Cromatografia Líquida de Alta Eficiência - Princípios de CLAE (aula 2)

que a gente está observando nesses dois gráficos a relação entre a altura de cada prato teórico com a velocidade linear média da fase móvel quando a gente trabalha com Face acionária com partículas pequenas até 5 micrm a gente observa que existe uma faixa né pequena de velocidade linear linear média da fase móvel que eu devo Trabalhar onde H é mínimo por que que eu quero um h mínimo para ter máxima eficiência e o que são esses parâmetros A B e C estão na relação entre eficiência e velocidade da fase móvel a gente tem efeito dos

múltiplos caminhos difusão molecular e resistência e transferência de massa e o que são essas coisas o efeito colocado como a letra A efeito dos múltiplos caminhos é o seguinte ele tá acionado com a diferença nas trajetórias de difusão da fase móvel e a fase móvel leva os analitos tá devido a trajetórias diferentes simplesmente um fenômeno aleatório a molécula ela pode junto com a fase no percorrer diferentes caminhos ainda empacotamento de coluna precária o que que é empacotamento precário então vocês Imaginem uma faon Ária composta por partículas bem pequenas um pó tá E essa façon Ária

sólida tem que estar dentro de um tubo que é a coluna vocês Imaginem um tubo de ao inox com dimensões de uma caneta BIC tá lá dentro ela tem que tá totalmente preenchida com essa facona sólida a gente chama isso de empacotamento esse material tem que tá bem empacotado ali dentro para que não haja falhas como tá mostrando aqui se a gente se o empacotamento não foi adequado a gente h a gente tem espaços vazios e um caminho preferencial isso faz com que haja alargamento do pico tá que que é um pico ideal um pico

bem Estreito as moléculas do analito entram todas juntas no momento da injeção no momento da detecção quanto mais espalhadas essas moléculas estão maior é o alargamento do pico então isso aqui pode promover o espalhamento das moléculas ao longo da coluna além de falha no empacotamento o que pode acontecer também é se eu tiver partículas de tamanho diferent se eu tiver partículas de tamanho diferentes eu também posso ter um caminho preferencial difusão longitudinal difusão longitudinal é uma coisa que sempre vai acontecer e quanto mais tempo o analito fica dentro da coluna quanto maior é a sua

retenção mais a gente observa esse fenômeno se a gente tiver um cromatograma com muitos Picos é comum a é comum a gente observar Picos bem estreitos no início do cromatograma e Picos mais largos no final porque substâncias que saem por último na coluna que passam mais tempo dentro da face da coluna A gente vê mais espalhamento da banda Eu costumo fazer uma comparação bem boba que que é assim é como se a gente tivesse uma corrida de 100 m e uma maratona numa corrida de 100 m que um intervalo bem curto de espaço a diferença

de tempo Entre a chegada do primeiro colocado medalha de ouro e último colocado é muito pequena certo basicamente para nós ris Mortais todos eles chegam ao mesmo tempo ideia alguma coisa hoje em dia né em torno de 9 segundos tá quando a gente tem uma maratona que é uma distância enorme a gente tem um espalhamento absurdo entre os competidores a gente tem os atletas de ponta que chegam primeiro a gente tem os retardatários né que que chegam por último aquela grande massa no meio mas tem um espalhamento gigantesco porque o percurso é muito grande Tá

então a difusão longitudinal é um é um evento aleatório e vai ã acontecer em maior escala quanto mais tempo aquela substância ficar dentro da coluna e uma outra coisa que pode acontecer que é representado pela letra C chama resistência a transferência de massa então vocês reparem que aqui olha essa essa aqui a gente tem a representação das partículas que compõem a face estacionária e aqui a gente teria ou um espaço entre as partículas ou um poro dentro de uma partícula tá então a gente pode dizer que a molécula que passa mais próximo da parede da

face estacionária ou seja dentro de um poro ou seja na superfície externa ela vai interagir com essa fase áa mais fortemente vai demorar mais para sair desse poro por exemplo a molécula que passa aqui no meio tá ela vai estar mais distante ela vai interagir menos ela vai sair mais rápido basicamente é isso então umas vão percorrer numa velocidade outras vão percorrer em outra velocidade e aí o que que a gente observa alargamento do pico Então são esses três fenômenos que promovem o alargamento do pico e podem estar em maior ou menor grau dependendo da

qualidade da minha face estacionária isso aqui é um cromatograma ideal o que que esse cromatograma ideal está me dizendo que todas as moléculas da substância A chegaram ao mesmo tempo no detetor tá só que não é isso que a gente observa a gente observa tá um pico um pico com formato de uma distribuição normal uma curva de gaus ou seja a maioria chega aqui nesse tempo mas uma parte chega nesse tempo outra parte chega nesse tempo uma menor parte chega nesse tempo e assim por diante E aí a gente tem a relação de cada um

na equação a influência do primeiro parâmetro tá a influência do segundo parâmetro do terceiro parâmetro tudo isso combinado A gente tem a curva a curva da equação de inter tá onde a gente tem um mínimo aqui que é o fluxo que a gente deve trabalhar quando a gente trabalha com hplc Ok para que a altura de um prato teórico seja mínima ou seja para que a gente atinja atinja a máxima eficiência na cromatografia a gente pode fazer a separação com dois objetivos o mais comum é uma separação analítica quando a gente quer identificar ou quantificar

as subst presentes numa amostra Mas eu posso ainda querer fazer uma separação preparativa Tá o que que é uma separação preparativa é quando a gente quer isolar uma determinada substância de uma m cografia analítica eu uso colunas menores é um injeto microlitros quando eu faço cromatografia preparativa eu tenho que usar colunas maiores quando eu tenho um cromatograma Eu tenho dois parâmetros que me auxiliam na análise qualitativa e na análise quantitativa na análise qualitativa o parâmetro cromatográfico que me dá informação é o tempo de retenção uma substância numa determinada condição cromatográfica sempre vai ter o mesmo

tempo de retenção só que o tempo de retenção ele não é um parâmetro absoluto Ou seja eu não tenho certeza da identidade daquela substância apenas com tempo de retenção tempo de retenção não é uma propriedade físicoquímica não é como densidade ponto de fusão de ebulição tá porque uma outra distância naquela mesma condição pode ter o mesmo tempo de retenção Mas dependendo do meu problema esse tempo de retenção pode me ajudar muito por exemplo se eu trabalho no controle de qualidade Dea Indústria Farmacêutica onde eu tenho um universo ali restrito e mais ou menos controlado dar

o tempo de retenção com a minha da minha amostra com tempo de retenção de um padrão e afirmar com mais ou menos certeza de que aquela substância na minha amostra que tem aquele tempo de retenção igual ao padrão é o padrão orora se eu tiver trabalhando com Eu tenho um eu sempre cito esse exemplo tá eu tenho porque nunca esqueço eu tenho uma amiga que já trabalhou com carrapato de vaca eu não me lembro não me lembro o que que ela analisava no carrapato de vaca mas ela trabalhava com carrapato de vaca vocês imaginam a

complexidade de uma amostra como essa biles de peixe também já trabalhei no laboratório que tinha um pessoal que trabalhava com bilhas de peixe tá é uma amostra muito complexa pode ter qualquer coisa porque o peixe pode se alimentar de maneiras diferentes em cada momento que ele for coletado E por aí vai tá então não posso afirmar Com certeza tá Para que eu tenha certeza da identificação usando cromatografia eu tenho que ter um detetor que faça isso para mim como um espectrômetro de massas por exemplo se eu tiver um hplc associado a um espectrômetro de massas

aí sim eu posso fazer uma análise qualitativa com mais certeza o parâmetro quantitativo na cromatografia fia é a área do pico Por que que eu não uso altura justamente porque eu tenho um alargamento dependendo da minha condição experimental a minha coluna vai ficando velha e tudo mais o pico vai alargando com o tempo então se eu uso área eu não preciso me preocupar com essa variação Ok então a área ela é proporcional à concentração do analito da amostra depois a gente vai ver como a gente usa a área para fazer análise quantitativa bom isso aqui

é um resumo da outra aula tudo isso aí a gente viu na aula passada e terminamos hoje e vamos começar hoje a falar da cromatografia líquida de aeficiência propriamente dita quando a gente falou de eficiência eu falei algumas vezes que para que a gente tenha uma coluna eficiente eu preciso ter partículas pequenas mas vocês Imaginem lá a experiência do Botânico Russo que que trabalhou com carbonato de cálcio dentro de uma coluna de vidro e que ele fez a fase móvel passar por essa coluna pela força da gravidade eh a gente pode numa coluna dessa clássica

usar por exemplo uma bombinha de aquário para fazer a fase móvel passar por uma vazão mais ou menos controlada mas se eu tiver uma fase est estacionária com partículas cada vez menores mais difícil vai ficar vai vai ficar a passagem desse líquido Porque quanto menores as partículas men men a quantidade de espaço vazio é igual a comparar Barro com areia Por que que na praia não faz poça porque os grãos de areia são grandes e no barro faz porque as partículas são pequenas e a O que acontece se eu tenho que para melhorar a eficiência

usar partículas cada vez menores eu vou precisar usar o quê uma bomba Então o que cariza uma cromatografia líquida de alta eficiência é justamente a utilização de partículas pequenas de no máximo 10 micrômetros Hoje em dia a gente não chega a cinco tá e bombas que operam em a pressões de até 500 atmosferas embora a atmosfera não seja uma unidade comum para expressar pressão em cromatografia a gente coloca aqui atmosfera para vocês terem uma ideia ã da ordem de grandeza disso o o o que significa né 500 atmosfera Qual é o pré-requisito para que uma

amostra seja analisada por hplc por que que a gente coloca isso na segunda linha tá porque a cromatografia em fase gasosa é um tipo de cromatografia a cromatografia em fase gasosa de alta eficiência ela veio primeiro a cromatografia surgiu com a cromatografia líquida lá com Botânico Russo mas a de alta eficiência começou com a cromatografia gasosa por quê Por causa disso aqui a gente demorou tempo para conseguir ter fases estacionárias com partículas pequenas e que fossem resistentes à Alta Pressão Ok então a cromatografia de alta eficiência começou com a cromatografia gasosa que tem um uma

restrição muito significativa Qual é a restrição para que uma amostra seja analisada por cromatografia em fase gasosa a minha amostra ela tem que ser volátil eu tenho que volatilizar a minha amostra para que ela seja arrastada pelo gás que é a fase MV é uma restrição muito significativa eu não posso analisar por exemplo polímeros não posso analisar S não posso fazer troca iônica por cromatografia gasosa tá na cromatografia líquida a única único pré requisito é que a amostra seja solúvel na fase no tá Eu só não analiso gases por hplc também não preciso porque para

analisar Gá eu tenho CG Ok por que que eu analiso o gases porque o o gás se eu introduzir um gás na minha fase móvel líquida o que que eu vou observar variação de pressão Porque o gás vai tá dissolvido no líquido mas a tendência é que ele saia uma vantagem da de hplc em relação a CG é que permite qualquer mecanismo de separação daqueles que a gente estudou adsorção e partição que são os mais comuns troca iônica exclusão de tamanho e bioafinidade ainda ficou faltando aqui bioafinidade eu não posso fazer por CG imagina analisar

proteínas por CG eu tenho que aquecer e volatilizar a minha amostra eu preciso utilizar solventes especiais e ultra puros como fases móveis a gente tá acostumado a lidar com solvente grau analítico ou solvente pa certo em HPC a gente não usa solvente pa a gente usa um solvente com com grau de Pureza ainda maior chamado solvente grau hplc e por isso ele é bem mais caro tá eu ainda preciso ter detetores seletivos e super sensíveis com tamanho de célula de detecção menor que 10 micol então o detetor mais comum para hplc é o UV visível

então a gente lembra do V visível aquele da cubeta certo só que aqui a minha célula de detecção que é uma detecção em fluxo a fase móvel fica passando o tempo todo ela tem um volume interno menor que 10 micol aqui a gente tem ã os tipos de cromatografia tá a gente já falou disso na na outra aula mas para relembrar a gente pode ter cromatografia por adsorção quando a fase estacionária é um sólido a gente pode ter ã quando a gente tem cromatografia por adsorção a gente pode ter adsorção química e adsorção física tá

e se eu tiver um equipamento em que eu consiga controlar a temperatura da coluna ou seja se a minha coluna Estiver dentro de um forno Porque existe equipamentos que a coluna fica no ambiente e tem equipamentos que a coluna fica dentro de um forno quando tá dentro do forno eu consigo controlar quando eu aumento a temperatura eu favoreço a adsorção química se eu favoreço adsorção química eu favoreço a adsorção eu aumento o tempo de retenção agora quando eu falo em aumentar a temperatura em hplc não é aumentar para 100 150º é trabalhar ali na faixa

dos 30 e 40 tá Por que que eu tô falando isso porque a gente sempre compara com CG quando a gente fala em temperatura da coluna em CG em cromatografia gasosa a gente tá falando de variar de 50 a 350 aqui não tá é um detalhe aqui a gente tem alguns exemplos de Fases estacionárias utilizadas em cromatografia de absorção a sílica é mais comum Alumina florisil carvão e carbonato de cálcio carbonato de cálcio nosso Botânico lá em 19 06 já utilizou tá só para vocês terem uma ideia tá isso aqui é o florisil essa aqui

é sílica olha aqui aqueles grupos polares grupos polares que eu falo o tempo todo tá lembrando que isso aqui é uma estrutura tridimensional a base disso aqui deve ser um tetraedro aqui a gente tem carvão ativo tá que tem na sua superfície é diferentes grupos funcionais por isso que a gente usa carvão ativo no filtro caseiro né para água potável porque retém diferentes tipos de substâncias por adsorção e aqui a gente tem fases móveis utilizadas em cromatografia por adsorção se eu utilizar água tá como se a minha face estacionária for sílica por exemplo eu não

vou ter uma boa separação porque a água também é polar e é muito polar então o que que a água vai fazer dier com os analitos retidos na sílica vai arrastar todo mundo muito rapidamente Ok então a gente costuma dizer que a água é um eluente muito forte se eu tiver trabalhando com sílica eu quando eu trabalho com Fes estacionárias de adsorção que tem eh caráter polar Eu costumo trabalhar com ã fases móveis menos polares ou apolares aqui a gente tem uma representação Zinha da partícula de sílica h interagindo mais fortemente com os analitos polares

e menos com os analitos apolares esse vai sair primeiro esse vai ficar mais tempo retir de uma maneira geral uma cromatografia por adsorção ela não tem uma seletividade tão boa tá a gente usa muito frequentemente para fazer uma préparatifs vai em função da polaridade E aí eu Posso coletar cada uma dessas frações e fazer uma segunda separação numa coluna Apolar na cromatografia de partição aquela em que a fase estacionária é um líquido o que a gente tem é um equilíbrio de solubilidade tá a substância que for mais solúvel na facee Sonara líquida fica mais tempo

retida que for menos solúvel é arrastado pela fase móvel Ok e o que que a gente tem se eu tenho uma cromatografia de partição clássica tá esse líquido ele está simplesmente depositado sobre as partículas do suporte sólido e o que que eu observo eu observo que esse é um sistema de baixa estabilidade porque eu tenho a fase estacionária líquida aqui e a fase móvel passando ali o tempo todo então a fase móvel é ela pode arrastar além dos analitos a própria fase estacionária Ok então hoje o que a gente obtém mais eh frequentemente ou quase

todas as as colunas de partição é uma Face soná quimicamente ligada ao suporte sólido tá esse sistema é de alta estabilidade as colunas que a gente usa hoje em dia são todas assim tá e de novo a fase móvel tem que ter polaridade contrária Lembra quando eu falei da sílica quando eu uso sílica fase estacionária polar água não é um bom eluente porque vai arrastar todo mundo muito rápido tá se eu tô utilizando ã uma cromatografia de partição A ideia é a mesma se a Face sária for polar eu vou usar uma fase móvel pouco

polar ou apolar se a facee estacionária for ap Apolar eu vou usar uma fase móvel polar lembrando o seguinte se eu quero separar substâncias polares eu escolho trabalhar com uma Face estacionária polar por quê Porque tem que ter interação se não houver interação analitos fase estacionária não tem separação se eu quiser separar analitos a pooles ou de baixa polaridade eu vou escolher trabalhar com uma fase estacionária Apolar aqui a gente tem a representação de uma coluna ã c18 por exemplo aqui uma cadeia carbônica com 18 carbonos essa representa a c18 tá aqui ó essa representação

ela não tá muito fiel porque olha esse esses sítios ativos da sílica tá eles não são totalmente ocupados sempre H sítios ativos eh sítios silanóis residuais tá que podem interferir na minha separação a gente vai ver isso daqui a pouco ok então substâncias apolares ficarão mais fortemente retidas e as polares vão ser Elías primeiro se eu tiver uma Face solária desse tipo ã aqui eu vou introduzir do duas definições tá a definição de fase normal e a definição de fase reversa fase normal é quando a fase estacionária é polar por que isso Tá Mas as

as fases quimicamente ligadas que pode ser uma fase líquida como a c18 elas são ligadas num suporte com a sílica então o suporte original a a característica original daquele daquela daquele sólido é polar ser polar tá então tudo que é polar a gente chama de fase normal quando a gente reverte a polaridade dessa superfície Ou seja quando eu tenho uma fase sária a polar eu chamo de fase reversa tá então quando eu tenho uma fase sária polar ou seja quando eu tenho fase normal ã aqui ó Amino ciano deol eu procuro trabalhar com fases móveis

apolares ou pouco pooles se eu tiver fase reversa ou seja fase estacionária Apolar tá a c18 é a mais famosa delas Cadê 18 oct deil essa daqui tá eu vou trabalhar com solventes polares Quais são os três solventes mais utilizados com a C1 água etanol e a srila e a combinação entre eles aplicações inúmeras aplicações tá C temi algumas aqui hidrocarbonetos aromáticos óleos esteroides plásticos polímeros alcaloides ácidos urinários carboxílicos sulfonamidas hormônios ocor e por aí vai então fase normal fazer Versa já falei tá aqui agora os slides colocando todo o texto aí bonitinho tá fase

normal significa que a fase estacionária é polar e a fase móvel é a pool ou pouco polar e a fase reversa a fase estacionária é AOL e a fase móvel polar aqui um exemplos né quando a gente usa quando a gente usa fase normal ã exemplo de Fases móveis eano isoctano tá e quando a gente usa fase reversa metanol água cit trila a gente falou de fase normal fase reversa Em algum momento lá atrás eu já falei de força diluição mas eu vou falar agora de novo que que é eluição a eluição é o deslocamento

do soluto da fase estacionária pelo solvente e o que que esse solvente faz essa fase móvel faz alguém me perguntou isso lá nos exercícios o solvente ele próprio ocupa o sítio ativo tá então se eu tiver Deixa eu ver se eu consigo fazer isso aqui se eu tiver uma fase estacionária polar ou seja fase normal significa que eu quero separar analitos polares os analitos vão ficar aqui retidos nessa fase acionária OK n Lito polar vai ficar retido ali a minha fase móvel tá passando aqui ela fase móvel ela vai promover a eluição desse cara aqui

quando ela conseguir tirar esse cara daqui certo e passar ocupar o lugar dele tá então eu vou tirar vou deslocar o ananita do sítio ativo e a fase móvel passa a ocupar o lugar dele e quando quando é mais fácil para ela fazer isso quando ela também for polar é um sítio ativo polar então se eu tenho uma facee estacionária polar a minha fase móvel ela vai ser mais forte quanto mais polar ela ela for ela vai promover a eluição mais facilmente quanto mais polar ela for quanto mais polar ela for quanto mais forte ela

for menores serão os tempos de retenção área Apolar significa que os analitos estão interagindo por sítios ativos apolares o analito menos polar ou mais Apolar é o que vai ficar mais fortemente retido Então minha facee estacionar áa para concorrer por esse sítio ativo mais facilmente ela tem que ser também Apolar ou pouco polar Ok a quanto menos polar ela for mais forte ela vai ser mais facilmente ela vai promover a eluição agora isso não significa que isso seja bom tá um eluente muito forte não necessariamente é bom Por quê se ele é muito forte ele

vai eluir todo mundo muito rapidamente funcionária polar a fase móvel mais polar é mais forte por isso que eu não uso por isso que eu prefiro usar eu tenho que usar um uma fase móvel de polaridade contrária Para quê Para que haja tempo da Separação acontecer senão a eluição vai ser muito rápida se eu fizer aqui um resumo deixa eu ver se tem aqui o eluente ele vai ser mais forte quanto mais semelhante ele for a Face acionária se a Face acionária for polar quanto mais polar mais forte se a face estacionária for Apolar quanto

menos polar mais forte ok aqui na quando eu tenho fase normal uma fase estacionária polar se eu utilizar uma fase forte uma fase móvel forte uma fase móvel também polar eu não tenho separação porque essa esse elente ele vai ser tão forte que ele vai arrastar todo mundo muito rápido e muito junto não vai haver separação então eu não necess quer uma eluente muito forte justamente quando eu tenho fase avsa quando eu tenho fase estacionária Apolar a minha fase móvel tem que ser polar porque se for Apolar também ela vai ser tão forte que vai

arrastar os analitos muito facilmente não vai haver separação esse slide fala de tudo que eu já falei né só que escritinho aí com resumo por exemplo aqui se eu tiver uma Face estacionária polar a água vai ser mais forte queano por isso que em geral eu uso exan e não água tá se eu tiver uma facea Apolar o exan vai ser mais forte que a água difícil dificilmente vou utilizar exan como um eluente para Face estacionária Pool ele vai ser muito forte ok aqui eu tenho uma um exemplo só que aqui não tá escrito em

lugar nenhum vocês vão me dizer se eu tô usando fase normal ou fase reversa não tá dizendo qual é a fase estacionária tá dizendo o seguinte seguinte eu tenho uma mistura de três substâncias que primeiro eu separei come essa fase móvel 50% metanol 50% água depois eu aumentei o teor de água Ok 30 de metanol 30 de água ou seja aumentei a polaridade da fase móvel e a força aumentou ou diminuiu aumentou que que a gente observa os tempos de tensão diminuíram a eluição foi mais rápida Então essa fase aqui foi mais forte se eu

tenho uma fase móvel mais forte sendo mais polar significa que era fase normal ou fase reversa a fase móvel mais forte foi a mais polar Então significa que a fase estacionária é polar Ok quanto mais parecido for mais forte é vamos lá ã agora a gente vai falar de um de dois de outros conceitos importantes tá a gente tem aqui a separação de três substâncias usando metanol e água em coluna c18 eu obtive esse resultado aqui e aí eu quero separar mais esses dois primeiros eu quero usar um eluente mais fraco eu quero tornar minha

eluição mais lenta Ok então eu vou aumentar o teor de água porque trata-se de fase reversa Ok aumentei o teor de água certo Tornei a minha eluição mais lenta porque a minha fase móvel ficou mais fraca se eu continuar fazendo assim vou ter essa sequência de resultados eu pergunto para vocês o que eu faria se eu quisesse ter essa separação aqui entre esses dois Picos que sair primeiro Mas eu não quero gastar 9 minutos para fazer uma análise Não quero gastar 10 minutos para separar três Picos eu quero trazer esse pico para cá que que

eu poderia fazer para resolver isso aí eu atingi a separação que eu queria para esses dois primeiros Picos aqui mas eu não quero que uma análise para separar três substâncias demore 10 minutos eu quero manter essa separação aqui mas trazer esse pico mais para cá então o que que eu posso fazer eu posso alterar a composição da minha fase móvel ao longo da mesma corrida cromatográfica quando eu uso a mesma composição de fase móvel durante toda a corrida CR gráfica eu faço uma eluição isocrática se eu quiser variar a composição da fase móvel ao longo

da mesma corrida cromatográfica eu faço gradiente de eluição se eu tiver trabalhando com metanol e água por exemplo eu vou ter um frasco de água um frasco de metanol ambos previamente filtrados de gaseificados já acoplados ao sistema e a gente vai fazer tudo automaticamente através de uma programação a gente esa os equipamentos hoje por software a gente vai dizer que a gente quer por exemplo fazer esse Gradiente aqui um Gradiente que começa com 50% de metanol ou seja começa nessa condição aqui OK e ele vai aumentando o teor de metanol ou diminuindo de água ao

longo da corrida ou seja eu vou aumentando a força ao longo da corrida cromatográfica eu aumento de 50 até 90 e depois Mantenho um constante esse platô aqui nem sempre é necessário tá mas olha o que eu obtive os dois primeiros Picos separados e a corrida demorando menos que 5 minutos eu antecipei o último pico porque eu aumentei a força diluição ao longo da análise Gradiente diluição ele é sempre feito no sentido crescente da força tá se eu falar em termos de polaridade isso vai depender se eu tiver trabalhando com fase norm faz reverso Mas

se eu falar só de força a força de lução sempre cresce num Gradiente não faz sentido eu trabalhar com eluente forte no início e diminuir porque se ele tá forte no início ele já vai arrastar todo mundo no começo da corrida para que no no início do cromatograma eu tenha um eluente fraco tá Para que aquela quem quem é que sai primeiro quem sai primeiro são as substâncias que interagem menos com a face acionária certo então eu tenho que usar um eluente mais fraco para promover a separação para as substâncias que interagem mais fortemente aí

eu uso um elente mais forte para antecipar o tempo de retenção É isso que eu tô fazendo quando eu faço esse Gradiente isso