Aula 06 - Fixação biológica de Nitrogênio - Profa. Lucy Seldin

Olá a todos eh um prazer est aqui com vocês mesmo de modo remoto Eh meu nome é Lu eu sou do laboratório de genética microbiana e é um prazer tá aqui hoje eh apresentando um pouquinho eh do que eu trabalho há muitos anos eh em relação à fixação biológica do nitrogênio eu tentei simplificar o máximo colocar bastante coisa para vocês terem eh como estudar mas eu tô aqui totalmente à disposição de vocês vocês podem me escrever podem tirar as dúvidas que vocês tiverem tá então eu vou apresentar a aula para vocês e a gente vai

devagarzinho então falando sobre eh a fixação biológica do nitrogênio eh aqui tá a o meu e-mail qualquer coisa vocês podem Eh escrever a hora que vocês quiserem vamos começar então falando um pouquinho eh do nitrogênio todo mundo sabe Acredito eu que quase 80% da atmosfera Nossa ela é composta de nitrogênio mas eh A grande maioria do da das pessoas das plantas dos vegetais superiores não são capazes de absorver esse nitrogênio por outro lado e o nitrogênio ele é o dos principais constituintes de toda a molécula orgânica ele tá presente na nas proteínas nos ácidos nucleicos

vários hormônios e portanto ele é essencial paraa nossa vida e deve ver um mecanismo de absorver esse nitrogênio da atmosfera e é isso que a gente vai eh apresentar na aula de hoje eh o ciclo do nitrogênio a a fixação biológica do nitrogênio ele é um ponto eh Chave né a gente tem aqui o n2 e através de alguns eh procariotos somente que são chamados de bactérias fixadoras de nitrogênio eh esse nitrogênio então ele é capaz de ser transformado em amônia e através das bactérias nitrificantes ele é transformado em nitrato e através das bactérias den

nitrificantes ele retorna a atmosfera na forma de n2 Então essa é a maneira que o nitrogênio então Eh circula no no ambiente fora das bactérias fixadoras de nitrogênio esse nitrogênio m2 ele é eh absorvido também por eh eh que a gente chama de fixação abiótica que ela é pode ser provocada pelo homem mas também ela pode ocorrer de modo natural o modo natural que ocorre é a transformação do n2 em amônia através da energia liberada por vulcões eh por raios e também por trovões essa transformação do n2 em amônia provocada pelo homem ela é basicamente

eh acontece eh pela emissão de de indústrias né Principalmente de de combustão eh e também a combustão de petróleo ou fertilizantes ou também através da da chuva ácida então a gente tá vendo aqui em azul eh todos os eh mecanismos de transformação de n2 em amônia de modo natural e também em rosa ou vermelho a transformação para Nitrato através eh de uma fixação provocada pelo pelo homem chamando atenção que toda essa transformação o grande gargalo dela é o gasto energético ah a o organismo precisa de bastante energia para transformar esse n2 em nh3 então por

isso que trovões raios vulcões eh fazem Então essa geração de energia para essa transformação e na indústria também a gente precisa de eh indústrias que hajam liberação de de energia para que aconteça essa transformação Mas se a gente for comparar a a fixação fixação de nitrogênio tanto biológica quanto não biológica a gente vai notar que a biológica ela é mais do que o dobro da não biológica eh a gente tem uma uma quantidade aproximada de fixação biológica de 175 x 10 a 2 g por ano eh ao contrário da fixação não biológica que é em

torno de 80 então a gente sabe que a fixação biológica ela é essencial e é a que mais contribui paraa incorporação desse n2 eh na nossa vida bom então assim vamos falar sobre a fixação biológica né que é o objetivo da aula e ela é realizada Então por bactérias fixadoras de nitrogênio também chamada de bactérias diazotróficas e o papel dela é transformar o n2 uma molécula com uma tripla ligação em nh3 se a gente parar para pensar na parte prática quando você tem uma fixação biológica do nitrogênio onde há transformação e amônia a gente se

isso acontece na na natureza a gente tem uma redução da necessidade de fertilizantes nitrogenadas eh obviamente o fertilizante a gente sabe que é uma uma uma forma de poluir eh e com você eh diminuindo então esses fertilizantes você pode também contribuir paraa produtividade agrícola com menor custo com menor emissão de nitrito né gases do efeito eh estufa e menos lvia de atos para os lençóis freáticos que também são extremamente eh poluentes a maioria dos isotrópicos eh como eh Eu mencionei pertencem ao domínio bactéria né somente os procariotos têm essa capacidade para que ela tenha eh

esse microrganismo tem a capacidade de fixar nitrogênio a gente vai ver eh daqui a pouco ela tem que ter uma quantidade de gene bastante razoável para que ela seja capaz de reduzir sn2 e nh3 esses essas bactérias elas podem eh ser encontradas eh nos diferentes eh tipos de de bactérias como bactérias aeróbias anaeróbias facultativas anaeróbias ou microaerófilas e elas são classificadas Então como eh microorganismos de vida livre associ ou simbióticas falando primeiro dos associativos são bactérias que são consideradas endofíticas e elas são também divididas em endofíticos facultativos e obrigatórios os endofíticos eh facultativos que a

gente tem o exemplo de azospirillum herbaspirillum bacilos pacil acetobacter são bactérias que não Obrigatoriamente são encontrados dentro eh da planta elas podem estar no interior da raízes das raízes das Folhas dos comos mas também são encontrados na rizosfera já os endofíticos obrigatórios eles só vão fixar nitrogênio quando eles estiverem no interior da raiz eles realmente colonizam o interior da Raiz e comoo e folha e um exemplo muito dado é o gênero herbaspirillum o também o gluconacetobacter burgod éa e hervin eh como gêneros mais importantes tá então o facultativ a diferença principal do facultativo para obrigatório

que o facultativo ele pode fixar nitrogênio na rizosfera enquanto o obrigatório somente no interior da planta então aqui a gente tem só uma micrografia eh Super Bonita de do Itamar da da Embrapa onde ele fotografa então bactérias endofíticas no interior eh da raiz então eh Super eh ilustrativa para vocês verem como a as as bactérias se encontram no interior da planta eh em termos de associação também eh Como Eu mencionei azospirillum ele faz uma associação então eh verdadeira essa aqui no caso eh no caso de milho no caso de sorgo onde já existe inclusive fertilizantes

eh biológicos já comercializados eh demonstrando então Eh aqui no nesse eh nessa foto a contribuição do azospirillum para o crescimento eh da planta através da da capacidade de fixar eh o nitrogênio tá outra exemplo também de associação a gente encontra eh do gênero bacilos em Pimenteira ele é não é um endofítico obrigatório ele é encontrado na rizosfera nesse experimento eh ele foi então Eh observado na rizosfera da da Pimenteira onde além da capacidade de fixar nitrogênio o essa essa estirpe de bacilos também era capaz de eh é produzir auxinas e portanto um efeito de promoção

de crescimento de de plantas que vocês já tiveram inclusive aula eh sobre isso e devem estar sabendo então bastante sobre a promoção então o gênero bacilos de novo ele não é um endofítico obrigatório eh nesse experimento ele foi encontrado na rizosfera mas ele é bastante utilizado eh também como a pgpr e também no controle biológico de diferentes pragas outro exemplo a gente tem aqui no gênero pen bacilos eh é um gênero que a gente trabalha lá no laboratório aqui Tem dois trabalhos eh mostrando eh a capacidade de fixar nitrogênio de duas espécies eh algumas eh

uma fotografia aqui do lado esquerdo mostrando então aqui o controle e o e as plantas inoculadas demonstrando então a sua capacidade de promoção de crescimento e também a colonização do do pen bacilos na superfície da raiz eh já existem vários trabalhos em pen bacilos demonstrando que o pen bacilos ele não tem a capacidade invasiva ele não consegue invadir eh a raiz e entrar no interior da planta ele se aproveita de microfissuras feitas até por outros microorganismos e ele então aproveita essas fissuras e entra eh dentro da planta e ela pode ter uma uma participação eh

de promoção dentro da planta e também na rizosfera eh ao contrário dos das bactérias de vida livre elas não entram dentro da planta elas são encontradas no normalmente na rizosfera e no solo e essas bactérias de vida livre elas fixam nitrogênio para elas é o papel da da sua fixação é prover nitrogênio para elas mesmo eh O problema é que na hora que elas morrem elas deixam esse nitrogênio no solo e na rizosfera contribuindo também eh pra incorporação do da AM exemplos de bactérias de vida livre a gente tem as bactérias aeróbicas do do gênero

azotobacter bairin e klebsiela e bactérias anaeróbias as mais estudadas são bactérias do gênero clostrídios eh fotografias de colônias de azotobacter a gente vai ver no final da aula a importância desse tipo de colônias com bastante ex polissacarideo bastante mucoso na proteção da bactéria para ela ser capaz eh de fixar nitrogênio e aqui alguns esporos de clust e por último os diazotróficas eh que são os mais badalados a gente tem eh bactérias do gênero rizóbio azoris Brad rizóbio que colonizam leguminosas né a gente tem rizóbios no no feijão e formando nódulos a gente tem eh actinomicetos

do gênero franquia colonizando plantas actino risas principalmente Casuarina e as cianobactérias eh do gênero anaba in stoque colonizando diferentes plantas angiospermas ginospermas pteridófitas briófitas fungos e esponjas também no caso do róbio é onde você tem uma simbiose verdadeira a gente observa a presença desses nódulos e portanto os rós eles são capazes de penetrar na raiz eh das leguminosas através dos pelos das raízes eles têm essa capacidade de invadir eles ah se ah aderem na superfície eles ah entram por esses eh pelos da raiz formam uma um canal de de infecção né eles vão entrando aqui

pela raiz entram dentro das células ocorre uma diferenciação celular e o róbio então ele passa da sua forma vegetativa por um bacteroide esse bacteroide então ele enche a a célula vegetativa dando origem a esses nódulos né o nódulo nada mais é do que um alargamento da célula eh da raiz né e é dentro desse nódulo que o rizóbio Então vai fixar nitrogênio onde ele encontra as condições ideais Para que ocorra essa fixação eh onde a S de oxigênio é baixo e a gente vai discutir isso mais pro final da aula tá então no caso do

de um cione verdadeiro no caso do rizóbio ele tem a capacidade de penetrar dentro da célula ele então Eh ocorre uma diferenciação celular ele inche a célula e fixa nitrogênio dentro desse nódulo tá Então realmente isso e é uma simbiose eh verdadeira Mas então agora vamos discutir porque que alguns organismos eh São fixadores e outros não né eu falei logo no início que somente as bactérias geotrópico porção eh dos microorganismos o que que provavelmente aconteceu a gente acredita que no início eh todas as bactérias eram fixadoras de nitrogênio principalmente porque quando houve uma escassez de

nitrogênio fixado na biosfera foi selecionada então bactérias que eram capazes de absorver o n2 eh da atmosfera e essa pressão seletiva então favoreceu a di aotr e a permanência dessas bactérias fixando do nitrogênio e como era um evento que provavelmente aconteceu antes do surgimento da fotossíntese eh a essas bactérias que fixam nitrogênio elas são ah sensíveis ao nitrogênio ou são capazes de fixar nitrogênio somente em condições muito baixas de nitrogênio porque a enzima que é responsável para transformar o n2 e nh3 que é chamado de nitrogenase ela é extremamente sensível à desnaturação pelo pelo oxigênio

só para dar uma ideia eh vocês em vitro a a nitrogenase ela é inativada em segundos na presença do do oxigênio e o que se tem hoje é que a gente encontra várias bactérias que ainda tem genes é ou parte de genes responsáveis pela fixação de nitrogênio mas que não fixam nitrogênio Por quê a durante a evolução conforme as bactérias foram perdendo a necessidade de fixar nitrogênio por exemplo uma bactéria é do trato intestinal humano ela não precisa fixar nitrogênio Então ela foi perdendo essa capacidade mas muitas vezes a gente encontra nessas bactérias ainda pedaços

ou parte de genes e responsáveis pela essa fixação do do nitrogênio tá eh e ó e é assim eh fácil a gente acreditar nessa perda já que se a bactéria não precisa ter essa capacidade é uma quantidade de genes que a gente vai ver no final da aula bastante razoável um gasto de energia enorme para que que ela vai manter e esses genes e evolutivamente essas bactérias foram perdendo essa capacidade só permanecendo então as bactérias realmente eh que tem o papel de contribuir eh pra incorporação do n2 em amônia pras plantas ou para si próprio

considerando as bactérias de vida livre e para uma bactéria ser fixadora de nitrogênio ela deve possuir genes que codificam pra enzima nitrogenase essa nitrogenase que tá aqui então caracterizada ela é composta de duas subunidades uma subunidade menor e uma subunidade maior essa Menor Ela é conhecida também como redutase ou proteína Ferro ela é uma proteína dimérica e essa parte aqui ela é eh conhecida como nitrogenase propriamente dita ou proteína ferro molibidênio ou componente maior proteína maior e é nela que a gente encontra o sítio ativo onde ocorre redução do n2 em nh3 ele é um

processo extremamente energético vocês vão ver que a gente que esse processo precisa de muuito ATP para que ele ocorra e também agentes redutores eh como a ferredoxina ou a flav doox que fornece elétrons eh paraa nitrogenase a nitrogenase ela só funciona quando os dois componentes estão juntos né sendo a proteína ferro a proteína menor muito mais sensível o oxigênio do que a proteína maior repetindo então que é na na proteína maior que a gente encontra o sítio ativo onde vai ocorrer a redução do n2 então que que acontece o n2 ele é uma molécula então

de tripla ligação e o que tem que acontecer para transformar o n2 e nh3 é o corte dessa tripla ligação então o que que a gente imagina eu preciso de dois elétrons aqui dois elétrons aqui e dois elétrons aqui para quebrar cada uma dessa eh ligação então a gente precisaria de seis elétrons só que no processo eh da redução do n2 há necessidade de oito elétrons isso porque acontece na natureza e para cada redução para cada dois elétrons eh a gente precisa de um monte de ATP para cada elétron a gente precisa de dois etps

então se a gente usa oito elétrons a gente vai ter um gasto de 16 ATPS nessa reação vocês depois vão perguntar para mim mas para que que se gasta esses dois elétrons aqui eh a mais eh é uma uma estabilização da da reação sempre há um gasto de 8 elétrons e com essa reação a gente tem a formação então de duas moléculas de amônia e obviamente sobra hidrogênio aqui porque se a gente tem oito elétrons e gastou seis aqui a gente vai ter uma liberação ah de hidrogênio nessa reação e esse hidrogênio ele ou ele

é perdido E aí vou concordar com vocês que isso é um gasto de energia Mas algumas bactérias são capazes de reaproveitar esse hidrogênio na na utilizando através da sua enzima hidrogenase Então vamos ver aqui e um resumo do que eu falei para vocês em relação à nitrogenase ela é constituída de duas proteínas como eu falei o componente maior a proteína ferro molibidênio é a proteína uma proteína tetramérica a proteína ferro que a proteína menor ou componente dois ela é uma proteína dimérica e ela é mais sensível então a oxigênio do que a proteína maior a

gente vai encontrar eh átomos de ferro molibidênio e enxofre e na nitrogenase clássica mas eu vou falar a seguir também que existem o que a gente chama de nitrogenas alternativas onde o molibdênio é substituído por vanádio no centro ativo ou então H por ferro Então a gente vai ter centros ativos da maioria das nitrogenas com ferro e molibdênio mas a gente também vai ter com vanádio e ferro e somente com ferro como eu já falei várias vezes ela é sensível ao oxigênio ela necessita de íons de Valentes como Magnésio e também 16 moléculas de ATP

ela reduz o hidrogênio em gás hidrogênio a formação de um H2 e ela necessita de um cator do ferro molibdênio para ser funcional no caso e das nitrogenas que usam ferro molibidênio e no seu centro ativo isso aqui então é um esquema do que acontece como eu falei os doadores de elétrons são a ferox ou a flav odox que ao se reduzir ela transfere o elétron pra proteína ferro essa proteína ferro também reduzida ela transfere o elétron paraa proteína ferro molibdênio ess esses elétrons transferidos então se acumulam no centro ativo da proteína ferro molibdênio e

quando acumula oito elétrons aqui a a formação então a quebra do n2 em nh3 e hidrogénio então é nada mais é do que uma transferência de elétrons de agentes redutores primeiro paraa proteína menor ou proteína Ferro e depois paraa proteína maior esses elétrons se acumulam aqui no centro ativo e quando então atingem a oito elétrons ocorre então a quebra da tripla ligação e a formação de amônia e hidrogênio então eu tentei eh fazer aqui um um resumo de tudo que eu falei em relação à nitrogenase e à redução do n2 para vocês terem escrito e

poderem ler com calma e nada mais é do que o que eu falei até agora então a feroxa ou a flavid oxina na sua forma reduzida transfere então elétron paraa unidade de da proteína ferro da nitrogenase essa proteína ferro ela então reduzida Doa o elétron recebido paraa proteína maior a proteína ferro molbo essa proteína molibidênio ela acumula os elétrons e depois de oito transferências essa unidade então terá acumulado oito elétrons e fará a redução do n2 nh3 para cada elétron transferido são consumidos dois ATPS e portanto no final do processo a gente tem um gasto

de 16 ATPS como consequência da fixação biológica do nitrogênio para cada molécula de n2 fixada h a liberação de um H2 essa produção do H2 Como Eu mencionei para vocês é um processo inevitável e acaba consumindo parte dos elétrons que poderia ser utilizada na própria fixação de nitrogênio esse hidrogênio por ser gasoso ele é perdido na na atmosfera no entanto alguns organismos eles possuem a enzima hidrogenase e são são capazes de oxidar esse hidrogênio e formando água e ATP esse ATP então gerado ele pode voltar pro processo de fixação biológica do nitrogênio e Teoricamente essas

bactérias que possuem essa enzima hidrogenase elas são mais eficientes na fixação do nitrogênio porque elas são capazes de ter uma fonte adicional de ATP E com isso a gente tem eh esse esse esquema mostrando que a fixação é como se fosse uma máquina por os elétrons entram de um lado com gasto de ATP o n2 é reduzido em nh3 e essa nitrogenase é é é uma enzima bastante especial e eh ela não é totalmente específica pro n2 a gente vai ver eh que essa nitrogenase ela é capaz de eh quebrar outras triplas ligação e eh

um exemplo é o monóxido de carbono esse monóxido de carbono ela é capaz de libir a nitrogenase por competição eh por outro lado essa mesma nitrogenase ela é capaz de de eh quebrar também outras moléculas que a gente vai eh mostrar daqui a pouco então como eu falei falei as flav doxin e ferrot toxinas funcionam como agentes redutores ela só É sintetizada na ausência de nitrogênio fixado e oxigênio eh portanto tanto a bactéria que fixa nitrogênio ela tem genes que regulam a fixação de nitrogênio na presença de nitrogênio fixado Eh esses genes da nitrogenase não

são nem transcritos e também na presença de oxigênio também não acontece essa transcrição a bactéria não vai formar nitrogenase se essa nitrogenas vai ser destruída pelo oxigênio então a bactéria que fixa nitrogênio ela vai ter ter uma como eu falei uma carga de genes bastante grande não só para codificar para o Genes estruturais para nitrogenase que são três genes que a gente vai ver no final da aula eh além de genes regulatórios para não deixar que haja a produção de nitrogenase na presença de nitrogênio fixado ou amônia ou outro eh Nitrato ou outra fonte de

nitrogênio e também na presença de oxigênio essa nitrogenase então ela reduz várias outras moléculas pequenas de tripla ligação além do nitrogênio Como Eu mencionei e o nome dos genes que codificam paraa nitrogenase e todos os outros genes envolvidos na síntese da nitrogenase é que vocês vão ver mais adiante que são muitos são chamados de genes nif Eh esses genes nif vão variar de gênero bacteriano a gente tem eh bactérias que têm até 20 genes nif outros têm a metade eh e sofreram então evoluções eh para que essa esses genes nif sejam atuantes e contribuam no

metabolismo da bactéria aqui são alguns exemplos de molécula de tripla ligação eh que são então eh degrad formados através do uso da nitrogenase o nitrogênio obviamente aqui o clássico O acetileno que é então formado eh o etileno as cian as idas O óxido nitroso e asocian o que é importante a gente ressaltar aqui nessa quebra do acetileno e etileno a gente em laboratório a gente não consegue eh ver o a ação da nitrogenase nessa quebra de n2 e nh3 então indiretamente o que a gente faz em laboratório é a observação da formação do etileno através

do acetileno se a gente injetar acetileno numa cultura bacteriana e houver a formação do etileno a gente sabe que essa bactéria então tem a enzima nitrogenase e ela fixa nitrogênio então isso aqui é um teste in vitro que a gente usa no nosso dia a dia no laboratório a gente a gente eu vou mostrar uma figura diante onde a gente injeta gás acetileno num frasquinho Onde tá tendo crescimento e da bactéria na ausência do nitrogênio e do oxigênio e se houver formação do etileno esse etileno é detectado por eh cromatografia gasosa e a gente então

pode indiretamente dizer se a bactéria fixa nitrogênio Ou não Aqui é um quadro mostrando as eh nitrogenas alternativas todos os organismos eles têm os ah genes nif que todos os organismos fixadores né Eh tem os genes niif que codificam então eh a subunidade menor e a maior a proteína ferro molibidenio da nitrogenase alguns microorganismos além de ter essa nitrogenase clássica ela tem a o que a gente chama das nitrogenas alternativas que são codificadas por outros genes no caso da nitrogenase eh que cifica ferro e vanádio no seu centro ativo eh São codificados pelos genes vnf

e a os genes anfi então Eh codificam para nitrogenase que só tem ferro no seu centro ativo a bactérias que codificam Genes vnf bactérias do gênero clostrídios e o zf azotobacter rhodobacter e rhodopseudomonas tá então todos eles têm nif e Alguns podem ter a outros genes alternativos no caso eh por exemplo do eh outros gêneros também eh podem apresentar eh genes alternativos mas sempre o principal eh É o Genes nef o um ponto que eu queria é chamar a atenção de vocês também é a proteção da nitrogenase contra o oxigênio se se a nitrogenase ela

é tão sensível ao oxigênio e essa nitrogenase então ela é degradada em segundos a bactéria para fixar nitrogênio ela tem que ter mecanismos de proteção dessa nitrogenase contra o oxigênio acho que isso é bastante Claro as bactérias anaeróbicas estritas elas já crescem na ausência de oxigênio Então essas bactérias por exemplo como o gênero clostrídios aparentemente não tem nenhum mecanismo de proteção especial eh para nitrogenos ela já tá crescendo na ausência de oxigênio Então ela fixa nitrogênio durante o seu crescimento eh na ausência do oxigênio outras bactérias que são facultativas ou são aeróbias estritas aí ela

tem que ter mecanismos especiais eh para proteger eh essa nitrogenase contra oxigênio bactérias eh por exemplo facultativas como azospirillum Pen bacilos e klebsiela eles só vão fixar eh nitrogênio mesmo na natureza onde a tensão de oxigênio é baixa o suficiente para ele poder para as bactérias poderem e esse oxigênio não inibir a nitrogenase ah a gente vai ver até na nesse no teste de redução de acetileno que Eu mencionei para vocês que a gente faz em laboratório tem uma uma fotografia a seguir e que a gente cresce essas bactérias no meio semissólido e a gente

vê que ela vai descendo nesse meio e ela encontra uma região no meio onde o oxigênio tá numa tensão baixa o suficiente para ela crescer e fixar nitrogênio e isso acontece na natureza também mesmo no solo ou na rizosfera ela procura eh locais onde a tensão de oxigênio é mais baixa bactérias que são aeróbias estritas por exemplo como azotobacter ela tem que ter mecanismos eh de proteção dessa nitrogen já que ela precisa do oxigênio para crescer no caso de azotobacter a gente conhece três mecanismos eh de proteção da nitrogenase o que a gente chama de

proteção respiratória é uma aceleração eh do processo de respiração ela faz como se eh um aumento da velocidade da respiração não permitindo com que haja oxigênio e dissolvido eh no meio então ela acelera esse essa respiração para que esse oxigênio presente ele seja rapidamente consumido ou então ele faz uma proteção conformacional que é menos estudada mas acredita-se que a azotobacter deva ter talvez uma proteína protetora que então Eh protege a a nitrogenase do efeito do oxigênio azotobacter também da mesma maneira que dércia eu mostrei para vocês eh uma uma foto do da produção de exopolissacarídeo

colônias mucosas onde essa colônia Então ela dificulta a passagem do oxigênio e as bactérias então no interior dessa colônia ela é capaz então de fixar nitrogênio a cianobactérias já tem então um processo de diferenciação celular ela forma heterocistos onde essa fixação vai acontecer e como eu falei eh na formação de nódulos na presença de uma leg hemoglobina que tem um papel muito parecido com a nossa hemoglobina que então Eh transporta esse oxigênio dissolvido para fora dos nódulos então eu vou mostrar alguns eh algumas alguns slides aqui do do que a gente discutiu em termos de

proteção essa aqui é uma foto de azospirillum crescendo no meio semissólido Eu não sei se dá bem para vocês verem a formação de uma película aqui no no meio do tubo isso a gente também vê em pen bacilos não uma película assim muito eh característica mas a formação de bolhas de gás aqui embaixo do do tubo demonstrando que ele tá crescendo no meio Onde a tensão de oxigênio é mais baixo tá então é um meio semiola própria bactéria esse meio não tem nitrogênio fixado Então ela cresce ela vai andando até ela encontrar uma tensão eh

de oxigênio suficiente para ela poder eh fixar nitrogênio eh aqui é um teste de redução de etileno onde a gente injeta acetileno dentro do do tubo eh a gente a gente Pode injetar aqui também né numa num meio semissólido depois a gente retira um pouco da fase aérea desse tubo e ler Ah num cromatógrafo a gás e se houver a produção de etileno a gente comprova que há presença de nitrogênio e reduzindo o n2 aqui aquela mesma foto do azotobacter né onde a gente vê colônias extremamente mucosas a a dercia também tem uma colônia muito

mucosa e esse muco então protege a as bactérias contra a difusão do oxigênio Então as bactérias aqui no interior dessa colônia elas fixam nitrogênio e o oxigênio tem dificuldade de se difundir por esse muco no caso das cianobactérias a formação desses heterocistos eh São e eh cistos com paredes espessadas que não permitem a difusão do oxigênio aqui dentro e é nesses eh heterocistos que a s bactérias então Eh fixam o nitrogênio e tão estão protegidas do gên tá aqui tem várias figuras com essas setas mostrando os heterocistos aqui a formação do nódulo então em cada

nódulo a gente tem eh os rizóbios fixando nitrogênio após a diferenciação celular e dentro desses nódulos Então as le hemoglobinas eh fazem com que o oxigênio seja exportado e não permanecendo então Eh no interior do nódulo permitindo então que os rizóbios fixem nitrogênio dentro dos nódulos e por fim Eh vamos falar um pouquinho só sobre o Genes eh responsáveis pela fixação biológica do nitrogênio a gente vai falar dos genes então genes niif e esses genes niif eles vão variar muito de organismo para organismo Esse é o operon eh primeiro a ser descrito que foi em

cerela pneumônico que na década de 80 que era uma bactéria eh bastante semelhante a xir chacoli e como ela era fixadora de nitrogênio e a metodologia todas as metodologias de genética molecular estavam mais adaptadas a bactérias Gran negativas em esti chacol então a clebis ela pneumônica foi eh um organismo o primeiro a ser estudado apesar da dela não ser eh tão importante na contribuição do nitrogênio fixado na natureza eh a clebs ela é um ótimo exemplo do que a gente discutiu Logo no início de que no início todas as bactérias fixavam nitrogênio e conforme eh

elas foram perdendo eh essa necessidade elas também perderam eh os gênes Então clebis ela pneumônica ela continua fixando o nitrogênio mas ela não tem essa contribuição tão importante eh na introdução da amônia eh no ambiente então o que que a gente tem nesse operon a gente tem três genes estruturais unificar d e h unificar e o B eles codificam para proteína maior tá proteína ferro molibdênio onde tem o centro ativo tá onde ocorre e a redução do n2 e nh3 e tem o nif h que codifica para proteína ferro eh aqui a proteína menor e

desses genes estruturais o nifh é o mais conservado esse nifh ele é muito parecido mas muito parecido mesmo e nas bactérias que fixam o nitrogênio e muitas bactérias que nem fixam o nitrogênio elas ainda apresentam o nifh ele então que corrobora com essa teoria que a grande maioria das bactérias eh era fixadora de nitrogênio e foi perdendo essa característica então bactérias eh são a gente encontra esse nfh no Genoma de muitas bactérias mas essas bactérias não tem tem os outros genes e não fixam nitrogênio já que para fixar nitrogênio não há não é só necessário

os genes estruturais a gente tem que ter um vários outros genes que estão envolvidos no transporte de de elétrons né da da proteína menor paraa proteína maior a gente tem o Genes de regulação que é o nif a e o nif l que controlam essa transcrição desses genes na presença de nitrogênio fixado e oxigênio e também tem vários outros eh genes envolvidos eh na síntese do do cofator eh e por assim eh diante então assim a gente tem os genes envolvidos no transporte de elétrons na síntese de cofator eh os genes regulatórios que é o

nif a e o l e os genes estruturais que é o kdh no caso de klebsiela São 20 genes envolvidos na fixação de nitrogênio eh eles estão localizados no Genoma entre os genes do ácido chiquímico e da istidina e eh Ocupa um uma um espaço eh bastante grande eh do Genoma de da ela outras bactérias elas não possuem às vezes esses 20 genes como no caso de pen bacilos Eles já eh fixam nitrogênio com somente nove genes a gente encontra obviamente unif k unif d unif h eh a gente encontra os genes de regulação o

a e o l mas os outros eh genes eh os a gente encontra os genes de de síntese de cofator mas outros genes envolvidos muitas vezes se a gente vai ver aqui as funções a gente tem a envolvimento na síntese das flav podoxin e ferodo xin no processamento das proteínas eh na no no na incorporação de molibidênio então esses outros genes acessórios muitas vezes vezes são diferentes entre os diferentes gêneros agora o k e o DH eles são sempre encontrados o nif l e nif a de regulação também e normalmente a O do centro ativo

também tá então o a quantidade de genes vai variar de gênero para gênero como eu dei o exemplo em pen bacilos por exemplo pen bacilos brasilienses a gente só tem nove genes em encontrados e em comparação a 20 genes encontrados em clebs então era basicamente isso que eu queria apresentar eh a vocês eu acho que eu dei assim o básico para que vocês se interessarem eh entrarem na na literatura e aprenderem mais eh e eu tô totalmente à disposição de vocês qualquer dúvida que vocês tenham ou que vocês quiserem saber mais e eu souber eh

explicar e e responder para vocês eu tô totalmente à disposição né no meu primeiro slide tem meu e-mail então podem eh perguntar não tem um mínimo problema eu adoro receber e-mail de vocês e vocês podem então tirar a dúvida as dúvidas que vocês tiverem tá eh É uma pena que eu não possa est ao vivo eh com vocês e espero que no futuro breve a gente possa se encontrar e vocês todos já estão eh devidamente convidados a conhecer o o nosso laboratório e nos para que a gente nos conheça pessoalmente tá um super abraço eh

para vocês