Cromatografia Líquida de Alta Eficiência - Introdução à Cromatografia (aula 1)

é bom a coreografia Ela surgiu como técnica definida por conta de um Botânico uso chamado Mikhail semyonovich a antes dele vários experimentos já tinham sido feito na época a aquele batizou a técnica Ele publicou em 1906 Dois artigos na revista muito importante na sua arma área de botânica descrevendo Os experimentos que ele fez com extrato de planta a e ele testou vários sólidos que mais de 100 olhos Como faz acionária E verificou que o carbonato de cálcio o que promoveu o melhor separação e amostra dele era um extrato de plantas que já mistura de pigmentos

e isso foi 1906 tá e o que que ele observou então ele preencheu uma coluna de vidro com um sólido nesse caso aqui carbonato de cálcio aplicou a mistura que ensina e depois fez passar o solvente ou a fase móvel que aqui no caso sai atende petróleo tá E aí ele observou como ele tava separando pigmento de planta Clorofila Champion filetado mais ele visualizou aí substâncias sendo separadas por causa da cor eles vêm natureza Amar não é a maioria das substâncias que são coloridos né Acho que os conta disso Ele batizou a técnicas como cromar

o programa de coreografia de escrever tá e a partir de então a técnica passou a existir como técnica de separação então aqui a gente tem uma outra representação agora já de cromatografia em coluna porque tanta pergunta ver que em papel quando a fotografia em camada delgada a gente chama de alguma coisa fia tô na aqui a gente tem a tomografia em coluna na cromatografia planar o líquido sobe por capilaridade na cromatografia em coluna o líquido deve-se nesse caso aqui tá líquido desce pela força da gravidade que linda Ah não tem uma coluna de vidro preenchida

com uma funcionária sólida aplico amostra aqui em cima e faça ocorrer eu sou velho a cromatografia é basicamente uma técnica de separação mas eu também posso fazer a mais qualitativo e quantitativo isso vai depender de que do desse e o que é que eu vou colocar aqui embaixo para fazer detecção então aqui a gente tem licitação da conta da tia clássica Imaginem que eu vou trocando tubo aqui a cada 1 ml ou a cada um minuto eu troco de tubo aqui a cada minuto e cada tudo desse eu faço a leitura no espectrofotômetro espectrofotômetro é

visível é um detector mais comum em hplc e ele acabou nada nenhum sinal tubo 2 nada nem um sinal e finalmente na sequência dos tubos eu vou gerando o meu cromatograma a cada pico desse aqui representa a saída de uma substância A substância ah certamente essa daqui que tá o primeiro ok a substância você aqui Demorou mais para sair essa daqui interage é fortemente o fácil acionária Ok bom a cama com a grafia é um físico onde tem que fazer estacionária e pode ser um sólido um líquido e uma fase móvel que pode ser um

líquido e um gás ok é tão aqui a gente tem uma outra representação uma amostra contendo substâncias azuis e vermelhas tendo introduzidas na coluna ao longo do percurso na coluna na faixa acionar elas vão se preparando se separam de faca e vão ser detectadas aqui um momento diferente Ok e como é que acontece essa decoração aí substância dela de migram através da coluna em velocidades diferentes e por que que elas miram em velocidade diferente porque elas vão interagir de maneira diferente com a fase estacionária principalmente e pode fazer nosso mais uma ilustração então aqui é

o instante da ingestão quando eu introduzo a minha mostra na coluna aqui apresentando a separação é como aquele interagindo as partes gente passa acionária e o fenômeno de eles são uma substância saindo depois da outra a quem a cromatografia pode ser classificada como cromatografia a em fase líquida e fotografia Fábio gasosa é a principal para ficar com uma tomografia nosso curso trata de fotografia em fase líquida onde a fase móvel é um like a ela pode ser também cromatografia em coluna ou planar como eu já falei ela apaixonada pode estar numa coluna ou assinada pode

estar num plano do nosso curso prático de fotografia em fase líquida em coluna Oi e a gente pode ainda classificar a cromatografia quanto aos mecanismos de separação mas são as características físico-químicas da fase estacionária que vão promover a separação então a gente tem aqui a dissolução cartão troque ônibus que vão de tamanhos bioafinidade as mais frequentes são cromatografia de acção e partição fotografia de autor tão a minha fase secundária é um sólido na cromatografia de partes estão a minha fracionária é um líquido a aqui na cama cobrança de troca iônica e eu uso para separar

iam nas cruzam de tamanho eu separo moléculas tamanho e navio afinidade eu uso para separar moléculas que tenham características específicas biológicos a gente vai ver o tanto que a gente tem uma ilustração fotografia de arte portão passa acionária sólida com a separação acontece porque as moléculas ficam mais ou menos absorvidas na superfície desses óleos que compõem a funcionar E aí quando a gente fala de cromatografia líquida de alta ele tem a gente tem que tentar e quanto mais dividido quanto mais Desculpa quanto mais finamente dividido por essa história que compõem a funcionária quanto menores forem

as partículas maior a quantidade de sítios ativos de Assunção e expostos quem E aí eu melhoro muito a qualidade da minha separação a gente vai com calma mais tarde Ei então aqui um sol e o serviço do sólido a molécula interagindo na sua crista história na cama cobrir aqui de partição a minha fase estacionária é um líquido mas Professor uma fase estacionária pode ser um livro sim de alguma maneira este líquido tem que estar a sobre um suporte sólido Ok não exemplo fácil da gente imaginar por exemplo alguns autores consideram que a cromatografia em papel

é uma tomografia líquido líquido e na verdade pela moçada que papel absorve a água facilmente então alguns autores consideram que a fase estacionária de fato é a água tá que está nos poros do papel e aí seria uma faca acionária a e na cama apareceu de partição a separação acontece com um equilíbrio de solubilidade a molécula mais solúvel na fracionária demora mais para sair Olha pelo menos solúvel é mais facilmente ajustada que ela faz mal Ei não é para mudar grafia por escrevamos tamanho aqui essa estação é melhor a gente entender então eu tenho aqui

a representação de uma partícula de fase estacionária essa partícula de funcionária ela tem que ser porosa e um poro esporos das partículas funcionário tem que perguntar manho mais ou menos uniforme Ah que que acontece aqui as mulheres aqui está representando as moléculas que compõem a substância presente na minha mostra e as moléculas maiores não conseguem entrar nos poros Então as façam por fora das partículas acionária e são exibidas Primeiro as moléculas menores ela inventa não poros está entra no outro está em percorre um caminho muito maior e demoram mais para sair então as moléculas são

separadas por tamanho esse tipo de cromatografia é muito utilizado em análise polímeros a gente pode usar inclusive para determinar massa molar de polímeros como é que eu faço isso por exemplo eu em gel polímero Esquadrão Oi hoje as massas molares são conhecidos esses três aqui por exemplo para cada um um desses polímeros Eu tenho um tempo de retenção associada Deixa eu voltar aqui e olha isso aqui é um cromatograma em apresentação gráfica do resultado da prova Geografia essa substância a saiu nesse tempo vamos imaginar que esse fosse o cromatograma daquela análise lá por exclusão de

tamanho esse aqui é uma olhada lá teria molécula de maior tamanho saiu primeiro nesse tempo aqui uma olhada lá ver nesse tempo aqui mulher que você nesse tempo aqui eu posso fazer uma regressão linear entre massa molar e tempo de retenção eu posso colocar aqui a massa molar Ah tá só online tá e tempo de retenção é eu teria uma curva calibração uma curva analítica assim né quanto menor a massa molar o maior o tempo de tentar então tem um gráfico assim a substância ser substância de substância A como é que eu posso usar essa

técnica para determinar massa molar de Coimbra Suponho que eu trabalho lá no ímã tá se conhece minha mãe Instituto de macromoléculas eu tô sintetizando um polímero novo eu quero saber se ele ficou na massa molar que esperar que que eu faço eu um gesto três pulinhos Esquadrão eu conheço o tempo de se der eu conheço a macular polímero a quem sai esse tempo aqui ó minha ela ficou bem reta né Tem um pude retenção de ar Ok B e C A e quem eu vou relacionar marca Meu Lar de cada um bom tempo de retenção

de cada um o tempo de atenção ao máximo do Fio tempo de ar Marcelo Aguiar Como é calculado para menina que que eu faço agora em gel tão minha mostra Socorro que a minha mostra tem aplicado e aqui eu pego mais no quadro aqui então eu vou pegar esse tempo aqui aqui é um tempo entre a e b aqui e vou determinar a massa molar do polímero que eu sintetizei tá faltando uma palavra aqui né não há interações cooperativas entre a concessionária é o anaílton e eu posso utilizar a fotografia isso aqui onica para temperar

cátion ou ânion quando eu quero separar cátions eu tenho que usar uma faccionaria que tenha sítios ativos um carrega ativa se eu quiser separar Ane eu tenho que ter uma funcionária com sítios ativos com carga positiva tá então aqui tem um exemplo de uma separação de cátions coluna trocador de cátions consiste ativo negativo que a gente pode imaginar que seja esse aqui OK é a primeira coisa equilibrar minha coluna passa uma solução de hcl diluído por exemplo uma solução assista aqui todos os sítios ativos fiquem ocupados por h mais porque a mais o que é

um cacho que eu consigo remover para também tá aqui a gente tá representando um sítio antigo Mas pensa em que a gente tem uma infinidade deles aqui quase todos eles estão ocupados por h mais mesmo depois que a gente em dia da mostra ok que eu tô ajeitando uma pequena quantidade de amostra esses dois cachos ficam aqui atraídos eletrostaticamente por essa carga negativa Ok seus ânimos foram carregados pelo lugar mais e eu não quero ver se tem aí retidos eu quero que ele que sejam Heloísa separadamente então eu vou usar uma sequência de eletrólitos que

vão interagir de maneira diferente com essa Faça o seu na área que primeiras coisas esse eletrônico enquanto aleatório é uma solução de um outro cátion um outro cátion e por exemplo interagiu mais fortemente com esse aplicativo do que é demais ele competiu com demais por esse aplicativo interação dele foi mais forte então ele conseguiu promover a lição do demais e ocupou o lugar dele ok beleza já conseguiu ver mais vou usar um segundo eletrólito interagem mais fortemente ainda com esse sítio ativo agora ele vai competir com os dois mais quem ele vai interagir com aqueles

ativo mais forte do que dos mais vai remover é mas eu comprar o lugar dele e aí eu conseguindo ir esse e depois é se é para bem agora eu quero voltar para minha condição inicial para fazer uma nova análise que que eu faço passo novamente a solução do mesmo as que tava aqui no início para chegar na minha conta Inicial bom Como tudo na vida na ciência Pelo menos tem sempre uma teoria que multiplicar e porque tem importante que a gente consiga explicar um fenômeno que a gente observa experimentalmente Por que a gente entende

Teoricamente o que que tá acontecendo a gente é capaz a gente é mais capaz a gente consegue melhor atuar sobre o sistema para conseguir melhores resultados a tão processos decoração para matou grávida Ele é bem escrito principalmente produtos teorias tá e eu ia chamar a teoria dos Pratos teóricos e até o dia que você parece com dinâmica que também é conhecida como equação de Landim tá a formação de pratos teóricos é a mesma não é a mesma né mas foi foi tomado emprestado dos Pratos teóricos da destilação Qual é a diferença de uma destilação simples

destilação fracionada destilação fracionada a gente em uma coluna de destilação bem e maior onde é a licitação acontece várias etapas e não apenas numa na destilação simples o líquido ainda temperatura de ebulição e vapor Tobi atingir a superfície fria escorre perto na destilação fracionada e tem aquela coluna enorme com vários pratos ali a gente esses pratos podem ter diferentes formas dependendo da comunica tô usando o fato é que são várias etapas o vapor sobe condensa some de novo com Sim Fábio novo e por aí vai até que chega a ponto de ser destilada efetivamente Ok

e a teoria dos Pratos teóricos que explica a melhor eficiência de uma coluna de destilação fracionada é a mesma teoria que temos ficará melhor eficiência da cromatografia com o aumento do número de karatê tropa Ei Então a gente vai imaginar E a gente fosse capaz de separar Imaginem aquela coluna de vidro lá tu botar o presente tá que a gente pudesse se a gente fosse capaz de fatiar aquela coluna em partes cada vez menores de modo que a gente conseguisse isolar uma etapa de equilíbrio equilíbrio professora o equilíbrio do análise doenças fase móvel e estacionária

e a esse equilíbrio do análise das bases móveis estacionário é vestido beijo Cristo por uma constante assim como qualquer outro tá a constante de equilíbrio que descreve esse fenômeno chama coeficiente de partição hora o analista sendo arrastado pela fase móvel e hora ele está preso na facionaria OK agora que eu observei que eu não coloquei aqui uma coisa combinando com a outra né eu poderia ter escrito esse livro da forma que eu quiser poderia ter colocado faccionario aqui fazendo móvel aqui tá errado Me perdoa mas é a constante de equilíbrio chama com ele sente de

bastão que descreve o equilíbrio do Ayrton sendo arrastado pela fase Movel ela retido pela funcionária em bom e quando a gente pensa nos pratos teóricos é mais ou menos isso é como é como se eu conseguisse dividir a minha coluna em tantos pratos possível de modo a isolar uma capa de química Lembrando que só uma teoria A então a teoria dos Pratos teóricos ela me diz o seguinte que quanto maior o número de pratos teóricos de uma determinada coluna mais eficiente ela vai ser que ponto menor o número de cada prato maior número de pratos

eu vou ter numa mesma coluna maior o número de etapas de separação assim quando a gente local assim como na destilação fracionada em E aí impulsão gilso vários parâmetros foram descritos a a gente tem um tempo de atenção que a gente já falou dele quando eu falei lado cromatograma que é o tempo entre a ingestão EA detecção quanto maior a interação do marido com a funcionária maior vai ser seu tempo de atenção ok é uma coisa uma novidade é o tempo morto que que é o tempo gente tem imagina em que qualquer sistema cromatográfico vamos

imaginar aquela coluna de vidro lá pronta para filhas Clara a o próprio solvente ele tem um tempo mínimo para percorrer aquela coluna mesmo que não haja interação entre moléculas do solvente e é funcionária ele vai demorar um tempo porque eluente percorre essa coluna no caso da fotografia clássica de acordo para postar gravidade então esse tempo que a própria fase móvel demora para percorrer coluna é chamado tempo morto é o tempo mínimo e qualquer substância vai demorar para percorrer esta coluna com aquela vazão utilizada Ok e como é que Eu determino tempo morto Tá eu tenho

que injetar uma substância que eu saio adiante mão que não interessa que eu faço canário para medir o seu tempo de atenção e saber qual é o tempo OK é porque às vezes é importante que a gente calcula o tempo morto por quê por exemplo o meu sistema de vazão na não tá funcionando bem para cada corrida cromatográfica a minha vazão Tá diferente tá então se a minha vazão aumenta o meu tempo morto diminui e você mexer canção também você minha vazão diminui os tempos aumentam E aí se os dois aumentam os dois minutos eu

faço a diferença entre um e outro tenho que a gente não tem tempo de atenção relativo Eu não corro o risco de errar o tempo de atenção por causa da variação da vazão ok e aqui a gente tem licitação do tempo de retenção da substância um tempo de retenção da substância dois o tempo morto aqui no início e ainda o outro parando que a gente utiliza EA largura do pirú tá aqui a gente tem WB O que é largura do pico na base O Outro fator de um outro parente formato gráfico muito utilizado para gente

avaliar a qualidade da Separação cromatográfica é chamado fator de capacidade ou fator de Redenção a e o papel de capacidade de presente papel em atacar minúsculo é calculado por essa fórmula aqui a ele é dado para uma substância em um sistema cromatográfico pra substância X no sistema cromatográfico Y Eu tenho um determinado valor de pacote capacidade que é calculado como eu não sei atenção menos tempo louco dividido pelo tempo Morro se esse papel de capacidade é diretamente proporcional ao tempo de atenção o que significa que quanto maior o valor de k maior a retenção destas

substâncias na fase tá na área ok e se esse número com muito pequenininho muito menor do que um significa que eles vão aconteceu muito rapidamente é o menor valor que capa de assumir zero quando é que cai igual a zero quanto tempo de retenção é igual a tempo morto Ou seja quando não houve interação entre a substância e a funcionária foi direto para fazer mal ok quanto maior o valor de k maior o tempo de eluição basicamente a que influenciam o cálculo de retenção é afastar na área a se eu mudar funcionária eu mudo o

valor de k para que ela substância A que eu tenho uma representação essa substância aqui saiu nesse tempo Olá aqui é o tempo morto pode ficar goza Ei a que disse que o cara ideal deve ter entre um e 15 O que significa se eu tiver uma mistura com vários componentes o que que eu quero aí eu não quero valores de k pequenos em valores de carga grandes eu quero valores de K variando eu quero que valorize o que eu tenho diferente se cada substância tiver um rolo de carne diferença Henrique preparação ok e já

seletividade que que a seletividade é a razão de Deus qais no numerador eu coloco sempre maior valor de calça seja da substância que teve na hora interação para concessionária tá significa o quê Opa tudo seletividade a me dizer o quão separados estão os fios porque se esses dois cards Aqui foram Iguais significa que as substâncias deixe é substâncias estão sobre a posse saíram juntos Alfa igual a um certo quanto maior o valor de Alfa maior a distância entre os fios amar a separação maior até criatividade ok aqui a gente tem um exemplo cada 1,5 =

2,1 ao ficam 1,4 Ok Aonde foi vai ser sempre maior igual a um ou não foi igual um significa os filhos estão sobrepostos a seletividade é a função É depende da faça sandália da fase móvel e da temperatura A então quando eu quero mudar a seletividade do meu sistema basta eu mexer na forma imóvel o que que eu tô falando isso porque tocar de facionaria eu nem sempre é possível trocar de fazer móvel é tem de mais fácil Principalmente quando a gente fala de hplc que a gente compra uma coluna e uma Como já deve

ser deve tá custando sei lá os r$ 2000 r$ 3000 uma coluna eu não tenho assim em várias colunas para ficar trocando e testando com a melhor para retirada tem uma coluna que eu vou usar para várias aplicações e testar os melhores condições experimentais para aquela coluna e a gente usa muito variar Faz nove proporção de diferentes solventes mudança de PH E por aí vai ok e eu posso onde a ter temperatura controlada nem todo equipamento tem o controle de temperatura da faca cenário alguns tem outros não e isso também vai vencer a seletividade ok

aqui a gente tem a forma linha da eficiência a eficiência de uma coluna é Expressa em termos de número de pratos teóricos a o número de pastor está relacionado com um tempo de atenção esse nessa fórmula tá e a largura do piso Não repare o seguinte que o número de pratos teóricos é inversamente proporcional a largura do Peru O que significa dizer que uma coluna eficiente é uma coisa que gera Picos estreitos o que significa isso tentar lá eu desenhar de novo tá não sou boa mas vamos lá se eu tiver é uma coluna não

é muito eficiente tá fazer aqui para não borrar lá então se eu tenho aqui uma um cromatograma de uma coluna com baixa eficiência tá então eu tive um virgula água em em um outro pico Largo assim a uma separação com baixa que tem OK agora se eu tiver é uma coluna eficiente eu vou ter vocês três eu vou ter uma coisa assim eu consigo fazer fixa e um ok o quê que eu tô observando tá que uma coluna eficiente ela precisou de Muito menos tempo para separar essas substâncias aqui ó e o que ela conseguiu

gerar arquivos Estreito é o número de pratos teóricos é inversamente proporcional a largura do perco. Mais externo eu fico maior número de católicos na hora que senso o clareza é que uma coluna que sente aquela que consegue separar mais substâncias no menor intervalo de tempo uma outra maneira da gente expressar eficiência é usando o h que é o h altura de cada pra teórica o l aqui nada mais é do que a altura da coluna E por que que eu uso Às vezes o h ao invés do Enem é quando eu quero comparar a coluna

já tamanho diferente eu quero comprar uma coluna de 15 centímetros uma coluna de 25 centímetros a uma coluna de 25 centímetros minha mente vai ter mais para teórico já tem uns 15 centímetros tá se a senhora foi igual Deus faça se tornar as cores diferentes eu vou calcular e o valor de H A para poder comprar as duas colunas também diferentes a O que é que influencia eficiência o comprimento da coluna Porque quanto maior o comprimento da coluna maior número de pratos teóricos e o tamanho da partícula quanto menor o tamanho da partícula que compõe

a funcionária maior área superficial quanto maior área superficial maior a quantidade de sítios ativos esportes para interagir com os análise e maior eficiência da separação e aqui finalmente eu tenho a resolução que o corante cromatográfico principal na cama fotografia Ok eu quero fazer uma preparação para fotográfica para conseguir resolver a minha mãe o que significa isso eu quero separar todas as substâncias presentes na minha morte e Oi e a resolução ela é calculado por essa forma aí pode olhar para cá a gente percebe que essa resolução aqui ela É influenciada principalmente pela seletividade e quanto

maior o afastamento de espíritos Mara felicidade e pela eficiência quanto mais estreitos físicos maior resolução ok uma resolução a gente considera que a resolução tem que ser no mínimo igual a 1,5 para que pelo menos um ponto entre dois Picos Encosta na innovare decorações de menores do que 1,5 significa que houve alguma sobreposição Ok quando é que resolvi não há resolução nenhuma quando é que eles ficam estão totalmente sobrepostos ou até ruim ou até R2 e aqui ele tem resolução igual a zero um OK em alguma pergunta [Música] bom então quando eu penso em resolução

eu tenho que pensar a eficiência na seletividade e na retenção Ei todos eles farão que a gente viu o anterior mente vamos iniciar a resolução ou seja as coisas da funcionária as coisas fazer móvel a temperatura no meu sistema você pode controlar todos esses parâmetros experimentais podem ser modificados otimizados para atingir uma boa resolução aqui que eu tenho uma outra maneira de expressar a resolução deixando difícil a influência da eficiência a influência da seletividade em põe da retenção ok a gente sempre quer uma boa resolução associada a uma boa eficiência porque não adianta eu vou

separar bem essa substância presente na minha mostra nós gastar muito tempo ele Imagine que eu posso utilizar cromatografia para separar uma amostra e a com vários fios então A seletividade tá eu nem pensa muito alta Então eu tenho que pensar direitinho qual quais são os tipos de interação e vão acontecer entre a funcionários Nair as Imóveis análise por exemplo assim substâncias fazem ligação de hidrogênio ou não só existe as substâncias apolares da minha mostra que tipo inteira só vai acontecer quando ele tem a ver com seletividade qual é a parte de uma área que eu

vou escolher em geral se eu quero separar a na escolares eu escolhi uma fase estacionária ou lá se eu quero você Paranaíba apolares eu escolhi uma parte dicionária Apolar porque senão não tem seletividade eu tô usando sílica por exemplo uma passe na área polar e ele já tá uma amostra composta por hidrocarbonetos não vai ter separação e rápida vai sair todo mundo rapidinho porque não vai haver interação com essa faz funcionária Olá e é isso aqui eu tenho um resuminho dos paramos de tomar dobrar está e aqui um cromatograma ideal o que que o cromatograma

ideal tá dizendo para mim Ah como é que é um cama programa ideal reparem que aqui eu não tenho mais o formato aquele formato bonitinho de uma borra vai ligar hoje a corra degraus tem eu eu vou fazer um formato de sino né assim no carro simétrico mas estou entendendo que que uma distribuição normal diz que a maioria das moléculas chegam nesse tempo aqui perto mas eu dei chegam né E se eu tenho chegou nesse já chegou mesmo a esse cromatograma ideal O que que tá dizendo para mim que todas as moléculas da substância A

chegaram ao mesmo e elas percorreram todo o carinho da faço acionária juntas não ou se dispersam ao longo da coluna e sempre antes estamos longa como uma sempre por isso a gente tem um alargamento do Pipa OK e ele não é uma linha simplesmente esse processo de alargamento do pico ele pode ser mais significativo menos mim partiu escolher ele de vários parâmetros principalmente deparando relacionados à eficiência da coluna tá esse modelo de pratos teóricos ele não é muito eficiente para tentar explicar esse alargamento Tá e por isso que surgiu a teoria da Separação dinâmica ou

equação de longe tem que a gente não vai ver hoje a gente vai parar naquele de católico Ok A Vida dos Pastores ela serve para explicar bem esse formato gaussiano os fios a e como Cada Um dos fatores experimentais e a vão influenciar G1 e nesses paramos para uma cobrados que a gente coloque ou ao contrário tá o quê que cada um desses parâmetros calculados está me dizendo sobre que eu estou observando diferente também sobre a qualidade da minha separação a isso teoria dos pés ela fica bem o que ela não consegue explicar direito é

por quê que acontece essa separação é a culpa esse alargamento do pico e o que que faz com que isso aconteça e em qual nível mas menos é o que que vai influenciar nisso ok