Aula11 ACH5542 - Enzimas - Parte 2

a 5542 bioquímica 1 essa aula foi preparada com o livro Princípios de bioquímica de lenninger sexta edição capítulo 6 enzimas nessa aula será abordado majoritariamente o ponto 6.3 a cinética enzimática como abordagem a compreensão do mecanismo o mecanismo da catálise enzimática o ponto 6.4 será estudado nas atividades e exercícios e as enzimas ratórias não serão estudados nesta disciplina mas em a554 t bioquímica 2 e isso será feito de forma exaustiva bom Eu imagino que você se lembra o que é essa equação esta equação esse teta ele representa o número de sítios onde eu tenho ligante

associado a um dado receptor ó dado proteína então o número de sítios ocupados dividido pelo número de sítios Total Ou seja a fração de sítios ocupados nessa curva aqui que é uma curva clássica de interação ligante receptor ou ligante proteína você vê que existe uma concentração de ligante que é conhecida pelo nome de cade que é quando você possui 50% desses sítios ocupados isso foi estudado na aula de função proteica questão Um interação reversível com o ligante dois Esse é um exercício que tá no final do capítulo de de função proteica do Lening então toda

aula a gente faz alguma revisão de algum exercício de aula anterior três receptores proteicos de membrana se ligam firmemente a um hormônio com base nos dados da tabela abaixo a qual é a Cadê a constante de dissociação para ligação do hormônio pela proteína do proteína do tá aqui que tá o teta dela e que é a concentração né com isso eu conseguiria fazer aqueles gráficos lá aquelas hipérboles inclusive unidades adequadas então é óbvio a unidade do CD A gente sabe que é unidade de concentração aqui no caso nanomol B qual dessas proteínas se liga mais

firmemente ao seu hormônio bom retornando à figura kad é a concentração de ligante para 50% dos sítios ligados para um teta de 50% então para você determinar o kade da proteína 2 basta você procurar o teta de 50% e automaticamente Você tem o KD 0,5 [Música] nanomolar agora qual dessas proteínas se liga mais frentee hormônio proteína 1 2 3 você precisa fazer um estudo comparativo delas Esse estudo comparativo será do KD então então pra proteína 2 o KD 0,5 nanomolar pra proteína 3 A 50% do teta o KD é 1 nanomolar pra proteína 1 a

50% de teta o KD é 4 nanomolar então se o KD é a concentração para você ter 50% dos sítios ligados é evidente que a proteína 2 ela se liga mais firmemente a seu hormônio né porque eu preciso de uma quantidade muito menor de hormônio para que ocupe 50% dos sítios falando em comparações na aula anterior estudou-se a os aspectos fundamentais das enzimas né eu posso trazer uma parte desses aspect nesta comparação aqui entre hidratação espontânea e catalisada de gás carbônico Então você sabe muito bem o que é essa reação porque talvez tenha visto no

cursinho gás carbônico gasoso ele na presença de água eles têm equilíbrio formando ácido carbônico e o ácido carbônico ele pode ser decomposto em CO2 e água então gás carbônico pode virar o ácido carbônico um ácido diprótico né em Água hidratação espontânea Ou seja eu pego um copo d'água e e deixo ele ao ar aí e ver o que acontece né a hidratação espontânea do CO2 que segue essa equação aqui que não é catalisado por nada ela tem uma constante cinética de 0,15 seg a-1 bom isso é equivalente a dizer 0,15 moléculas em 1 segundo 60

segundos corresponde a 1 minuto Então significa que nove moléculas por minuto de CO2 são dissolvidas na água e formam ácido carbônico acoso agora Como que é isso se eu catalisar o catalizador que faz a hidratação do CO2 em água é a anidrase carbônica é um enzima que nós temos em nossas hemácias a anidrase carbônica tem uma constante de velocidade 10 a-6 segundo a men1 isso significa 1 milhão 10 A6 moléculas 1 segundo 60 Segundos é um minuto 60 milhões de moléculas por minuto então você vê que a enzima ela torna a velocidade da reação muito

mais rápida que isso foi uma coisa que eh na aula anterior Ficou bem claro a outra coisa que ficou bem claro é que tem toda aquela coisa da associação formação no estado de transição e como eu me refiro a interações fracas que levam a formação necessária de transição eu tenho com isso a grande especificidade enzimática né então cada enzima vai reagir melhor com um com substrato específico isso inclusive permite que eu tenha reações estéreo específicas né para produzir isômeros específicos uma grande preocupação dos cientistas no século passado no começo do século passado foi tentar criar

uma equação matemática que permi estudar reações dessa forma porque se eu pudesse fazer isso eu saía desse âmbito eu entenderia melhor doos parâmetros enzimas e poderia comparar elas em relação às suas eficiências de catálise bom mas o que que se sabia logo no começo do século passado que se sabia que os equilíbrios desenvolvidos na cinética enzimática eram esses daqui e é a enzima sess é substrato enzima e substrato elas formam um complexo chamado es simplesmente associei que aquela primeira ligaçãozinha lá sem chegar no estado transição eu tenho a formação do es Mas é óbvio que

isso não é um complexo eh necessariamente muito estável eh isso vai depender muito da concentração de S por razões que veremos a seguir e eu posso ter eh pra formação disso daqui uma constante de velocidade k1 mas concorrentemente eu tenho uma reação inversa com constante de velocidade k - 1 o complexo es ele pode ser dissociado ou seja assim que chega no estado de transição eu converto substrato em produto e eu tenho enzima mais produto e isso daí é está associado a uma constante de velocidade K2 Mas eu posso ter um momento antes da Separação

da enzima do seu produto eu posso ter o caminho inverso Claro porque a enzima ela ela simplesmente faz com que o equilíbrio seja alcançado mais rápido mas ela não muda a direção do equilíbrio certo o que muda vai ser isso né vai ser a concentração do substrat então eu posso de enzima em produto retornar com a constante cinética k-2 para formar esse complexo daqui então esses são os equilíbrios envolvidos na cinética enzimática bom a partir desses equilíbrios e dessas constantes que poderiam ser medidas era necessário obter uma equação geral que permitisse estudar as enzimas e

o que se fez na época foi utilizar as a lei da ação das massas que foi enunciada por Kato maximilian Goldberg e Peta vog eh eles são foram né pesquisadores noruegueses né então a gente fala gber vage né mas é vog eh e eh foram eles que encontraram essa relação aqui a velocidade de uma reação química é igual a constante vezes o produto dos reagentes então se eu tenho essa relação eu posso aplicá-la em todas essas equações aqui então aqui eh não significa simplesmente que eles são bons colegas de trabalho mas em particular vog era

o genh Goldberg bom tá aí esse era um problema na época muito difícil mas vamos usar a lei Goldberg vog para observar se daí é possível tirar alguma equação geral então aplicando a lei de gber vog a velocidade da reação 1 ela vai ser a constante k1 concentração dos reagentes né E1 e e s a velocidade inversa vai ser uma constante men1 concentração reagente complexo s a velocidade 2 vai ser es x K2 e a velocidade -2 vai ser a concentração de enzima concentração de produto vezes a constante velocidade men2 se você se aventurar resolver

isso você não conseguirá porque se trata de um sistema de quatro equações a sete incógnitas Então você tem aqui ó 1 2 3 4 5 6 e 7 então sete variáveis e quatro equações você não sabe quanto tem de enzima quanto tem de produto quanto tem de GS e quais são essas velocidades embora com a cação de substrato você sai porque você que adiciona lá né e o Car já é determinado então não dava para resolver isso de forma tão fácil até que dois pesquisadores resolveram o problema Leonor meles e modo leor meles era um

professor na universidade de Chicago e mod mter era uma canadense que tentou se doutorar lá em seu país mas eh o mundo era muito eh Enfim no Canadá era proibido a mulher ter acesso ao título de Doutor então não existia programas de doutorado que aceitassem mulheres mas nos Estados Unidos sim então ela foi paraos Estados Unidos em Chicago ela conheceu o Dr leena meles e eles começaram a trabalhar no laboratório e chegaram a essa equação que eh é utilizada até hoje é uma equação universal de cinética enzimática Eu recomendo a todos vocês que estudem um

pouco a biografia de mod ming eh é uma cientista eh incomparável né uma verdadeira heroína bom tá aqui aquela equação que é um problema muito difícil como foi que Micael mentem resolveram Eles já conheciam aquelas equações que eu apresentei usando Eh a lei da dação das massas de Goldberg vog Então o que eles fizeram é o seguinte vamos estudar a cinética da enzima nos tempos iniciais de reação Ou seja no começo da reação nos primeiros segundos em que reação ocorre nessas condições essa velocidade aqui a velocidade de retorno de enzima em produto você imagina que

seja muito baixa por quê se você calcular o limite dessa equação aqui de k - 2 concentração de ep quando o p tende a zero que no começo da reação você tem pouca formação de produto isso tudo tende a zero Então essa velocidade não existe esse equilíbrio ele ele pode ser desconsiderado logo v - 2 é 0 e eu posso né reescrever equação mas veja bem isso só é possível porque eu considerei duas coisas aí tem tempos iniciais de reação e que a quantidade de substrato é muito alta substrato tem que estar em excesso Veja

isso daqui Isso aqui é uma curva em que mostra a concentração dos reagentes com o tempo para uma reação enzimática aqui é o zero e aqui a concentração inicial do substrato você vê que tem um corte aqui ou seja is é muito maior do que o que tá mostrando no desenho Então você está bem lá em cima no início eu tenho muito s e pouquíssimo p que é o verde né Mesmo que eu pegue um tempo eh curto sei lá 20 segundos eu tenho pouco P em relação a s então p é despresível e v

- 2 é muito baixo Essa foi a consideração deles né OK então dá para simplificar v - 2 é irrelevante é zero tirei então agora só tenho V2 eu não tenho v - 2 Esse foi o primeiro passo para resolver o problema bom eh depois disso eles observaram uma coisa interessante vamos calcular a velocidade de Formação desse complexo es eu não sei quanto tem de es Mas eu posso calcular a velocidade de Formação dele a velocidade de formação de es ela é k1 es S né que é essa velocidade aqui aplicou a lei de gber

vog e a velocidade de quebra de S Observe que S pode ser quebrar de duas formas ou ele retorna para e + s ou ele é convertido em produto então a velocidade de quebro vai ser V - 1 que é essa daqui concentração de s x k - 1 ou V2 K2 é s que é exatamente essa velocidade dessa reação aqui então eu tenho duas reações então se eu quero saber qual é a velocidade de quebra de es ela é uma soma de duas velocidades que contribuem para essa quebra então eu posso somar v-1 com

-2 então isso aqui vai ser k - 1 es K2 S eu posso fatorar em ES k - 1 mais K2 concentração de S então v-1 mais V2 é isso daqui k-1 + K2 S eu tenho velocidade de formação de S eu tenho a velocidade de quebra de S Por que eles determinaram essas velocidades porque o seguinte eles supuseram que no início início da reação nos primeiros segundos da reação nos primeiros minutos da reação a concentração de S ela não muda ela é constante isso tá aqui na sua curva então eu vou saturar algum sítio

certo vou ter um valor de teta ali também eu posso tratar enzima como né uma proteína que tá ligando em alguma coisa eu vou ter um valor de teta e esse teta não vai mudar com o tempo ele é fixo então vou ter um um número de de moléculas ligadas que não vai se alterar por muito tempo até o fim da reação E aí Enquanto isso o que que ocorre no substrato vai caindo aí ele termina aqui o meu S ele vai ser constante por um bom período até que ele se reduz eh e a

minha concentração de produto ela vai subindo até o seu final ó óbvio que para fazer essa consideração que é conhecida como estado estacionário é necessário lembrar que o substrato está em excesso eu tenho que ter muito substrato em relação ao produto para ter esse efeito isso só é possível porque todos os sítios que eu consegui estão saturados estão naquele teta que não vai variar Ok então estabelece o que a gente chama de Equilíbrio estacionário a velocidade de que igual velocid de Formação eu posso igualar essas coisas né essa velocidade de quebra k1 ES e essa

velocidade de desculpa de Formação essa velocidade de quebra k -1 + K2 vs substrato em excesso isso não pode esquecer eu só posso igualar por causa disso então logo a velocidade de Formação será igual a velocidade de quebra v1 = v-1 + V2 ou seja a equação 1 vai ser igual a equação 2 + 3 que é essa soma que eu fiz aqui né que é a mesma coisa que equação 4 tá aqui k1 es = k-1 + K2 e s equação 5 Isso é o que a gente tem k1 es s = k -1

+ K2 es S bom Aqui tem várias coisas que a gente não sabe eu não sei quanto tem de S não sei quanto tem de e s eu sei que eu coloco e cas são constantes né então observando que os cas são constantes eu posso arranjar a equação dessa forma isola as constantes todas de um lado então isso é fácil né passo S dividindo para lá e o k1 dividindo para cá e eu tenho isso daqui esse quociente de k -1 + K2 sobre k1 agora ele batizado de constantes de meles menten km km então

k - 1 + K2 que são as velocidades relacionadas à quebra do complexo DS dividido pela velocidade relacionada à formação do complexo es então agora só substituo naquela equação se nessa equação seis Aqui eu tiro tudo isso daqui e ponho só km ficou assim aí é claro que ele rearranjo um pouco mais aqui né Eh enfim ele deixou o km aqui eh e aí o o o que ele fez foi eh passar o ES para cima do km né então km tá embaixo e eh então ele pegou esse s no denominador jogou lá para cima

ele ficou no numerador aqui esse aqui desculpa e e ficou em cima do km então e isolou a concentração Es Por que ele fez isso porque essa é uma concentração que eu não consigo determinar eu não tenho acesso a isso claro hoje com alguns métodos de de biofísica é possível mas eh chegar próximo desse valor mas eu não sei então isolo isso né isso isso aqui eu também não sei mas eu consigo chegar nesse valor mas esse aqui é muito mais difícil Então deixei isso como uma variável a minha incógnita do lado de lá então

agora desenvolvendo essa equação e concentração de e é a concentração total de enzima livre em um dado tempo da reação Então o que significa isso que eu tenho enzimas formando complexo que é o tal do concentração de S né complexo enzimas substrato eu tenho o e que é o que não está ligado em nenhum substrato e a soma de e com es concentração de e mais concentração de S é o concentração de enzima Total então eu tenho essa equação nove aqui enzima Total Concentração da enzima total é a concentração da enzima livre mais a concentração

da enzima ligada isolando-se concentração de e olha aqui ó conação de e está aqui certo eu vou isolar e aqui então você obtém que e igual enzima Total menos es E aí substituindo 10 em 8 10 é esta equação 8 é esta equação concentração de es vai ser igual no lugar de e eu vou colocar ET - es tá aqui ó concentração de e Total menos concentração de e s multiplicado pela concentração do substrato então ficou desta forma Por que que isso é muito melhor que essa equação eu não sei quem é esse Eu não

sei quem é esse mas agora a única coisa que eu não sei da equação resultante é es porque enzima Total eu sei sou eu que adiciono enzima no tubo isso tá tabelado E isso daqui é eu que adiciono no tubo também só tenho uma variável agora agora sim eu tenho uma equação e uma única variável essa equação tem solução então desenvolvendo essa equação só multiplicar lá a concentração de S pelos outros parâmetros Então você vai ter concentração de S km E então só multipliquei com a m para lá né E vai ser igual concentração de

ET Men es aqui tá faltando um parênteses e então o o que se tem aqui é concentração de skm vai ser concentração de ET vezes concentração de S menos concentração de S xz s é só multiplicar isso daqui né a distributiva desse lado de cá eu preciso isolar o es de um único lado né então tudo que é s Eu passo pro lado de lá então esse daqui vai para lá então ficou ES km es concentração de S e o ET vezes concentração de S vou faturar em ES então ficou km mais concentração de s

e passo isso aqui pro lado de lá agora para isolar concentração de es então concentração de es é igual a concentração de enzima Total eu sei o que é concentração de S também km concentração de S tudo isso daqui Eu determino eu sei controlo mas isso eu ainda não sei e não é isso que eu quero eu eu gostaria de medir a velocidade da reação e não uma concentração Então como será que eu estou tão pró deve est faltando alguma coisa Então olha essa equação Então essa equação aqui ela mostra que a reação n imaginando

que não volte ela ocorre em duas etapas a etapa em que tem k1 v1 e etapa de K2 V2 v0 que é a velocidade inicial K2 de S você consegue ter alguma suposição a respeito disso talvez você se lembre do cursinho de algum lugar que você leu Talvez o lenninger que a velocidade de uma reação é a velocidade da Etapa mais lenta certo é sempre a velocidade de etapa mais lenta então ligar é muito fácil mas converter atingir o estado de transição e converter e separar para formar isso daqui é bem mais lento essa etapa

mais lenta então se eu meço alguma velocidade a a velocidade começa disso daqui desse evento K2 es então eu posso isolar o es que é a minha grande variável aqui e eu tenho de brinde uma velocidade então concentração de es = v0 dividido por K2 substituindo 14 que é essa equação em 12 que é essa então vou substituir Es Por isso daqui né TSE v0 so K2 igual a enzima Total concentração de S m + s está quase lá então para isolar a velocidade inicial esse v0 significa velocidade inicial né nos primeiros minutos primeiros segundos

então isola v0 pronto K2 enzima Total concentração de S eu poderia parar aqui mas daí vem um parâmetro muito útil basta você entender que eu tenho uma reação enzimática certo es significa que uma parte é um equilíbrio uma parte da enzima está ligada a outra parte não está ligada mas e se toda enzima tivesse ligada toda enzima é o ET enzima Total se toda enzima tivesse ligada então a velocidade que eu mediria em K2 é a velocidade máxima que é possível ser atingida então V máximo é K2 vezes concentração de enzima Total substituindo sete que

é esta equação em 16 que é esta equação tem-se a equação de Micael menten a velocidade inicial de um enzima ela é a sua velocidade máxima vezes a concentração do substrato dividido pelo km constante de Micael menten mais a concentração do substrato e a partir disso daí conseguiu-se fazer a análise de números enzimas e permitiu fazer a análise comparativa dessas zas Esta é a representação de uma curva saturação de reação enzimática como é feito isso você tem vários tubos de ensaio em cada tubo coloca-se a mesma concentração de enzima e diferentes concentrações substrato em cada

tubo então sei lá 10 tubos concentração de enzima Total a mesma nos 10 tubos concentração do substrato ascendente nos 10 tubos então 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 e aí eu meço a velocidade inicial da reação e o que você vê é que forma-se uma hipérbole ela é muito parecida com aquela curva do teta Que nós conhecemos né E tem três pontos interessantes aqui o primeiro ponto é esse ponto assintótico eu não consigo chegar aqui no que nós chamamos de velocidade máxima eu tenho a saturação né eu eu saturei a enzima

com substrato não vai mais além disso eu consigo ter um aumentos muito pequenos nessa região é muito difícil determinar velocidade de uma coisa quando é uma assíntota você tem vários métodos matemáticos né mais complicados n a gente vai ver que o método mais simples é o que mais utilizado Ah aí você tem aqui um ponto interessante quando a velocidade máxima é metade a velocidade da da reação desculpa é metade da massa a concentração desse substrato que eu tenho corresponde a km Então o que é km km é uma concentração igualzinho que a gente vi com

KD km é a concentração de substrato para que eu tenha 50% da velocidade máxima Esse é km E aí fora do km eu tenho velocidades que são bem menores que a velocidade máxima questão do estimativa da velocidade máxima e do km por inspeção embora haja disponibilidade de métodos gráficos para determinação precisa da V máximo e do km de uma reação catalisada por enzimas algumas vezes essas grandezas podem ser rapidamente estimadas pelo exame dos valores de v0 aumentando a concentração de S estime os valores de v Má e Km da reação catalisada por enzima na qual

foram obtidos os seguintes dados bom para estimar é só voltar aqui e ver que quando velocidade é 50% da máxima eu tenho km então voltando lá aqui são os dados que eu tenho essas são as concentrações de substrato E essas são as velocidades a minha velocidade máxima é 140 metade de 140 é 70 logo o km é 1 x 10-5 então eu não preciso nem desenhar a curva eu posso estimar isso isso é muito útil quando você tá no laboratório está fazendo um experimento Você quer uma resposta rápida sem ir pro Excel você usa raciocínio

simples bom essa equação como você viu ela é equação de uma hipérbole e nem sempre é trivial determinar valores para uma equação de hipérbole se pudesse ser linearizado Seria muito bom então lá no werberg eles fizeram o seguinte inicialmente eles Aram e inverteram as frações de ambos os lados isso é conhecido como duplo recíproco então invertendo as frações dos dois lados V z0 vai ficar 1 sobre v0 e v máximo concentração de S km mais concentração de S vai virar o contrário né km concentração de s em cima mass concentração de s em cima e

v m vezes concentração de S emb baixo e eu posso desenvolver isso mais ainda porque e isso é a mesma coisa que eu escrever km dividido por V máximo mais con de S mais concentração de S dividido por V máximo concentração de S só que como eu vou fazer concentração de S dividido por V máximo concentração de S eu posso cortar s com s vai ficar 1 sobre V máximo que é isso aqui ó Isso produz uma equação de reta 1 sobre v0 igual km dividido por V máximo concentração de S E aqui é só

1 sobre V máximo porque quando ficar concentração de S sobre V má vezes concentração de S corta isso daqui e isso é equivalente a isso o o y é 1 sobre v0 o a é km sobre V máximo e o X é um sobre concentração de S que é variável né e o B que é uma constante é um sobre V máximo isso era a curva que você tinha uma hipérbole e você não quer trabalhar com assíntotas isso é muito mais difícil eu poderia achar o km se eu conseguisse determinar V máo mas assim é

muito difícil então você lineariza quando você pega esses pontos então você vai plotar agora 1 sobre s e aqui 1 sobre v0 forma-se uma reta essa reta ela sempre vai aparecer desta forma para um experimento seu como que Eu determino agora km e v máximo bom basta você olhar aqui is equação do reta do tipo y = x + b certo quando x = 0 eu encontro esse ponto que é 1 sobre V máximo Então x = 0 eu chamar isso aqui de 0 certo o 1 sobre S de0 eu vou ter que 1 sobre

v0 1 sobre V máximo então basta pegar esse valor aqui inverter eu tenho V máximo eu veja que é uma projeção né Eu peguei a reta E fiz uma projeção e projetando extrapolando essa reta no eixo X quando Y = 0 quando 1 sobre v0 é 0 eu tenho -1 sobre km né então basta você jogar esse -1 sobre V máo para cá como V máo vai estar dos dois lados você corta a concentração desse substrato aqui é -1 sobre km então no intercepto no eixo Y é 1 sobre V máximo no intercepto no eixo

x- 1 sobre km E aí eu posso determinar isso para qualquer enzima basta ter um conjunto de dados bonito como esse daqui que tem essa linearidade questão três olha Eh eu vou ler o enunciado disso depois seria interessante você parar o vídeo e tentar fazer isso sozinho sozinha no Excel análise gráfica de v máximo e do km seguintes dados Foram obtidos em experimentos feitos durante estudo sobre a atividade de uma peptidase intestinal sobre o substrato glicilglicina então peptidase é enzima que corta peptídeo glicilglicina um dipeptídeo então glicilglicina foi hidrolizado por essa peptidase forma dois glicina

né dois aminácidos a que são as concentrações substratos utilizadas e essa concentração de produto formado por minuto né então produto por minuto velocidade tá aqui utilize né use análise gráfica para determinar o km e o v máximo desta preparação de enzima sobre esse substrato bom eu tenho esses dados aqui no Excel Então nesse ponto eu sugiro que você pare a apresentação Tente fazer sozinho e depois você volta para cá o que você faz com isso a primeira coisa que você pode fazer é dar uma olhada na cara dessa curva né então eu vou inserir um

gráfico de dispersão e eh os dados que eu vou colocar aqui então vou adicionar os dados o o nome da série né no caso o nome da série do eixo X aqui é concentração do substrato na verdade isso aqui eu nem precisaria colocar mas eu vou deixar aí e os valores da concentração do substrato do X tá aqui e os valores D Y que são a a velocidade está aqui eu tenho isso pronto isso é a minha curva dá para fazer alguns Melhoramentos nessa curva então primeiro você vê aqui que tem uma distância aqui que

é meio inútil né então eu posso reformatar o eixo então o eixo ele ele pode começar por exemplo em 015 então aqui fica com uma cara melhor eh eu gostaria de representar as coisas aqui o que que é o x que é o y então você vem aqui no design e você seleciona isso E aí você vai rotular nessas coisas no eixo X é a concentração do substrato Então tá lá a concentração do substrato Você pode deletar isso que não te interessa no eixo Y Você quer isso daqui produto formado então você seleciona tudo isso

daqui instalar o valor então você pode ajustar a fonte disso vamos colocar uma fonte 14 assim mais ou menos visível então ficou desta forma então aqui você tem o gráfico da hipérbole então você vê que ele vai subindo subindo subindo e vai ter assíntota mas você já tem uma ideia né o v máximo diso deve S 0,4 alguma coisa 0,5 você consegue ver isso aqui não é necessário mas não é dessa forma que se determina né Isso é uma forma de estimativa nós acabamos usar o método de estimativa a gente quer um valor mais preciso

então tem que ser usando o método de line weberg no método de Line werberg você vai fazer o duplo recíproco então aqui é 1 sobre s então isso vai ser igual 1 dividido pela concentração do substrato aqui tá aí e são seis concentrações de substratos 1 2 3 4 5 6 tá lá e aqui a concentração velocidade né vai ser um sobre velocidade então aqui tá concentração de p um sobre desculpa e produto formado por minuto e aqui estão os valores Faltou um estamos aqui agora você vai fazer o gráfico Então você vai lá inserir

dispersão e vai fazer a mesma coisa do lado de cá eu vou colocar o gráfico um do lado do outro para você Comparar as coisas então selecionando os dados então primeiro dado ser selecionado aqui é o nome da série então tá lá um sobre s depois eu vou usar isso no eixo X os valores de x são esses agora de 1 sobre s e os valores de y é os valores de 1 sobre v0 que eu calculei aqui embaixo e eu dou ok e está aqui então você vê que olha só esse padrão e olha

esse padrão é óbvio que esse padrão Ele tem muito mais cara de uma reta muito mais cara de uma reta e você pode fazer a mesma coisa aqui você pode ajustar essas coisas o eixo de forma a ficar mais fácil para você então você pode deixar o eixo começando em 1,5 por exemplo né assim ficou mais mais Evidente o efeito da reta agora eh com relação ao formato disso então a gente vai selecionar isso daqui e eu vou transportar essas coisas para onde de fato faz sentido então o valor de X eu vou colocar aqui

não preciso mais disso isso também não é necessário do lado de cá e o valor de y coma unidade né vem aqui depois é só uma questão de você ajustar a fonte e está pronto Essa é aur agora Como que eu faço para calcular o valor de km V máximo bom O que você vai fazer agora é fazer uma regressão linear então você vem aqui para layout linha de tendência e ele já selecionou linear eu não quero simplesmente que ele me mostre que isso é linear eu quero que ele exiba equação e eu quero que

ele me exiba o coeficiente de correlação o coeficiente de correlação ele disse para mim o quanto que essa reta obtida ela é reta de fato n e o que você vê é que o nosso coeficiente de correlação R Quad 0,99 quanto mais 9 mais bem sucedido sua reta e os pontos eles estão muito próximos é dessa reta média aqui então foi bem sucedido é uma reta o que eu quero é a projeção certo ele não vai desenhar a projeção para você mas você tem a equação essa equação ela Corresponde à equação onde está a equação

ela corresponde a essa equação aqui 1 sobre v0 km V máo + 1 sobre V máximo e eu posso trabalhar isso uma vez que eu tenho equação em valores numéricos eu tenho Y = Ax + B é fácil para mim eu só tenho que saber qual é o valor de X desculpa o valor de y quando X igual a 0 e o valor de x quando o y é igual a 0 então vamos lá no Excel então aqui está a minha equação Y = 4,2 eh - + 1,978 bom quando x = 0 x =

0 eu vou ter o valor de y então automaticamente eu sei aqui eh que o meu 1 sobre V máximo é 1,978 veja x = 0 certo eu tô se você ainda não enxergou x = 0 é 1 sobre concentração de S né então isso tudo vai ser zero então sobre v0 é 1 sobre V máximo se eu inverter eu tenho automaticamente V máximo Então quando x = 0 y = y que é 1 sobre v0 1 sobre v0 é igual 1 98 que é 1 sobre V máo então para calcular V máximo basta inverter

esse número então 1,978 1 sobre x esse V máximo 0,50 Então você já pode escrever aqui colocar o valor dele 0,50 h eu acho que eu vou ter que andar com essas coisas um pouquinho acho que tá bom o valor tá aqui esse é o v máximo certo 0,50 micromol por minuto certo então a gente pode acho que eu vou fazer isso assim que acho que fica melhor V máximo tá aqui e eu vou destacar isso para não dizer que tá junto com a outra tabela tá aqui esse é o v máximo agora como eu

acho km o km eu acho quando o y é igual 0 então quando Y iG 0 basta passar esse valor pro lado de lá que vai ficar negativo e dividir por 4,2 663 que é o x isso me dá 1 - 1 sobre km eu tenho que inverter certo então vamos lá fazer essa conta então eu terei -1,99 78 divido por 4 2663 dá esse valor isso é -1 sobre km o inverso disso é o km né E aí é óbvio como é -1 multiplica por por men1 aí eu tenho km aqui km constante de

Micael eu peço desculpas eu escrevo em minúsculo aqui porque ele não consigue fazer o subscrito ainda né no no Excel preciso entender como é que faz isso melhor mas é uma letra maiúscula subscrito E aí o Km daqui é 12,13 2,135 aí esse é o km 2,135 milimolar e e isso isso deve fazer sentido porque isso é exatamente quando eu tenho 50% do V máximo certo porque ó 50% do V máximo 0,25 Olha 0,24 é 2 e o Km que a gente achou é 2,13 então tá corretíssimo é isso daí então aqui eu vou destacar

o km também e vou colocar aqui em eu espero que isso seja muito eh útil para você então alguns grupos pesquisa na iar principalmente no instituto de química eh trabalho com cinética enzimática e o O que você vai fazer nesses grupos é é resolver problemas dessa natureza né continuando e mais uma pergunta eh no livro ele mostra vários tipos de inibição né a inibição competitiva incompetitiva e mista isso você vai aprender nas atividades que eu vou falar daqui é inibição Irreversível existe uma enzima chamada cicloxigenase que é enzima envolvida na inflamação então geralmente inibe-se a

cicloxigenase tomando-se Aspirina Então você tem redução da dor você tem dor de cabeça toma aspirina ela é um antiinflamatória n esteroidal e como ela faz é isso como que surge ess inflamação existe uma proteína de membrana chada chamada cicloxigenase cox Aquele é um dímero tá vendo dímero significa que ela tem duas subunidades e ela pega um lipídio chamado ácido aracdônico esse ácido aracdônico ele tem origem da membrana E então tem alguma coisa que vem antes né que é uma enzima chamada fossola que vai liberar um lipídio daqui e esse lipídio ele entra no sítio ativo

da cicloxigenase e no sítio ativo sítio catalítico ele tem essa serina aqui 529 que provavelmente participa da catálise e o que isso faz é converter essa molécula aqui desculpa essa representação é péssima né mas foi o melhor que o artista pôde e isso daqui ele converte em pgh2 que é uma próstata glina né uma molécula envolvida eh na resposta inflamatória percebe que esse túnel aqui como é dim né tá acontecendo aqui e aqui esse túnel aqui para entrar um lipídio ele é hidrofóbico Nós estudamos lipídeos ainda mas você já deve intuir ou deve ter estudado

aí sozinho já e parabéns por ter feito isso que lipídios são hidrofóbicos como a Aspirina funciona então a Aspirina ela é o ácido acetil salicílico então é um ácido porque é um derivado de ácido carboxílico né Tá vendo aqui grupo carboxilato aqui é o grupo acetil em vermelho e isso daqui é o salice cato que é esse ácido carboxílico com com o aqui seria um oh né e o ácido acetilsalicílico ele acetila proteínas então quando ele entra aqui ele vai atilar a cerina 529 e liberar o ácido salicílico então ocorre a acetilação na serina 529

quando isso ocorre eu faço um impedimento estérico aqui então o ácido aracdônico que é aquele delivar de lipídio ele é lipídico Ok o tubo é hidrofóbico aqui o o o eh O Túnel é hidrofóbico mas ele não vai conseguir vir até aqui onde ocorre a catálise porque tá obstruído E aí eu tenho a redução da inflamação eh é óbvio que não é só a cox que é afetada né hoje a gente estuda muito esse acetila do ácido salicílico para ver quais são as outras enzimas humanas que são afetadas né ele resolve inflamação mas ele pode

ter eh como uma molécula é muito pequenininha o a acetil salicílico ele pode acabar atilado outras proteínas né você imagina por exemplo né como cerina e cister são parecidos Onde tiver cistin ele vai atilar Onde tiver lisina também porque lisina lembra é o nh2 lá na pontinha né então nh2 é o nucle e esse nucleófilo ataca aqui essa carbonila aqui ó porque isso aqui é um wer né você já deve ter se ligado aqui ó R C dupla o o Então esse carbono ele tá sempre mais positivo por causa desse oxigênio que vai puxar esse

elétron da dupla E aí o nucleófilo pode atacar aqui por isso que o oh da serina ataca e o e outros nucleófilos também então você vai ver acetilação de cisteína de lisina isso pode afetar outras proteínas hoje a gente tá estudando bastante isso né mas com isso daí você tem uma ideia de como funciona a inibição Irreversível por aspirina bom Aqui está a questão quatro relações entre a velocidade de reação e concentração do substrato equação de Micael menten a qual a concentração do substrato para que um enzima com cacate 30 seg men1 e km 005

molar opere com 1/4 da velocidade máxima determine a fração da V máximo que seria obtida na seguintes concentrações de substrato concentração de substrato 05 km 2 Km e 10 km C enzimas que catalisam reação X é convertido em Y são isoladas de duas espécies de bactérias as enzimas possuem mesma V máximo mas diferentes valores de km para o substrato x a enzima A tem km 2 micromolar enquanto a enzima B tem km5 micromolar o gráfico abaixo mostra a cinéticas das reações catalisadas pela mesma concentração de cada uma das enzimas e com concentração x = 1

então eu tô usando a mesma quantidade de enzima e a mesma quantidade de substrato qual curva corresponde a cada uma das enzimas essa última É bem interessante mas vamos responder uma por uma pare o vídeo tente responder sozinho e depois que quiser prosseguir avance então a qual a concentração do substrato para que o enzima com Kart 30 segund Men 1 e km 00 050 molar opere com quarto do velocidade máxima essa equação de meles menten então tudo que eu tenho que fazer é o seguinte eu vou ter 1/4 certo da velocidade máxima 1/4 V máximo

igual V máximo concentração de S km s aí se você desenvolver isso daqui por álgebra simples corta V máximo dos dois lados isola o s você vai ver que S vai ser km dividido por 3 como km é dado no enunciado basta dividir e o km 0,0017 molar então essa parte é fácil B determine a fração de v máximo que seria obtida nas seguintes concentrações de substrato 1 km 2 Km 10 km ora a fração é isso aqui né esse 1/4 é uma fração então chamando a fração de Z Então vou chamar isso aqui de

z z V máo iG v máo e aí eu coloco o Km da vez Então Primeiro vou testar com me km km so 2 aí eu calculo meu Z dá 1/3 depois eu coloco 2 Km o meu Z 2/3 e finalmente eu coloco 10 km e o meu Z 101 então com isso eu consigo calcular Qual é a fração de e v máximo que eu estou a cada um desses kms então lembra que km é uma concentração de substrato certo é óbvio que a enzima tem o km dela que é isso aqui então quando eu

trabalho com metade do km eu tenho 1/3 do V máximo É bem menos e que V sobre 2 certo V sobre 2 é óbvio afinal de contas eu tô abaixo do km se eu tô abaixo do km eu não tenho nem 50% vou ter 1/3 quando eu ponho duas vezes o km eu tenho 2/3 75% V máximo e quando eu ponho 10 km é É pensa naquela curva né na hipérbole eu tô saturando enzima com substrato tenho agora uma conção do substrato igual a 10 vezes o km Olha só o meu V máximo é 10

11 é quase 100% do do V máximo porque eu saturei eu tô lá no finalzinho quase encostando na assíntota da curva a última pergunta enzimas que catalisam reação x y são isoladas de duas espécies de bactérias as enzimas possuem mesma V massa mas diferentes valores de km para substrato x a enzima A tem km 2 micromolar enquanto enzima B tem km de meio o gráfico abaixo mostra as cinéticas das reações catalisadas pela mesma concentração de cada uma das enzimas e com concentração de x = 1 ou seja eu tenho dois tubos a mesma concentração de

cada enzima mesma concentração de a mesma concentração de B em cada tubo tubo um com enzima A tubo do com enzima b e a concentração de x é a mesma em cada tubo e eu fui acompanhar a reação Observe isso daqui é tempo contra concentra ração de y que é produto formado não tem nada a ver com o que a gente viu lá que era concentração de S E v0 isso daqui de fato é o que você mede no laboratório Você mede formação de produto no tempo é é complicadinho e enfim a cinética enzimática realmente

merece três aulas mas eu acho que com isso esse exercício é suficiente para você ver é isso que você mede mas aí é fácil né se você tem del Y por delx você tem a velocidade Então você já deve ter entendido como é que se calcula a velocidade aí né muito parecido quando você Calculava a velocidade lá de um de um carro quando você estudava física mesma coisa então a variação de concentração dividido pela variação do tempo bom mas não é isso que ele quer saber né Ele quer saber que curva é a e Que

curva é b bom e olha isso aqui isso daqui é uma representação de cinética inimá do jeito que você con concentração de S sobre 1 so v0 para duas enzimas uma de baixa afinidade ou seja ela tem um alto km ó 2 e uma de alta afinidade ela tem um baixo km que é essa daqui ó Rai afinity meio e eu estou aqui né a 1 certo x = 1 o que que acontece com x = 1 x = 1 eu tenho que em relação a enzima de baixa afinidade eu estou abaixo do km e

em relação a enzima de alta afinidade Eu estou bem acima do km como eu estou bem acima do km eu tenho muito mais a gente acabou de fazer no Exercício né Muito mais do que 50% do V máximo tenho mais que isso enquanto nessa daqui eu tenho menos de 50% de v máximo Então é óbvio que a enzima de baixa afinidade de Alto km ela não está operando tão bem quanto a enzima de baixo km então nossas conclusões seriam se a concentração é a mesma né se é 1 micromolar e tá abaixo do km de

a Olha só o a aqui tem km de 2 certo um tá abaixo com m de a mas tá acima do B que é meio Então você já viu já sabe quem é a enzima que tá operando melhor então logo B está operando com velocidade maior que a e portanto converterá todo o substrato X em produto Y antes de a antes então num dado tempo se você escolher esse tempo aqui você vê que essa daqui converteu muito mais substrato em produto que essa logo a curva de cima é b e a curva de baixo é

a Espero que você tenha acompanhado isso daí Uma Última Questão essa tem a ver com o PH as enzimas elas sofrem efeito do PH então isso aqui é uma curva clássica que você vai ver em qualquer livro de bioquímica né aqui você tem atividade da enzima pode ser a velocidade dela e eh e aí você vai ver que é uma curva bimodal ela sobe atinge um pico e depois cai e eu tenho um PH onde esse valor é máximo Então significa que os grupos titul da enzima à medida que eu mexo com ph eu titulo

esses grupos e atino uma situação em que a o estado de ionização desses grupos é favorável à catálise depois antes disso não é tão favorável mas vai ficando aqui é a melhor condição e depois disso é desfavorável Como que eu consigo entender isso de subir e descer Isso tá nesse exercício aqui pega ótimo da lisozima o sítio ativo da lisozima contém dois resíduos de aminoácidos essenciais para catálise glutamato na posição 35 aspartato na posição 52 os valores de PK das carboxilas das cadeias laterais desses resíduos são 5.9 pro glutamato 4.5 pro aspartato respectivamente Qual é

o estado de ionização protonado ou desprotonado de cada resíduo em PH 5.2 o PH ótimo da lisozima Então estou aqui né 5.2 como está cada resíduo e como os estados de ionização desses resídos podem exemplificar o perfil PH atividade da lzin mostrado a seguir a segunda parte é mais complicada mas a primeira você tira de letra basta olhar os números você v que 5.2 é Aqui é onde eu tenho o PH máximo o PK do aspartato é 4.5 então ele estará desprotonado mas o PK do ácido glutâmico 5.9 ele estará protonado Então tá aqui não

pegar 5.2 glutâmico 35 protonado aspartato 52 desprotonado Então eu preciso ter apenas um deles desprotonado no sítio ativo para que a enzima funcione bom e como é que eu consigo explicar isso daqui n não é tão difícil coloca a enzima em ph2 a enzima em ph2 os dois vão estar protonados ao glutâmico aspartato a medida que você vai aumentando o PH você titula o aspartato o glutamato você não vai conseguir titular quando você chega aqui certo você tá titulando até chegar aqui a enzima tá na atividade boa del na atividade máxima se você continuar titulando

o que significa adicionar mais Base alterar o PH o ácido glutâmico também faz vai se desprotonar mas agora pense o ácido glutâmico ele é ácido quando ele desprotonar é ácido quando ele desprotonação negativas no áo no sítio ativo e esses resíduos estão vicinais estão muito próximos né claro que aqui 35 e 52 eh Parece que eles estão longe mas você tem que imaginar que isso uma estrutura tridimensional né O ideal seria a gente ter o arranjo tridimensional da lisozima para dar uma olhada aí mas vamos imaginar que eles estejam espacialmente próximos bom menos com menos

se repele então esses dois resíduos desprotonados eles vão eh produzir uma alteração da estrutura do sítio ativo e por isso que a atividade cai por isso que é bimodal então é é ascendente porque eu tô cada vez mais desprotonado esse e depois é descendente porque eu tô cada vez mais plotando mais desse e fazendo com que eu tenha repulsão no sítio ativo então a resposta seria assim o gráfico sugere que o sítio ativo da enzima precisa de um grupo A áo desprotonado a gente viu isso pelo menos um à medida que o PH sobe ASP

52 desprotonação que aumenta a atividade da enzima glu 35 ainda encontra-se protonado no PH ótimo nós vimos isso porque o PK 5.9 como ambos os resíduos fazem parte do sítio ativo devem estar próximos e sofrerem influência da carga um do outro após desprotonar em PH maior que 5.9 você pode ver que é mais ou menos aqui né olha só o que já aconteceu tô quase 50% da atividade a repulsão de cargas pode alterar a estrutura do sítio ativo e reduzir a atividade da enzima Então é isso que ocorre isso explica por que eh eu tenho

esse padrão bifásico no PH e é a mesma coisa também para eh o efeito da temperatura Pense aí o que poderia acontecer quando eu vou aumentando a temperatura do enzima para dar também um padrão bifásico concluo aqui a aula de enzimas parte do