Curso de Bioquímica: Estrutura e função de aminoácidos (parte II)

Bom dia, queridos alunos. Estou de volta. Eu sou o professor Sérgio. Na aula de hoje, continuaremos com assunto aminoácidos. Agora, com a segunda aula, aminoácidos do iremos concluir esse assunto. Então, vamos começar a aula falando um pouquinho mais, avançando no tema, falando um pouquinho mais como esses aminoácidos se juntam para formar compostos biologicamente ativos, que são chamados de peptídios ativos. são os bioativos. Então, os peptídios ativos ou peptídeos biologicamente ativos são peptídios capazes de exercer uma atividade reguladora no organismo humano ou no metabolismo de microrganismos, independente de seu valor nutritivo. Então ele vai ter a

capacidade de atuar ou no metabolismo ou em alguma função regulatória, mesmo que não levemos em consideração o seu valor nutritivo, ou seja, sua capacidade de fornecer aminoácidos como fonte de energia ou como fonte para síntese de novas proteínas. Nós temos dois exemplos aí, a angiotensina 1 e a angiotensina 2. A angiotensina 1, ela é precursora da angiotensina 2 e que a angiotensina um é precursora, aliás, a angiotensina um é produto da degradação do angiotensinogênio. São peptídeos, como nós podemos ver na imagem aqui em cima, formado por uma cadeia de aminoácidos e que tem por função

regular os níveis pressóricos. os níveis de constela dos vasos sanguíneos que levam à regulação da pressão sanguínea. Angiotensina um e angiutensina dois. Outro exemplo de peptídeo biologicamente ativo é a ocitocina. Como nós podemos ver nessa imagem, o citocino é formado por diversos aminoácidos que em seu conjunto, formando o hormôniocina, eles vão ser encarregados, como nós podemos ver na figura, pela contração da musculatura da mama e a expulsão do leite. Também a ocitocina tem por função a contração da musculatura uterina durante o parto. é um hormônio que é produzido pela pelo sistema nervoso e que é

liberado pela hipófise durante a lactação e durante o parto. Bem, na aula de hoje nós veremos, nós seguiremos o seguinte roteiro: ligações peptídicas. Vamos iniciar a aula vendo o que são ligações peptídicas, o que é uma extremidade n terminal e o que é uma extremidade C terminal em uma proteína ou em um peptídio. Quais são as propriedades ácido básicas de um peptídeo? Como acontece a síntese proteica? Quais as diferenças em um de um polipeptídeo para uma proteína? O que são cadeias proteicas e como é que elas se distribuem? Como elas são formadas? como as proteínas

são purificadas, os principais métodos de quantificação de proteínas e finalmente nós terminaremos a aula com o sequenciamento de peptídeos. como é que é feito, né, na prática, na nas pesquisas, como é feito o sequenciamento, como na determinada sequência de aminoácidos em uma proteína, em um peptídio. Então aqui nessa imagem nós estamos vendo que aminoácidos separados, esses dois aminoácidos vão se juntar para formar um dipeptídio. Nessa ligação, nessa união entre esses dois aminoácidos, eles são unidos através de uma ligação especial, de uma ligação específica e chamada de ligação peptídica. É a ligação entre um grupamento carboxila

de um aminoácido e o grupamento amino ou amina dos aminoácidos. Seguinte, então, a ligação entre um grupo carboxila e o grupamento amino vai formar essa ligação aqui chamada de ligação peptídica, que forma a maioria das proteínas. As todas as proteínas são formadas pelo encadeamento de aminoácidos e esses aminoácidos são ligados uns aos outros através de uma ligação peptídica. Mas de fato, quimicamente falando, como é que essa ligação peptídica ela é formada? Então, a ligação peptídica é formada quando, como nós vimos no slide anterior, um aminoácido se une com o aminoácido seguinte, formando essa ligação peptídica.

Nessa ligação peptídica, a retirada de um grupamento hidroxila do grupamento ácido, do grupamento carboxila e um hidrogênio do grupamento amina também sai. Hidroxila com hidrogênio, como nós sabemos, vai formar água. Então, uma reação chamada reação de desidratação ou também pode ser chamada de reação de condensação, já que duas moléculas mais simples, separadas, agora vão formar uma molécula mais complexa e maior. A reação de condensação que acontece por um processo de desidratação. Aqui destacado, nós temos uma ligação peptídica. Quem faz essas ligações peptídicas é uma enzima chamada de peptidil transferase. Nós vamos ver, nós vamos ouvir

falar muito dessa enzima quando esver tivermos vendo a síntese de proteínas, a síntese proteica. Essa enzima fundamental para que os aminoácidos possam se unir, formando assim as proteínas. Nessa outra imagem, nós podemos ver já uma cadeia polipeptídica um pouquinho menor. Quando a gente fala de aminoácidos, normalmente nós usamos a terminologia resíduo de aminoácido. Então, cada aminoácido, cada cadeia aminoacídica é chamada de resíduo de aminoácido. Então nós estamos vendo aqui um aminoácido um ligado ao aminoácido dois por uma ligação peptídica, ligado ao aminoácido três por uma outra ligação peptídica, ligado ao aminoácido quatro por mais uma

e aminoácido cinco por mais uma ligação peptídica. Então nós temos cinco resíduos de aminoácidos, quatro ligações peptídicas. OK? Tudo bem? Até aí nós já havíamos falado sobre isso. Só que nessa figura nós podemos observar que existe um grupamento amina que não vai reagir, que foi o primeiro aminoácido. Existe um grupamento carboxila que também não vai agir, que ela é o primeiro aminoácido da cadeia polipeptídica. Então, primeiro aminoácido e o último aminoácido, eles são chamados aminoácidos das extremidades. E o aminoácido da extremidade carboxila, ele vai apresentar um grupamento carboxila livre. O aminoácido da extremidade amino vai

apresentar um grupamento amino livre. Então, nós podemos dizer que todas as proteínas e todas os peptídeos, os polipeptídeos ou os oligopeptídeos apresentam duas extremidades bem características. Uma extremidade chamado carboxiterminal ou C terminal e uma extremidade aminoterminal ou N terminal. Então, quando vocês lerem nos livros ou quando vocês ouvirem falar extremidade C terminal, é extremidade na qual o grupamento carboxila do aminoácido está livre ou extremidade n terminal é quando o grupamento amino do aminoácido está livre sem formar ligações peptídicas. Nessa outra imagem, nós podemos ver uma característica também bastante importante dos polipeptídeos, das cadeias polipeptídicas. Então,

nós podemos observar três aminoácidos ligados: Alanina, glutamina, glicina e lisina. E esses aminoácidos, obviamente, eles apresentam, a gente vai, a gente já viu na aula passada que todo aminoácido ele é formado por um grupamento amina, um grupamento carboxila e uma cadeia lateral. Essa cadeia lateral ela se apresenta diversa, diferente em cada um dos aminoácidos. Então, a lanina, por exemplo, apresenta apenas um grupamento metil como cadeia lateral, mas a glutamina apresenta um grupamento carboxila, mas a lisina apresenta um grupamento amina, a glicina apenas um hidrogênio a sua cadeia lateral. Isso nos dá, isso nos diz que

as propriedades de um peptídio, sejam propriedades ácidas, sejam propriedades básicas ou sejam propriedades hidrofóbicas, são características da sequência de aminoácidos e, obviamente, de suas cadeias laterais. Uma proteína é considerada proteína ácida, quanto a maior proporção dos seus aminoácidos são aminoácidos que têm cadeias laterais ácidas. Uma proteína é considerada proteína básica quando a maior proporção dos seus aminoácidos apresentam cadeias laterais básicas. E obviamente a proteína também pode ser hidrofóbica se os seus aminoácidos tiverem cadeias laterais hidrofóbicas. Seguindo adiante, nós temos aqui o processo da síntese proteica. Então, as proteínas são sintetizadas a partir de um conjunto

de aminoácidos. E, obviamente, esse conjunto de aminoácidos apresentam uma certa entropia, que a gente vai chamar de entropia S1. Por que que os aminoácidos tendem a formar proteínas? Por que que os aminoácidos, espontaneamente, obviamente eles precisam de enzimas para que façam a ligação peptídica, mas eles tendem, eles querem formar proteínas. Por quê? Porque os aminoácidos livres, apresentando assim uma entropia S1, eles vão formar uma proteína que apresenta uma entropia S2 menor do que S1. Então, a diminuição da entropia facilita a formação das ligações peptídicas e, consequentemente, a síntese das proteínas. Então, vamos levar sempre isso

em consideração. Aminoácidos tendem a formar proteínas porque há uma diminuição da entropia do sistema. Mas obviamente que as coisas não são simplesmente eh princípios termodinâmicos, né? simplesmente a variação de entropia que facilita a síntese proteica. A síntese proteica ela acontece porque é algo que nós chamamos de fluxo da informação genética. As proteínas são sintetizadas ou a sequência das proteínas são determinadas pelo que nós chamamos de código genético, pelo que nós chamamos de sequência gênica ou genética que cada um de nós temos e que é diferente de indivíduo para indivíduo. Então nós podemos ver aqui na

imagem superior um DNA dupla hélice. Apresenta uma determinada sequência de nucleotídios. Esses nucleotídios, a trinca de nucleotídos é chamada de codon. E esses coddons, eles vão dar origem ou eles vão ser usados para sintetizar uma um núcleo o o ácido nucleico mensageiro chamado de RNA mensageiro, que vai sair do núcleo, ele vai até os ribossomos e vai servir de molde ou de modelo paraa síntese das proteínas. Cada trinca de bases, cada códageiro vai servir como molde para inclusão da sequência de aminoácidos específica para aquela proteína. Então, o fluxo da informação genética vai seguir isso. Veremos

mais detalhes quando tivermos a aula de tradução, aula de síntese proteica. Seguindo em frente na aula, vamos fazer a diferença entre polipeptídeo e proteínas. Polipeptídeos versus proteínas. Então, um polímero de aminoácidos é chamado de um dieptídeo. Se ele tiver apenas dois resíduos de aminoácidos, esses esse esse peptídio chamado de di peptídio, apenas dois, três tripeptídios, quatro tetrapeptídio, cinco pentapeptídeo e assim por diante. Se ele tiver um um número que é bem variável de autor para autor, mas se ele tiver um número não muito grande, menor, por exemplo, do que 10.000 e unidade 10.000 daltons, ele

é chamado de oligopeptídio. E se tiver acima de 10.000, Daltons, ele é chamado de poliptídeo ou também em alguns casos polipeptídios e proteínas conseguem, né, eles são eles são eh conceitos que se confundem, né, polipeptídeo e proteínas muitas vezes são considerados a o mesmo a mesma molécula. O tamanho da proteína, será que determina função da proteína? Não necessariamente. Na maioria das vezes, a função das proteínas são determinadas pela sua forma. Então, veremos que as proteínas, né, na aula de proteína, nós veremos que as proteínas elas conseguem se arranjar no espaço em formas específicas e exclusivas

que vão determinar a sua função. Então, uma proteína grande ou proteína pequena, pouco importa pra sua função, mas a forma, o jeito como os aminoácidos se arranjam no espaço, formando estruturas tridimensionais, isso sim vai ser extremamente importante pra função da proteína. Então, as proteínas podem ser formadas por mais de uma cadeia polipeptídica. Por exemplo, citocromo C é formado por uma única cadeia polipeptídica, mas a hemoglobina já é formada por quatro cadeias polipeptídicas. Duas cadeias são chamadas cadeias alfas porque são iguais e outras duas são chamadas de cadeias beta porque são iguais entre diferente das cadeias

alfa. Elas podem ser formadas por várias cadeias poliptídicas formam uma proteína e aí já não há mais confusão entre polipeptídeo e proteína. Proteína seria as quatro cadeias polipeptídicas. Se a proteína for formada por uma única cadeia poliptídica, polipeptídio e proteína é a mesma coisa, mas se for formada por mais de uma cadeia polipeptídica, aí nós podemos observar claramente a diferença. Nessa outra tabela aqui, nós podemos ver algumas alguns dados moleculares de proteínas, né? Nós podemos observar a diversidade muito grande de proteínas, como por exemplo, o citocromo C. Peso molecular de 13.000 1000 Daltons apresenta 104

resíduos de aminoácido formado por uma única cadeia polipeptídica. Quimiotripsina de pâncreas bovino possui quase o dobro do número, quase o dobro do tamanho molecular, 21.600 duns, 241 resíduos de aminoácidos, três cadeias polipeptídicas. E aí nós podemos encontrar na natureza uma diversidade muito grande de cadeias polipeptídicas em relação ao seu tamanho, em relação ao número de resíduos, em relação também ao número de cadeias polipeptídicas. Podemos encontrar como no caso do quimiotripsinogênio três cadeias polipeptídicas formando a proteína. Mas também encontramos como na hemoglobina que nós já citamos quatro com RNA polimerase extremamente importante pra síntese do RNA

mensageiro. Encontramos até cinco resíduos, ou melhor, cinco cadeias poliptídicas ou na glutamina sintetase. Vejam, 12 cadeias polipeptídicas. A maior proteína que se conhece em humanos é a titina, encontrada no músculo esquelético com quase 3 milhões de daltons e quase 27.000 resíduos de aminoácidos em apenas uma única cadeia polipeptídica. Aí surge a pergunta: sabemos que as células possuem milhares de diferentes tipos de proteínas. Então, a gente viu agora alguns exemplos de uma grande variedade de proteínas, mas perguntamos como uma proteína específica ela pode ser purificada. Se nós quisermos naquela célula de tantas proteínas que são sintetizadas

pela célula, se nós quisermos isolar uma única cadeia polipeptídica, como faremos? Como é que nós conseguiremos purificar? Que características a gente precisa extrair da proteína para que possamos ou que que características precisamos estudar na proteína para que possamos isolá-la das demais proteínas? Algumas propriedades podem diferenciar uma proteína da outra e muitas das técnicas usadas para extração, para purificação, para isolamento de proteínas usam essas propriedades, usam essas características, como por exemplo, tamanho. A gente viu que as proteínas são bem diferentes em relação ao tamanho. Então, o tamanho pode ser usado para separar proteínas. Proteínas grandes não

vão passar por uma peneira molecular, digamos assim. E proteínas pequenas podem passar por essa peneira molecular. A gente pode separar proteínas grandes de proteínas pequenas. A carga elétrica também a gente viu que existem proteínas ácidas, proteínas básicas. Proteínas ácidas vão apresentar carga elétrica negativa. Proteínas básicas vão apresentar carga elétrica positiva. A gente pode separar o positivo do negativo simplesmente colocando um eletrodo no meio que vai atrair moléculas positivas e negativas para lados opostos, para lados diferentes. E também propriedades de ligação. Muitas das proteínas têm a capacidade de interagir com determinadas moléculas. Se nós colocarmos no

meio ligante, esse ligante pode atrair a proteína específica que nós queremos isolar das demais proteínas. São as três principais formas de isolamento e separação de proteínas. Então, seguindo o esquema da separação de proteínas, que é absorvida por uma área maior chamado química de proteínas, nós podemos dizer que inicialmente a gente vai extrair a proteína e depois vai quantificar. No método de extração a gente pode utilizar o o até na identificação de proteínas, nós podemos usar métodos cromatográficos. Vamos ver alguns deles. Podemos usar também a eletroforese para separação de proteínas basead em carga elétrica ou baseado

no peso molecular. E também podemos utilizar sequenciamento para entendermos qual a sequência de aminoácido são eh áreas que são abrangidas pela química de proteínas. Então, como é o passo a passo da purificação de proteínas? Inicialmente, essa essa célula ou esse tecido que tem as proteínas que queremos estudar, eles vão ser lisados, vão ser quebrados, vão ser rompidos os as suas membranas biológicas, vão vão ser expostas as proteínas. É o que nós chamamos de extrato bruto. Extrato bruto. Extrato bruto é todas as proteínas juntas. Próximo passo vai ser a precipitação de proteínas. o que nós chamamos

de saling out, precipitação de proteínas. E a gente precipita essas proteínas utilizando sal, né? Um dos mais usados para precipitar proteínas é o acetato de amônio esse sal aqui, formado por um grupamento acético, né? um ácido acético ligado ao grupamento, a o amônio, o acetato de amônio. Nesse eh gráfico aqui, nós podemos ver duas eh formas de precipitação de proteínas. Aqui tem o salting out e aqui temos o salt in. E nesse ponto branco aqui, nessa faixa branca do gráfico, é onde as proteínas são solubilizadas. Nós podemos precipitar no salt e nós podemos precipitar no

saltin. Inim. O que é o salt? Saltin é quando nós colocamos uma quantidade de sal muito pequena no meio. E essa quantidade de sal muito pequena do meio, ela diminui a solubilidade da proteína. Por que que diminui a solubilidade da Por que que sal facilita a solubilidade da proteína? Porque o salo se ligar na proteína, a proteína normalmente ela tem uma determinada solubilidade, mas o sal facilita o aumento essa solubilidade. Por quê? Porque como nós podemos ver aqui, nós temos aqui representado as proteínas. Aqui nós estamos representando moléculas de sal. Essas moléculas de sal, o

sal obviamente ele tem a capacidade de atrair água. E se nós tivermos poucas moléculas de sal, nós temos uma capacidade de formação de uma camada de solvatação pequena. Então você tem pouco sal, tem baixa camada de salvatação. As proteínas por si só não conseguem se solubilizar no meio pela sua baixa capacidade de solubilidade, dependendo obviamente da sequência de aminoácidos, mas ela irá precipitar. Se nós aumentarmos a quantidade de sal, o que que nós vamos observar? O aumento do sal ligado à proteína, obviamente o aumento da camada de salvatação, que é essa faixa branca aqui, na

qual a concentração de sal auxilia na solubilidade da proteína. Após e essa faixa de solubilidade, se nós continuarmos aumentando a quantidade de sal, o que que nós vamos fazer? O sal vai se ligar na proteína, fazendo a sua camada, da sua votação, mas muito sal não vai conseguir mais se ligar a proteína porque tem excesso de sal. Esse excesso de sal que vai sair da ligação com as proteínas vai levar consigo a camada de salvatação. E aí nós temos o efeito inverso. O sal vai retirar a camada de solvatação para si, diminuindo a solubilidade da

proteína. Então, pouco sal diminui a solubilidade da proteína, o efeito é o saltin. Muito sal também diminui a solubilidade da proteína, é o efeito salting out. Então, vamos ver nesse esquema como é que é feito a precipitação de proteínas. A gente tem aqui a proteína solúvel. Adicionou aqui o sal complexo insolúvel. Tá aqui é precipitação. Depois dessa precipitação, vai haver uma centrifugação. Nessa centrifugação é separado o sobrenadante, que vai ter as proteínas que não conseguiram se solubilizar. Do precipitado que vai ter as proteínas que foram insolúveis naquela quantidade de sal. Que que nós podemos fazer?

Nós podemos redissolver essas proteínas para que possamos precipitar com outro sal ou com outra concentração de sal. Um detalhe aí, por que que algumas proteínas são solúveis e outras proteínas não são solúveis naquele sal? Isso vai depender da sequência dos aminoácidos. Alguns aminoácidos conseguem tornar proteínas bem solúvel em água e outras e outros aminoácidos e outras outras proteínas que contêm uma sequência de aminoácidos bastante hidrofóbicas e torna a proteína bastante insolúvel em água, ou seja, bastante dependente da concentração de sal. E obviamente não só a concentração do sal, mas o tipo de sal também gera

uma determinada solubilidade aquela proteína. Então, quando nós conseguimos precipitar umas proteínas, mesmo essas proteínas preciptadas, se nós utilizarmos uma outra concentração de sal ou utilizarmos um outro sal diferente, distinto do que usamos inicialmente, nós podemos eh fracionar mais ainda essas proteínas, precipitar uma a outras e manter solúveis outras proteínas que foram precipitadas com o primeiro sal. Como vamos isolar essas proteínas? Então, primeiro método que vamos conhecer aqui vai ser a diálise. Então, na diálise, as moléculas das proteínas são retidas dentro de um saco. É um chamado saco dializador. A gente botou aqui um exemplo. Foi

colocado aqui as proteínas que estavam que foram eh foram separadas pelo sal, por exemplo. Então, a gente tem uma mistura de proteína e de sal. E nesse meio a gente colocou num tampão. E esse tampão em concentrações muito baixas de sal. O que que aconteceu? Essa esse saco de alisador é formado por uma membrana. Normal, normalmente essa membrana é a nitrocelulose, uma membrana semipermeável, uma membrana que deixa passar moléculas bem pequenas, mas retém as moléculas maiores. Então, nesses, nessa membrana vão passar os eletrólitos, o sal, os íons que porventura estão misturados com a proteína e

que vão passar pelo saco de alisador até atingir o seu equilíbrio com o tampão externo. Mas as proteínas não vão conseguir fazer esse mesmo trajeto, mesmo apresentando concentrações muito mais altas dentro do saco do que fora do saco, elas não conseguem manter o equilíbrio, não conseguem passar pela membrana semipermeável. E aí a gente consegue isolar aqui proteína, né? Separar a proteína ou purificar a proteína que estava misturado aqui com sizinhos. Tirando esse saco, a gente vai ter uma concentração muito maior de proteína, ou seja, uma proteína muito mais pura do que aqui estava inicialmente. Outro

método de separação também é a cromatografia. Então, a cromatografia faz o fracionamento de proteína baseado em diversas características que a gente já viu, como a carga, como tamanho, como afinidade. Então, nessa na cromatografia, a gente vai ter duas fases. Uma fase que a gente chama fase estacionária ou matriz aqui, fase estacionária, como tá marcado aqui, essa parte aqui, a fase estacionária, matriz. Por que que é chamado fase estacionária? Porque na fase estacionária não há movimento de moléculas. É como se fosse um filtro. E esse filtro ele é estável, é fixo. Nessa nessa fase estacionária, a

gente coloca a amostra. Essa amostra ela vai se mover por toda a fase estacionária. Quem vai empurrar essa essa quem vai empurrar essa amostra para que ela se mova por essa fase estacionária? vai ser a fase móvel que o reservatório da fase móvel pode ser uma solução com pH diferente, pode ser uma solução com um determinado ligante que vai se ligar na molécula da proteína que a gente quer isolar. De qualquer forma, essa fase móvel, ela é uma fase que vai auxiliar o movimento da proteína, o movimento da nossa amostra. Nós observamos que dependendo do

tipo de cromatografia, a gente vai ver algumas aqui nessa aula, dependendo do tipo de cromatografia, a gente vai ter uma separação das proteínas. Cada cor dessa representa uma um tipo de proteína com características entre elas mais semelhantes, mas diferentes, diversas entre si e que podemos separar de acordo com essas características. Podem ser tamanho, podem ser carga elétrica, pode ser afinidade por um determinado composto que tá na fase estacionária. Nós podemos assim isolar. E a gente tá vendo aqui que tem uma saída, o eluente, né, vai sair por aqui e esse eluoente vai levar as proteínas.

Dependendo das características, vai sair primeiro a proteína C. A gente pode separar num um tubo de um Lemai, um becker. Depois vai sair a proteína B, depois vai sair a proteína A e depois vai sair a proteína qualquer que seja. a gente vai conseguir separar sim as proteínas de acordo com as suas características. Primeira cromatografia que veremos nessa aula vai ser a cromatografia de troca iônica. Cromatografia de troca iônica. Então, nessa cromatografia de troca iônica, vai haver afinidade ou repulsão de acordo com a carga elétrica líquida da proteína. Então, a gente vai ter que deixar

a proteína num pH específico que torne aquela proteína positiva ou negativa para que ele possa ser atraído ou repelido pela fase estacionária. Então, a gente tem dois tipos de cromatografia de troqueiônica: cromatografia de troca cationônica e a cromatografia de troca aniica. De troca catiônica é aquela que vai atrair proteínas positivas. de troca anônicas são a cromatografia que vai atrair eh proteínas negativas. Então, nós podemos ver aqui eh a fase estacionária, essas esses círculos em negativo, fase estacionária é negativa. Então, a fase estacionária, ela vai atrair proteínas negativas, vai reter as proteínas positivas e vai repelir

as proteínas que são mais negativas do que positivas. A gente tá vendo aqui que nem a proteína não é toda negativa, não é toda positiva, mas ela é no no seu cômpito geral, ela é mais negativa ou ela é mais positiva. Então as que são mais positivas vão ser atraídas pela fase estacionárias, vão ser retidas e as mais negativas vão ser liberadas, vão passar com o eluente até serem totalmente coletadas. Depois a gente pode colocar uma solução com um outro pH que vai inverter a carga elétrica dessa proteína, fazendo com que ela seja liberada também.

a gente consegue vai conseguir separar em dois tubos diferentes, proteínas positivas, proteínas negativas, que vão ter características diversas. Segunda cromatografia é cromatografia de geofiltração. Então a cromatografia de geofiltração, ela vai se basear, o princípio dela vai se basear na exclusão de tamanho. Na exclusão de tamanho. Então a gente pode ver aqui que são colocadas uma solução com a mistura de proteínas de tamanhos diferentes. Vai passar pela fase estacionária. Essa fase estacionária, a gente pode ver que tem várias esferas. Essas esferas tem espaços entre elas. tem com tem espaços que vão fazer com que as proteínas

menores consigam ser inseridas nesses espaços. E ao serem inseridas nesses espaços, elas vão ter uma dificuldade maior ou um espaço ou um espaço maior para percorrer até a finalização da cromatografia. Isso significa o quê? que as proteínas menores elas vão se encaixar e vão ser retidas mais facilmente do que as proteínas maiores que por não se encaixarem vão seguir um caminho meio que reto. Então, nesse tipo de cromatografia, nós esperamos coletar primeiro as proteínas maiores, depois as proteínas médias e, finalmente, as proteínas menores. Então, a exclusão de tamanho é nesse sentido que as proteínas maiores

saem primeiro e depois é que saem as proteínas menores. Também temos o que chamamos de cromatografia de afinidade. Na cromatografia de afinidade, a fase fixa, né, a fase fixa, a matriz, ela vai ter um composto que vai atrair especificamente a proteína que queremos separar. Por exemplo, uma proteína que tem facilidade em se ligar o ATP. Se nós colocarmos ATP na matriz, esse ATP vai se ligar a proteína. Todas as outras proteínas vão sair menos as proteínas que se ligam a TP. Então nós podemos separar as proteínas que se ligam a TP ou a glicose ou

qualquer outro composto, colocando assim um composto que vai ter afinidade pela proteína. Como é que nós conseguiremos desligar essa proteína da matriz? a gente vai eluir ela colocando ou um sal ou principalmente colocando um ligante. Então, se nós colocarmos, por exemplo, um ligante que ATP, esse ATP ao passar por aqui, ele vai arrastar a proteína se ele estiver em maior concentração do que o ligante que está na fase estável, na fase estacionária. Então, o próprio ligante vai levar a proteína e vai separar sim as proteínas que não se ligam ao ligante, das proteínas que se

ligam ao ligante em tubos diferentes. Bem, depois de separarmos as proteínas, a gente precisa quantificar essas proteínas. Existem vários métodos de quantificação, né? Não só de quantificação, mas também de visualização, que são os métodos que coram as proteínas. Mas os métodos de quantificação, a gente tem, vou citar principalmente três, a reação do biureto, reação bastante comum, principalmente em clínica, né, em kits de análises clínicas. a reação do BCA e também o método de Laurin e os métodos de visualização de proteínas. Nós podemos citar os métodos que utilizam corantes, o comace blue e o persis, né?

Então, no método do biureto, nós podemos ver aqui eh nessa figura ao lado, no método bioreto, você utiliza cobre, cobre com seu nox mais do seu carga elétrica mais do cobre tem uma facilidade em se ligar ao reagente do biureto, que é um reagente formado pela condensação de ureia. E a ureia condensada, ela parece muito, composto formado, bioreto formado, ele parece muito com dois peptídios ligados através de uma ligação peptídica. E o bioreto reconhece, ou melhor, o cobre reconhece essa ligação peptídica formada, que é uma ligação amida. Por semelhança, o cobre do reagente do biureto,

que é o hidróxido de cobre, ele também reconhece as ligações peptídicas das proteínas. Ele é tão mais intenso quanto maior for a proteína ou quanto mais concentrada estiver a proteína no meio. Então o cobre vai reconhecer especificamente as ligações peptídicas do da proteína. Além da reação do biureto, também temos a quantificação por lore. Então, na quantificação por lor, nós temos também o cobre, só que o cobre em meio alcalina vai formar, né, vai ser reduzido para cobre mais um, vai formar um complexo, uma proteína, logo em seguida é colocado o reagente follen tiogatou em meio

alcalino. E esse complexo proteína cobre e o reagente fólice algatou vai formar um complexo azul que vai ser absorvido em 750 nanôm característico da de proteínas. Então nós podemos formar um complexo especificamente para proteína. Usando o método de quantificação pelo BCA, nós temos também aqui a proteína, também o cobre. Só que nesse caso aqui, o cobre ele vai formar um complexo, não com a proteína, mas ele vai formar um complexo com o BCA, com BCA. E esse cobre, ele vai formar um complexo com BCA desde que o cobre se transforma em cobre mais um. E

quando é que o cobre vai se transforma em cobre mais um? Quando ele se liga a proteína. Então a proteína reduz o cobre, o cobre reage com BCA e aí forma o complexo azul que vai ser absorvido em 562 nanôm. Significa que se tiver proteína, o cobre vai ser reduzido. Se não tiver proteína, o cobre não vai ser reduzido. O BCA não reage com o cobre. Bem, um outro método de separação também de proteínas, mas principalmente de visualização com relação à sua massa, né? Pode pode até servir paraa separação em alguns casos, mas não é

o melhor método para separação de proteínas. é principalmente para determinar a massa e a carga das proteínas eletroforese. As principais matrizes de eletroforia são a agarose, utilizado principalmente para DNA, e a policrilamida, que é utilizado para DNA e também para proteínas. Além disso, existe também uma eletroforese chamada eletroforese capilar. Depois que a eletroforesia ocorre na matriz, a necessidade de corar esses essas proteínas. Então, a visualização eletroforética só é possível depois de corada, no caso, DNA, brometo de etídeo, nitrato de prata ou picogreen. No caso de proteínas como a C blue, também nitrato de prata são

utilizados para corar as proteínas. Nessa figura, nós nós podemos ver como é feita a eletroforesa. A eletroforesa é feita numa câmara. Essa câmera, ela é colocada um gel, o gel de poliacrilamida ou o gel de acarose. Nesse nesse meio também é colocado um tampão para, né, gerar uma carga elétrica eh fixa. Nós podemos observar aqui que esse aparato aqui ele é ligado a uma um gerador de corrente elétrica. Esse gerador de corrente elétrica, ele gera uma diferença de potencial entre os polos negativos e o polo positivo. As proteínas vão ser colocadas aqui no polo negativo

e vão migrar para o polo positivo. Aí vocês podem perguntar: por que que proteína vai ser colocada no polo negativo? Se proteína, dependendo da sequência de aminoácidos, ela pode assumir uma carga elétrica positiva ou uma carga elétrica negativa. Veremos isso em aula posterior, que mostra que as proteínas vão ser preparadas para serem negativas, né? Nós vamos adicionar alguns reagentes que vão tornar as proteínas completamente negativas. Então, para eh impedir que nós possamos separar as proteínas baseadas em sua carga, proteínas mais negativas ou proteínas mais positivas vão separar ser separadas de forma diferente. Nós colocamos a

massa toda a proteína negativa e ela vai ser separada aqui apenas apenas pela massa molecular. Nessa imagem nós podemos ver como é que as proteínas migram nesse gel. A gente tem um gel de poliacrilamida, é uma éaranhado de um polímero de um açúcar chamado poliacrilamida, de um carboidrato chamado policiacrilamida e que esse amaranhado ele vai ser mais estreito quão mais concentrado for a policrilamida. Policrilamida 1% vai conseguir reter algumas proteínas, policrilamida 2% vai conseguir reter proteínas menores. E à medida que essa concentração aumenta, a gente consegue reter proteínas menores. Consegue, portanto, separar proteínas por diferenças

mínimas de tamanho ou de peso molecular. Mas quando nós colocamos todas as amostras com uma diversidade enorme de massas moleculares, essas proteínas vão migrar do polo negativo pro polo positivo, como a gente viu aqui. E as proteínas menores vão passar mais facilmente por essa malha, as proteínas maiores vão ser retidas por essa peneira e nós podemos assim separar ou visualizar proteínas de acordo com o seu peso molecular, proteínas menores, médias e aqui as proteínas maiores. Nesse gel de eletrofesa, a gente pode ver várias características, né, vários tipos de, é, de separação ou de purificação de

proteínas que foram visualizadas aí no gel de acarose, no gel de policiacrilamida, no caso, né? A gente tem aqui um homogenato, ou seja, depois que foi extraído o extrato bruto, depois que foi separado todas as proteínas daquela célula, daquele tecido, foi colocado no gel, correu gel. E a gente pode visualizar aqui uma enorme variedade de tamanhos moleculares de proteínas. Cada um desses dessas bandas aqui pode ter milhares de proteínas diferentes com o mesmo peso molecular. Nesse nessa outra parte aqui, no dois, nós temos a o fracionamento por sal, ou seja, nós colocamos sal, precipitamos algumas

proteínas, deixamos solúvel outra, colocamos ou a fração solúvel ou a fração que precipitou, não sei qual foi colocada aqui, para correr no gel de eletroforese e observamos que algumas dessas bandas já não mais aparecem na no fracionamento por sal, o que significa que a gente conseguiu isolar algumas proteínas, mas pode ver que a maior parte é muito parecida. Então, homogenado do fracionamento pulsal diferenciou-se muito pouco. Depois fomos aqui paraa cromatografia eh por exclusão de íons. Então, nessa cromatografia por exclusão de íons, a gente separou as proteínas positivas das negativas. Corremos aí também encontramos algumas diferenças

em relação ao fracionamento por sal. a gente tá cada vez purificando mais nossa proteína, mas aí apresentam muitas proteínas iguais ainda. Depois fizemos a cromatografia por geofiltração, exclusão por tamanho. E aí observamos uma grande redução no número de proteínas. Apenas as proteínas que conseguiram passar foram selecionadas para a o fracion para corrida no geodagarose. E finalmente a cromatografia por afinidade que a gente separou apenas aquela que se ligou na matriz estacionária. Então por que será que nós não utilizamos direto a cromatografia de afinidade? Porque a gente tem uma grande quantidade de proteínas. Então a gente

vai ter que utilizar métodos mais baratos para retirar, digamos aqui, aquelas proteínas que são indesejadas e separaras daquelas que nós desejamos para estudar. Nessa outra figura, nós podemos ver o gel de poliacrilamida propriamente dito. A gente tem aqui um marcador de peso molecular, onde a gente tem uma proteína ou várias proteínas com pesos moleculares conhecidos. Então, cada banda dessa, como a gente já conhece o peso molecular, a gente pode comparar com a nossa amostra que a gente não conhece o peso molecular e dizer que ela tem mais ou menos aquele peso molecular da banda em

que a gente colocou para comparação aqui. Células não induzidas. Depois as células induzidas pra gente poder fazer uma comparação que proteínas foram produzidas. Aqui o extrato bruto. Aqui a precipitação por sal. A gente já apresentou uma diminuição muito grande de proteínas. Aqui a exclusão de íons já diminuiu. E finalmente aqui a proteína purificada, né? Passando por todos os métodos de purificação. Lembrando que a proteína correu aí a gente não visualizou nada. Depois a gente coroou isso com o comace blue, que é o corante que vai ter afinidade pela proteína e que vai mostrar essas bandas

que a gente não tinha visto antes. Aquilo que eu perguntei para vocês, como é que a proteína vai se tornar totalmente negativa? Se a proteína, dependendo das suas da sua sequência de aminoácidos, podem ter cargas positivas ou negativas diversas. Então, a gente vai utilizar o que nós chamamos de SDS. SDS é um detergente que tem afinidade, é o dodecil sulfato de sódio, que tem afinidade pela por proteínas e que torna ou que gera uma carga elétrica negativa naquela proteína, tá? Então, SDS PE é o SDS é o detergente, é o dode deci sulfato de sódio

e o pe é gel de poliacrilamida. Então, quando nós colocamos o SDS page, nós geramos uma carga negativa em torno de toda a cadeia polipeptídica. Quando nós colocamos o mercato etanol, nós quebramos essas ligações de sulfeito que existiam entre cadeias. Então, a melhor forma de nós desnaturarmos uma proteína para que ela corra independente da sua forma. Obviamente, se a proteína, proteínas de formas diferentes, elas vão correr diferente no gel. Então a gente precisa desnaturar a proteína, a gente precisa retirar todas as ligações entre as cadeias e a gente precisa dar também uma carga elétrica negativa

para aquela proteína. Então a gente vai aquecer, vai colocar o SDS, o mercado etanol, vai retirar as pontes de de do sulfeto, carga negativa e o aquecimento vai desnaturado, deixar a proteína linearizada. colocou no gel de poliacrilamida, a carga elétrica vai fazer com que essas cadeias polipeptídicas percorram o gel de policrilamida, dependendo sua velocidade, dependendo única e exclusivamente da do seu peso molecular. Se a molécula, se a proteína tem uma carga, uma peso molecular grande, ela migra lentamente. Se ela tem um peso molecular menor, ela vai migrar mais rapidamente. Mais uma forma de separar proteínas

é a focalização isoelétrica. O que que é focalização isoelétrica? A gente colocou um gel aqui e esse gel ele vai ter uma gradação de pH, como tá mostrando nessa figura. pH9 até pH3. E aqui nós temos uma variação de 3 até 9. E as proteínas vão ser colocadas no polo negativo, vão migrar aqui pro polo positivo. E é claro que dependendo do pH dessa proteína, essa proteína vai em determinado momento, atingir o seu chamado ponto isoelétrico. O que significa ponto isoelétrico? Significa que todas as cargas elétricas daquela proteínas vão ser anuladas. Ela vai ficar com

carga elétrica nula. carga elétrica nula vai fazer com que aquela proteína não migre mais no gel. Então a proteína vai migrar, todas essas proteínas aqui migraram. Ao atingirem sua seu ponto isso elétrico, essa proteína parou. Então, nós temos aqui diversas proteínes diferentes, cada um com seu ponto iso elétrico diferente. Aqui nessa tabela nós podemos visualizar os pontos isoelétricos de diversas proteínas, como a pepsina menor que um, albumina de ovo 4,6, albumina sérica 4,9, urease 5. Mais acima aqui as proteínas básicas, químio tripocinogênio 9,5, citocromo C 10,7 e a lisozima 11. As proteínas podem ser separadas

pela focalização isoelétrica, ou seja, por variações do seu ponto isoelétrico. Mas complementando essa característica da focalização isoelétrica, também podemos fazer o que se chama de ge bidimensional ou eletroforese bidimensional. O que que significa isso? que os eh as proteínas que migraram de acordo com a variação de pH e atingir o seu ponto elétrico. A gente pode tá mostrando aqui quatro proteínas separadas pelo seu pontos elétricos, elas ainda podem ser mais separadas. Por quê? Porque nessas proteínas rosas aqui podemos ter diversas outras proteínas que tem o mesmo pontos elétricos. As azuis, mesma coisa, as amarelas, a

goiaba, mesma coisa. Então a gente pode ter diversas proteínas dentro dessa mesma banda que tem o mesmo pontos elétricos. Então a gente colocou, cortou esse gel, colocou no outro gel de policiacrilamida e agora nós tivemos eh colocamos ele no mesmo, né? e colocamos num gel de polquilam num tampão para manter o pH dessas proteínas e fizemos agora um gel normal, uma corrida eletroforética normal, na qual vai haver separação por peso molecular. Então a gente pode ver que o rosa separou aqui mais quatro outras proteínas que tem o mesmo ponto iso elétrico, mas que tem pesos

moleculares diferentes. Mesma coisa aconteceu com o azul. Separamos as proteínas por peso molecular. Depois de separar pelo pontos elétricos com amarela e também com a goiaba, mesma coisa. A gente conseguiu agora um fracionamento melhor das proteínas. Primeiro baseado no pontos elétricos e seg, finalmente baseado no seu peso molecular. Isso é o que nós chamamos de protea, ou seja, nós separamos todas as proteínas de um determinado ser vivo, de uma determinada célula, de um determinado tecido baseado no seu ponto isoelétrico, tá aqui, diminuição do ponto isoelétrico, tá aqui, aqui são os pontos elétricos maiores. Aqui são

as proteínas que t ponto isoelétrico maior, eh, menor, e também baseado no seu peso molecular, as proteínas menores. E aqui nós temos as proteínas maiores eh nesse gel de poliacrilamida. Baseado nisso, nós podemos comparar, por exemplo, perfis, perfis de expressão diferente. Então, a gente pode ter a mesma célula submetida a um determinado estress químico, a submetida à exposição a uma determinado antígeno ou uma doença. A gente pode comparar essas condições, condição um, condição dois, que proteínas são produzidas. A gente tem aqui as numerações de várias proteínas que apresentaram diferenças de expressão, dependendo da condição. Mas

um exemplo desse da utilização do gel bidimensional é quando nós encontramos, por exemplo, a produção de uma determinada proteína para uma célula tumorígena. Uma célula normal, nós temos aqui o gel bidimensional. Essa proteína aqui, ela tá sendo produzida numa eh num nível muito pequeno. Já quando o tecido apresentou um um tumor colorretal, essa mesma proteína, essas outras também, ó, nós podemos observar, mas essa daqui bem tenso mesmo, apresentou uma expressão muito maior. Então nós podemos comparar e vermos que as proteínas, né, dependendo da localização, nós podemos ver a mesma proteína e essa proteína pode ser

mais expressa ou menos expressa, a gente pode ter assim uma análise de expressão de proteínas em um tecido ou em uma determinada condição. Então as proteínas também, para finalizar a aula, as proteínas também precisam ser sequenciadas. É importante que nós saibamos a sequência de aminoácidos dessa proteína. Porque é justamente a sequência que vai gerar aquela forma. Na próxima aula nós veremos como as proteínas adquirem aquela forma tridimensional. E a importância dela adquirir aquela forma tridimensional é justamente o se a sua sequência de aminoácidos. São dois principais eh métodos para sequenciamento. O método de sangue, que

é o primeiro método, né, desenvolvido por sangue e que ele identifica apenas o resíduo aminoterminal, mas é interessante identificar o amino o o resíduo aminoterminal para que nós possamos iniciar a sequência de aminoácidos. Então ela é útil na determinação do número de cadeias polipeptídicas de uma proteína. Então, a gente pode determinar qual a sequência, ou melhor, qual o número de cadeias daquela proteína, mas nada mais além disso. Também temos a degradação de Edman, que vai determinar cada um dos resíduos. A gente vai ver mais detalhes agora. Então, em cima nós temos o método de sangue.

Sang utilizou esse derivado aqui, FDNB, que é o derivado 24 de nitrofenila. Ele se liga ao resíduo N terminal, tá aqui ele. E ele vai identificar depois que a gente é depois que ele se liga ao resíduo terminal, ácido clorídico 6 molar vai quebrar esse resíduo terminal com o derivado e ele vai, obviamente, ele vai quebrar toda a proteína, vai liberar vários aminoácidos, mas apenas o último aminoácido é que vai est ligado esse derivado 24 de nitrofenila, determinado resíduo aminoácido. a gente consegue identificar qual é o resíduo que está ligado a o derivado FDNB. Segundo

método ou método ou degradação de edma. Na degradação de edma ele utiliza também um derivado fenil isotilcianato em meio ao calino. Ele se liga também um resíduo n terminal eh em meio com o ácido tricloroacético, né? O ácido, aliás, o ácido trifluo acético. Esse ácido trifluocético, ele vai quebrar um resíduo terminal. vai liberar o derivado, depois vai ser acidificado o meio, ele vai se restabelecer, vai se reestruturar o derivado. No caso é um derivado fenil e dantoína do fragmento, né, do fragmento de tirosina ou de lisina ou de qualquer que seja, ele vai ser identificado.

E esse composto fenil iso tiocianato, ele vai se ligar ao próximo aminoácido que se tornou agora um resíduo n terminal, tá? Então, por esse método, dá para sequenciar até 50 resíduos de aminoácido. Então, para sequenciar até uma proteína, uma proteína com 50 aminoácidos. Mais uma vez, degradação de eda. A gente pode ver aqui, nós temos cinco aminoácidos. O aminoácido N terminal é marcado. Depois aí ele é quebrado, liberado, quantificado. O derivado liga agora ao segundo aminoácido, que agora é o n terminal. Identifica depois é o terceiro, depois é o quarto e depois é o quinto

e identifica todos os aminoácidos na sua sequência. OK? Para sequenciar proteínas maiores, como é que nós fazemos então para sequenciar proteínas maiores? Já que a degradação de Étima só consegue sequenciar até 50 aminoácidos. Então, para sequenciar proteínas maiores, a gente vai ter que fazer meio que a montagem de um quebra-cabeça, né? Então, inicialmente nós podemos utilizar a reação do FNDB para identificar qual é o N terminal. Então, a gente consegue determinar qual é o aminoácido N terminal. Posteriormente, nós podemos utilizar vários eh várias formas de degradação, como por exemplo a tripsina. Tripscina vai gerar quatro

fragmentos de proteínas. Cada um desses fragmentos vai ser utilizado pela degradação de Etma para conseguirmos encontrar a sequência desses aminoácidos. Também utilizamos aqui o brometo de canogênio. Gerou mais três fragmentos. também iremos sequenciar pela degradação de Edma. Posteriormente nós iremos montar esse quebra-cabeça, já que a gente tem a sequência de quatro fragmentos e aqui de três fragmentos. As sobreposições vão nos dizer, né, obviamente a gente já determinou qual é o aminoácido N terminal pelo método de sangue. Então o aminoácido n terminal, esse aminoácido de glutamina, né, ácido glutâmico, melhor dizendo. E depois os outros aminoácidos

vão ser as outras se a outra a sequência de todo o resto da proteína é determinado pela sobreposição dos eh fragmentos que foram sequenciados. Então é meio que uma montagem de um quebra-cabeça. Também podemos eh encontrar algumas informações importantes das proteínas utilizando a espectrometria de massa. Na espectrometria de massa, a proteína ela vai ser ionizada, ela vai ser recoberta com carga elétrica, né? Vai ser vai ser inserida carga elétrica na proteína. E essa carga elétrica, ela vai ser proporcional à massa da proteína. Então, se a massa da proteína adquiriu aqui 51 um cargas positivas, essa

outra aqui que é maior adquiriu 52, essa outra que é menor adquiriu 50. Então, a carga elétrica vai ser proporcional a o peso molecular da proteíne. Então, todas essas proteínas vão ser colocadas num analisador de massa e elas vão migrar de acordo com a sua carga elétrica. carga elétricas carga elétricas eh menores estão migrando mais rapidamente, carga elétricas maiores estão migrando mais lentamente. E a gente pode assim fazer eh gráficos intensidade em função da característica massa carga, né? A gente pode separar e o próprio sistema poderá e transformar isso em massa molecular, né? No caso

aqui, a gente pode identificar uma massa molecular de qualquer tamanho, né? No caso aqui, um exemplo, 46.000. Aqui nós temos uma um gráfico mostrando a espectometria da insulina e da beta lactoglobina, né? insulina e beta e beta lactoglobina com suas massas diferentes, obviamente também proporcionais a sua massa. Então, na verdade isso aqui é uma relação massa carga que vai, né, dar um gráfico que poderá determinar sim a diferença entre os e suas massas moleculares. Também podemos fazer o que se chama de sequenciamento indireto. Então a gente pode sequenciar uma proteína baseado na sequência de na

nucleotídeos. Então, de acordo com a sequência de nucleotídeos, de acordo com a sequência genômica do gene, nós podemos assim determinar sequência de aminoácidos. Nem sempre isso poderá ser feito. Muitas vezes as proteínas elas são traduzidas, mas elas sofem sofrem um processamento pós-traducional. aquela proteína vai sofrer arranjos, até mesmo cortes, retiradas e que isso nem sempre vai ser vai indicar que a proteína nativa, a proteína funcional, vai ter aquela sequência. Então, gente, esse é o final da nossa aula sobre eh aminoácidos, aminoácidos dois. A próxima aula nós entraremos nas proteínas propriamente ditas, nas propriedades das proteínas,

como é que as proteínas adquirem suas formas e o que que a forma, qual a forma dela, qual a forma, qual a relação entre a forma e a sua função e quais as estruturas mais encontradas nas principais proteínas. Muito obrigado pela atenção e até a próxima aula.