemos ver que está a unos 55 gr lo cual es óptimo y un dato extra en esta etapa es el de la temperatura de fusión de los Prime estas pues se utilizan para poder calcular la la temperatura óptima de hibridación entonces eh la temperatura de fusión de los primers se puede hallar con una pequeña fórmula la cual es la siguiente eh nosotros vamos a sumar las la cantidad de bases de adeninas y timinas y multiplicarlas por dos y a estas vamos a vamos

a sumarles eh la suma de las citosinas y guaninas multiplicadas por cuatro así obtenemos la temperatura de fusión de de la secuencia de los primers y podemos así también este calcular la temperatura óptima de hibridación en la siguiente etapa que es el de la extensión que es la última etapa eh va a ser resaltante el papel de la Tac polimerasa porque esta lo que va a hacer es utilizar las hebras molde y también los primers que habíamos obtenido en la etapa anterior para poder sintetizar las nuevas nuevas hebras de ADN este proceso Generalmente ocurre a

una temperatura determinada alrededor de los 72 gr para qué Para poder obtener una actividad enzimática de manera óptima si ya nos vamos a la parte siguiente vamos a notar que pues este ciclo se va a revertir múltiples veces hasta alcanzar una cantidad significativa de amplicones podemos ver acá que el primer ciclo va a utilizar las dos primeras cadenas de las secuencias de an muestras que tenemos en el laboratorio se van a obtener cuatro copias contando las iniciales si pasamos a un segundo ciclo se van a utilizar tanto las antiguas copias como las nuevas copias para

obtener nuevas copias más y así lamos hasta un tercer ciclo y así hasta más o menos 20 o 30 ciclos vamos a obtener millones de copias las cuales van a servir para ciertas aplicaciones que vamos a ver más adelante Okay ahora vamos a hablar sobre los tipos de pcr el primero sería el pcr convencional el cual tiene el mismo procedimiento que hemos estado viendo el de las tres etapas Esta es una técnica como ya sabemos que va a amplificar segmentos específicos de ADN en un determinado laboratorio se emplea principalmente para la detección cualitativa de la

presencia o ausencia de secuencias específicas acá tenemos una imagen didáctica en la cual nos presentan una secuencia ad en una escena de crimen no también podemos ver ciertos marcadores que nos van a indicar a A qué ADN se parecen estas secuencias de ADN pueden ser de determinadas proteínas pero acá nos dan la cantidad de paredes de bases que pues que presentan estas y también tenemos la an de los sospechosos no de los que queremos ver a cuáles se parecen Y a cuáles no en este caso por ejemplo tanto los sospechosos dos y tres tienen o

sea presentan la secuencia del an que está en la esema del crimen pero en el caso del sospechoso número uno no presenta esta secuencia de de la Por lo cual podríamos decir que pues ha salido negativo a la prueba y en los otros dos sospechosos el dos y el tres han salido de manera positiva Entonces el pcr convencional nos determina si es que hay o no hay determinadas secuencias específicas en este las muestras que nos podemos encontrar el siguiente tipo de pcr es el pcr en tiempo real pcr cuantitativo o También conocido como qpcr acá

vamos a ver que pues este va a permitir la cuantificación precisa de la cantidad inicial de de a y nos va a brindar información cuantitativa sobre lo que es la carga inicial del material genético ahora bien eh A diferencia del anterior pcr que es el convencional que es el cualitativo aquí lo que lo que queremos ver es Cuánto de material genético Hay No si es que hay o no hay ya sabemos que hay y lo queremos saber es cuánto de esto hay para lo cual lo que nosotros usamos es una de las tres fases en

las cuales se da este pcr el pcr usualmente se da en tres fases una fase inicial exponencial y estacionaria en la fase exponencial eh usualmente el pcr empieza a amplificarse de a pocos pero llega una fase que es la fase estacionaria en la cual ya la amplificación no es tanto y ya se va a formar una vz y bueno Ahí es donde ya obtenemos la mayor cantidad de copias del del pcr para aclarar eh la pcr cualitativa se usa en esta fase en la fase estacionaria donde tenemos la mayor mayor cantidad de copias para poder

este determinar la presencia o ausencia del material genético pero en el caso de la fase exponencial como ya se va multiplicando y se va dando los primeros ciclos de la pcr nosotros podemos determinar la cantidad ya que estos ciclos van a ser múltiplos de la cantidad de material genético que tenemos en un comienzo y así podemos eh obtener la cantidad que nosotros queremos o que estamos buscando no Okay luego tenemos lo que es el Q pcr RT que es este el pcr cuantitativo pero utilizando también lo que es este la retrotranscriptasa es decir estamos juntando

dos técnicas moleculares como la de la reacción en cadena polimerasa y la retrotranscriptasa para poder cuantificar la expresión génica midiendo obviamente la cantidad de una molécula como como lo es el rn mensajero este vamos a ver que pues lo que va a hacer es convertir el ARN en una cadena complementaria de ADN y luego se va a cuantificar la la cantidad justamente de este ADN complementario gracias al pcr en tiempo real este procedimiento se pueden realizar de diferentes maneras en un solo paso o en dos pasos si es un solo paso Vamos a agregar todo

de frente vamos a agregar la secuencia de primers el rn mensajero la retrotranscriptasa la t polimerasa el buffer y los nucleótidos de frente todo y ya nos va a salir pero también podemos hacerlo en dos pasos primero lo que vamos a hacer es obtener una cadena complementaria sea simplemente llenamos con este determinados frers la secuencia espica estos ciertos nucleótidos y eh también lo que vendrían ser los nucleótidos lo que queremos hacer es obtener gracias a la enzima retrotranscriptasa hacer que el rn mensajero vuelva a su composición de an en eh En lo que vendría ser

el procedimiento inverso de una transcripción y obtener así una cadena complementaria de ADN luego esta cadena complementaria de ADN va a pasar por lo que hemos visto en el anterior tipo de de pcr se va a dar este este procedimiento del pcr y vamos a determinar en la fase eh determinada lo que es este la cantidad de pcr y así eh hayer cuánto ARN mensajero había en esa muestra el siguiente tipo es el del pcr multiplex en el cual lo que vamos a encontrar es una amplificación simultánea de múltiples secuencias de ADN en una sola

reacción nosotros podemos tener en una muestra o un paciente que tiene determinadas o al mejor está infectado con múltiples bacterias y nosotros podemos determinar con solamente una reacción si es que en ese en ese ese paciente están presente su material genético No necesitamos entonces hacer distintas pruebas para poder este terminar determinando si es que hay distinta variedad de an por ejemplo acá en la imagen podemos ver hasta cuatro variantes de an para lo cual cada uno tiene su propios sus propios primers y al final Al momento de ir a una electroforesis vemos que los marcadores

también nos van a botar distintos productos en este caso cuatro productos distintos Okay ahora lo que vamos a ver es Cómo preparar una reacción de pcr bueno acá los componentes que vamos a utilizar o por así decir los ingredientes que vamos a utilizar son los siguientes primero hay que ver en qué medio se va a realizar esta reacción no En qué lugar por así decir se va a realizar esta reacción y para esto tenemos al buffer de reacción 10x el cual lo que hace es proporcionar condiciones óptimas para que la enzima en este caso la

atac polimerasa pueda llevar una actividad de manera óptima y adecuada esto Gracias a que este buffer va a contener sales que mantienen una fuerza iónica y un pH adecuado para su amplificación eficiente bueno el siguiente ingrediente por así decir es el cloruro de magnesio aquí lo que nos va a importar es el y magnesio el cual es esencial para poder estabilizar a los nucleótidos también que son pues necesarios para la síntesis del an por la t poim NASA va a influir en lo que es la estabilidad de la unión entre cebadores y la plantilla de

ADN y va a estabilizar la estructura de la doble de ADN y va a facilitar su desnaturalización de las hebras durante la denatura que es una etapa de la de la pcr como hemos visto en anteriores diapositivas si prestamos atención a la imagen vemos que el y magnesio va a trabajar como un cofactor importante de la enzima tac polimer es decir si es que no la tenemos en una suficiente cantidad no se va a llevar a cabo la amplificación del material genético queremos que queremos obtener además esta Va a incrementar la temperatura de fusión de

por ejemplo como eh los primers estos primers eh como habíamos visto en la parte a la izquierda están influidos gracias a este cloruro de de magnesio en su estabilidad tanto los primers como el an se unen de manera eficiente gracias a este cloruro de magnesio gracias al y magnesio como tal por lo que eh su Unión va a estar incrementada o mejorada no nos vamos a la parte de abajo de la imagen vamos a ver que si la tenemos en una menor cantidad este cloruro de magnesio vamos a tener que el efecto de amplificación va

a ser muy muy poco y esto porque justo lo había mencionado es una es un cofactor importante del Attack polimeras Y si no hay No va a haber amplificación Pero qué pasa si yo tenga una excesiva cantidad si bien va a actuar como cofactor de la Tac polimerasa Esto va a aumentar un incremento de uniones no específicas como ya le había mencionado Esto hace que los primers se unan de manera estable a las secuencias de an pero si lo tengo en una menor cantidad Incluso se van a unir y van a estar estables en secuencias

no específicas en secuencias que yo no quiero replicar que yo no quiero obtener amplicones entonces tener demasiado tampoco es que sea mejor entonces para esto hay que obtener una óptima cantidad de este clorudo de Magnesio y se puede llevar a cabo la pcr de manera adecuada luego Tenemos aquí los nucleótidos que son los bloques de construcción estos van a representar a cada uno de los cuatro nucleótidos presentes en el ADN quepes se dan durante el proceso de replicación no es por eso que hayy que tener en cuenta el proceso de replicación para poder imitarlo y

así obtener cada uno de los ingredientes que se utilizan o los componentes que se utilizan Durante la etapa de replicación luego tenemos el ADN molde o blanco que es a partir de donde se van a obtener las nuevas secuencias de ADN los primers que son secuencias cortas de ADN de 18 24 pares de bases que son diseñadas e en un laboratorio para poder unirse de manera complementaria a regiones específicas y finalmente la Tac polibras la cual es una enzima que es resistente al calor y bueno es pertenece a lo que es la bacteria termus acuáticos

esta pues durante la extensión de la pcr va a sintetizar nuevas cadenas de ad complementarias es como que un análogo a la ad polimerasa de nuestras células un dato importante a tener en cuenta es la es que no posee una actividad significativa de corrección de pruebas es decir es No prof freed quiere decir que por ejemplo si es que la atag polimerasa Al momento de estar uniendo nucleótidos para poder sintetizar la cadena complementaria y se equivoca en una base no se va a dar cuenta y no lo va a corregir es decir Tiene un gran

Rango de de error pero eh usualmente la secuencias que nosotros queremos replicar son pocas y por así decir este las las pares de bases que nosotros queremos replicar en una pcr Pues nos alcanzan no O sea la cantidad de de errores que usualmente tiene Pues sí sí sí son sí se pueden alcanzar a a permitir Okay vamos ahora con la parte de bioseguridad para el procedimiento de lo que es el pcr tenemos Generalmente tres áreas También acá se ha considerado en esta imagen una cuarta área que es la área de detección de resultados Pero principalmente

son tres áreas eh la primera es la de preparación de los reactivos es decir donde yo voy a eh juntar todos mis ingredientes mis componentes para poder realizar la reacción voy a extraer el ácido nucleico de una muesta viene por ejemplo en los laboratorios vienen muestras de esputos donde yo quiero determinar eh si hay presencia de determinadas bacterias entonces lo que hago es extraer el ácido nucleico eh gracias a procesos de por ejemplo de centrifugación Y obtener estas muestras purificarlos y así ya tener todo listo no alistar todo lo que es este el material genético

de manera purificada para poder pasar a la siguiente área en la siguiente área que obiamente está separada no Están juntas están por así decir divididas entre paredes vamos a ver que aquí lo que se es una preparación de reactivos de la pcr esta sigue siendo una fase pre pcr acá yo lo que hao es preparar ya mis mis buffer tener todo listo el el el clorudo de magnesio mis primers las los nucleótidos y todo lo demás en la fase o en el área 3 Perdón ya se va a dar el proceso de amplificación y detección

aquí es donde ya mezclo todos los ingredientes que tenía toditos los pongo en un tubo de ensayo y ya eh una vez listo pues lo que hago es llevarle a un termociclador que lo que va a hacer es colocarla a distintas temperaturas como hemos visto en las etapas del P que lo que hacen es primero es tener altas temperaturas entre 92 y 95 gr bajar a 70 luego subirlas otra vez y esto pues va a ocasionar que se den estos ciclos de pcr y ya posterior a esto vamos a utilizar lo que es la electroforesis

en la parte de detección de resultados para poder visualizar estos productos de amplificación no esto ya es post pcr ya luego de que se haya dado el ciclo del de lo que es este de la en cadena de polimerasa bueno y bueno como última parte de esta clase son lo de las aplicaciones acá tenemos un pequeño esquema donde vamos a ver que la pcr sirve para ciertos estudios de evolución investigación forencia aislamiento de genes diagnóstico de infecciones diagnóstico de enfermedades hereditarias y cáncer estudios de identidad y filiación también por ejemplo puede servir para lo que

son este detección temprana de ciertas cantidades mínimas en pacientes asintomáticos un monitoreo y evaluación de terapia mediante la disminución de carga viral pronóstico de recaída en enfermedades identificación de cpas resistentes a antibióticos detección temprana de patógenos en pacientes transplantados detección de enfermedades genéticas e incluso este la búsqueda de compatibilidad end donantes de órganos esto lo último que he mencionado es más aplicaciones médicas y bueno vamos a acá hemos presentado dos preguntas tenemos dos preguntas Esta es la primera pueden quizás pausar el video para poder resolverla y bueno acá nos menciona señal el conjunto de componentes

necesarios para una reacción de pcr y bueno que la clave sería la de tenemos por ejemplo en el caso de un de un rtq pcr presentamos lo que es una cadena de complementaria El buffer de reacción que es importante para que la actividad del atera se adecuada Los primers que son el punto de inicio e la enzima la Tac polimerasa los nucleótidos y este cloro de Magnesio el cual es un componente demasiado importante como como hemos podido ver la pregunta número dos marca la respuesta correcta sobre el enzima tag dna polimerasa también pueden pausar el

video para poder resolverla y bueno acá la alternativa correcta sería la a no tiene actividad exonucleasa de 3 prima 5 prima detectable prof fring como les había mencionado eh esta no tiene esa capacidad de poder corregir si es que se equivoca Al momento de colocar un nucleótido en el caso de la B cataliza la síntesis de ADN en orientación 3 prima 5 prima como Nosotros sabemos la replicación siempre se da de 5 prima a 3 Prima fue aislada del microorganismo termocrisa termus aquaticus y es igal para pcr es convencional que que generan amplicones de 10

K o más no en realidad es menor a 10 kob como ya les había mencionado eh la tacasa suele tener ciertos errores Por lo cual no nos conviene replicar este secuencias de an que sean muy extensas sino que sean cortas producto de esta de este defecto que por así decir tiene eh la Tac polimerasa pero que no es tan evidente en secuencias pequeñas Bueno Este es mi bibliografía que he utilizado por poder realizar esta clase y muchas [Música] gracias