Western Blotting

E aí gente tudo bem com todo mundo tô aqui de volta depois de um longo período sem gravar em um vídeo hoje resolvi colocar mais um vídeo para vocês e como vocês estão vendo aqui na tela a aula de hoje vai ser aula de westing para quem não me conhece ainda eu sou professor roni roni Brito já dou aula de imunologia muitos anos aí e nesse canal a gente tem algumas aulas de imunologia básica e algumas aulas de imunologia Clínica e algumas algumas técnicas imunológicas como por exemplo a técnica de westing glote eu não sei

se você já fez West blog Eu Já Fiz alguns desses testes na minha época de doutorado e eu gostava de fazer o sing lot ele vai assim meio que o dia inteiro fazendo você tem que preparar sua amostra aí aplica amostra no Gel aí você antes você faz o gel aí se aplica ali no aparato todo lote É bem interessante de fazer e hoje a gente vai explicar em alguns detalhes Como que essa técnica funciona para que que ela serve no Wester blooting a gente faz a detecção de proteínas de um lisado proteico por exemplo

sei lá você quer saber se em algum tumor por exemplo é aquele tumor não tá respondendo a radioterapia sei lá aí você faz uma biópsia do tumor E aí você vai ver se dentro dele espessa alguma proteína antipopótica como por exemplo bcl2 você tá super expressa essa bcl2 e uma das técnicas que é feita para você medir se essa proteína tá em grande quantidade é justamente essa de West em lote então eu vou lá no programa rapidinho só para tirar a gravação do meu rosto porque como eu sempre falo né O importante são os slides

que eu fiz para vocês né que tá tão bonitinhos aí e não ficar vendo a carinha do professor né então é isso vou só no programa rapidinho desabilitar a gravação do meu rosto eu já volto aqui na aula para a gente continuar começar e continuar essa aula que a aula incrível de Wesley morte espero que vocês gostem desativar pronto então gente na aula de westingbloche né o bloting como eu falei ali no comecinho né É para determinar fazer identificar identificação de proteínas então ele é uma caneta né a caneta É sempre bom para a gente

poder riscar e eu mostrando as coisas para vocês então o blotin ele é usado para identificar e determinar a quantidade relativa e o peso molecular de uma proteína Em uma mistura proteica Ou seja você tem lá como o exemplo que eu dei antes quer saber se aquele tumor é ou não é Ou porque que ele está resistente à radioterapia poder pode ser a presença em excesso de uma proteína antiótica pode então como é que você vai checar se isso tá presente naquela células tumorais ou não Por exemplo fazendo um blog e para você fazer isso

você tem todo uma aparato de block aqui eu tenho um da mostrando justamente o que é necessário então aqui é uma fonte de energia porque isso é ligado na energia em campo elétrico para que as proteínas se separem e para fazer as transferências já já a gente entende vai entender isso eu tenho aqui uma Cuba onde vai colocar este aparato aqui ó que é um aparato onde a gente vai fazer o gel de Poli aquele lamida vai colocar aqui aí eu tenho alguns pentes também para serem colocados Entre esses vidrinhos que onde vai dar o

espaço do gel para formar nos dentinhos e já já vocês vão entender essa minha nomenclatura toda então para a gente fazer o singlot essa técnica nos permite então a identificação de proteínas em um guisado celular esse alisado então ele é submetido a eletroforese eletroforese gente é a separação tá a separação de material biológico por exemplo posso separar DNA RNA proteínas em uma Matriz que seja permeável no nosso caso essa Matriz é um gel de Poli aquela amida que mais que eu preciso eu preciso do SDS SDS é um detergente que vem da sigla em inglês

aqui ó o nome Aliás a sigla corresponde ao nome em inglês que traduzido português é dodecol sulfato de sódio o page que a gente geralmente a gente fala no laboratório vou fazer um SDS page né é o page é o gel propriamente dito gel de poliacrilamida para eletroforese e esse gel então ele determina o peso molecular de uma proteína e separa as proteínas por tamanho molecular então na eletroforese como eu tava falando antes ela permite o que né quando você aplica sua amostra aqui ó e essa amostra ela vai imigrando dessa região mais alta para

essa região mais baixa essas proteínas vão separando eu já já vou explicar pelo qual o motivo que a separação dessas proteínas então a eletroforese como eu falei também não é só para separar proteínas ela permite a separação de moléculas como por exemplo DNA RNA proteínas que no caso do smb lote é a proteína que a gente vai fazer a análise dela procurar essa proteína mensalizado proteico sob influência de um campo elétrico aplicado sobre uma matriz permeável para que a gente faça esse essa separação como eu falei né eu preciso então do gel esse gel aqui

é um gel que já está feito né E aqui é os dentinhos onde a gente aplica a nossa amostra como a gente viu aqui na linguagem anterior deixou Até voltar tá vendo que tem uma pipeta aqui e aqui os dentinhos aonde a gente aplica a amostra que vai ser separada ali nesse gel esse gel quando ele é feito quando ele tá sendo feito pelo pela pessoa que vai realizar o blotting a gente faz sempre dois Jazz separados um gel que a gente chama gel de empilhamento ou estaque em gel e um gel de resolução ou

gel de corrida que também pode ser chamado de Running gel né Eu gosto de falar às vezes o nome em inglês porque de repente a pessoa vai fazer um estágio fora do país e aí A nomenclatura em inglês às vezes ajuda quando a gente tem essa separação entre esses dois jaz o estaque em gel que é o gel de empilhamento e o gel de corrida ou gel de resolução é justamente para que a gente possa aplicar essas proteínas essas proteínas vão ser aplicadas aqui né No começo Então esse gel ele é um pouco menos compactado

tanto é que a porcentagem já que ela Mira dele ou de pole aquela amiga de 5%. aqui as proteínas são concentradas antes de entrarem nesse gel então gel de empilhamento para que todas as proteínas cheguem a Running gel de corrida aqui ó ao mesmo tempo na ausência do gel de empilhamento as proteínas entrariam nos gel de corrida em tempos diferentes e isso poderia resultar em bandas manchadas e tudo que a gente não quer é uma banda manchada ali no nosso no nosso gel né no nosso já que vai ser transferido para uma membrana depois e

já já a gente vai falar sobre isso então o gel de empilhamento está aqui em gel a gente olhar aqui a malha do gel ela é um pouco mais frouxa ela tem um pouco mais de espaço Então as proteínas né vão se elas conseguem se arrumar melhor aqui nesse gel se eu já quando eu comparo se eu colocasse um gel que a malha é mais estreita é mais compactozinho porque porque eu tenho a quantidade maior de Poli aquela vida sempre quando eu dou essa aula para os meus alunos eu faço uma comparação que esse gel

é como se fosse é uma gelatina eu não sei se você já fizeram latinos eu se virar alguém fazendo gelatina a mãe de vocês a Gelatina é o que gente é um pozinho né um pó que a gelatina que se mistura em água quente e aí se espera esfriar e conforme vai esfriando você põe na geladeira essa gelatina ela vai endurecendo ela vai polimerizando e a mesma coisa acontece com o gel se eu pego esse gel diluo Ele nessa solução uma solução tampão que já já eu falo qual que é a solução tampão E conforme

o tempo vai passando esse gel ele vai polimerizando na gelatina se você coloca por exemplo sei lá 250 ml num saquinho de gelatina e aí você quer fazer um teste para saber se a gelatina vai ficar mais durinha ou mais molinha você faz Sei lá esse mesmo quantidade de pó de gelatina você coloca em 500 ml ao invés de 250 ml de água qual dessas duas quantidades de água com a mesma quantidade de pó só que tem mais água menos água a gelatina vai estar mais dura vai estar mais compacta eu tenho menos água ou

seja mais pota concentrado ali a mesma coisa acontece aqui então quando eu coloco mais aquele amida esse meu gel ele vai ter uma porosidade mais fechadinha então ele tá mais compacto se eu coloco menos acrilamida o que acontece eu tenho esse gel com esses poros um pouco mais largos e isso é importante como eu falei para que todas as proteínas cheguem ao gel de corrida no ranie Gel ao mesmo tempo beleza gente bom com isso em mente vou fazer uma pergunta no próximo slide mas eu acho que você já vão saber a resposta que eu

acabei de fazer uma explicação né então a pergunta é o que determina a velocidade de migração do fragmento proteico pela malha do gel que que determina vai ser justamente o tamanho da proteína o tamanho desse fragmento porque a gente sabe que dentro de uma célula a gente tem proteínas de diferentes tamanhos tem as proteínas Às vezes as proteínas maiores zonas até as proteínas pequenininhas né as mais pequenininhas e algumas proteínas de tamanho intermediário ali então tem um diferentes tamanhos de proteínas aí quando a gente faz justamente Essa corrida dessas proteínas no gel no Run em

gel Então eu tenho uma mistura proteica que essa essa mistura proteica então é uma mistura que eu tenho proteínas vamos voltar naquele exemplo lá peguei as células de um tumor que não está respondendo a radioterapia e quero saber se é esse esse tumores expressa ou não é a proteína antipopótica bcl2 que tem um tamanho x lá se eu não me engano acho que é 32 cadeal tamanho da bcl2 só que ela vai estar misturada num grupo de proteínas com diferentes tamanhos né aqui ó a proteína maior essa grandona aqui essa amarela proteína Menorzinha que nem

essa Rosinha então quando eu faço a eletroforese o que que vai acontecer eu tenho a separação então dessas proteínas por peso molecular já que o gel essa malha e a malha eu posso fazer em diferentes concentrações no exemplo anterior era de 12% Então as proteínas maiores vão ficando aqui por cima as medianas vão Parando aqui no meio e as menorzinhas elas conseguem descer um pouco mais Então eu posso concluir que a velocidade de migração do fragmento pela malha do gel depende do tamanho do fragmento e a porosidade do gel depende da concentração da policilamina então

eu posso dependendo do tamanho do fragmento proteico que eu procuro você já tem um conhecimento do tamanho dele eu posso fazer um gel de 10% de aquele Lameda 12%, 18% seja homem conforme eu vou aumentando aquela amida a malha do gel vai ficando mais fechadinha esse gel gente ele é feito do que então de tampão três apolha aquilo amida pode aquilo amida por quê porque aquilo amida aí eu chamo de Polly aquela amida uso também APS que a pessoa fato de amônio ele polimeriza aquilo amida faz com que ela vai ficando mais durinha e o

termed que é um catalisador do aps aí eu preciso fazer o que além do gel né eu preciso tratar as proteínas não depois que eu fiz a extração proteica daquele grupo de células células do tumor ou qualquer outro tipo de célula eu vou ter que fazer o tratamento da proteína e o tratamento da proteína eu começo com eu começo não eu vou fazer com SDS lembra que o SDS aquele detergente do decol sulfato de sódio e esse SDS ele põe carga negativa nas proteínas com SDS deixando todas as proteínas com a carga negativa eu consigo

separar-las por peso e não por carga por isso que é importante usar o STS esse tratamento das proteínas deixar as proteínas com essas cargas misturadas né positiva e negativa atrapalha a corrida certo gente bom então uma das coisas que a gente vai pôr na no tratamento dessas proteínas depois que eu fiz a extração das células é colocar SDS tratar com SD vou tratar vou tratar também com betamercaptor etanol o betamecaptor tanol ele quebra as pontes de sulfídricos a proteína Então eu tenho aqui a proteína dobrada a sua última forma e aí quando quebras as pontes

de sulfídicas Eu vou meio que deixa na proteína naquela primeira conformação dela né que a confirmação um pouco mais linear Além disso eu ainda uso o azul de bromofeno que ele é um corante para que eu possa visualizar a corrida né porque a corrida conforme a proteína vai descendo ali ao longo do gel eu vou vendo ele fica meio roxinho e a gente vai vendo essa corrida e é inclusive é importante para a gente ver a finalização da corrida bom E para finalizar o tratamento dessa proteína então eu aqueço essa proteína essa proteína quando ela

é aquecida no banho seco isso aumenta o efeito do SDS e também ajuda na desnaturação dessa proteína então aqui eu tenho a proteína antes do tratamento assim colocar SDS por exemplo Então tem um a proteína pode ter carga positiva carga negativa quando trato com SDS e depois que o de natura e coloca o Beta makeuptanol a proteína Então ela estica né fica toda negativa então depois depois do tratamento eu tenho intensa proteína pronta para se aplicada no gel para a gente continuar aliás para a gente começar a corrida então aqui é só a preparação da

proteína com a proteína pronta Então o que é que a gente vai fazer né a gente aplica essa proteína então no Gel você pega uma pipeta e vai aplicar a proteína aqui no Gel alguns microlitos você não me lembre exatamente faz tanto tempo que eu não faço um gel de Poli aquilo amido e fala e aplico eu se eu não me engano acho que são uns 10 ou 12 microlitros Ai não lembro eu preciso ver eu lembro que no começo para você quando você vai aprender né tem que ir com a mão bem firme se

você Treme o que você vai petar aqui ó ele pode vazar para o lênin do lado para o dentinho do lado então é importante que você vai com a mão bem firme fazendo as fipetagens porque se você tremer isso vai dar uma atrapalhada ali na hora de você aplicar sua amostra Então você aplica sua amostra depois que você aplica você coloca nessa Cuba né nessa Cuba que a Cuba então de para você você coloca um tampão e coloca esse gel aí dentro aí você começa a corrida nessa corrida então é sempre do negativo positivo lembra

que a gente colocou SDS e a carga da proteína ficou negativa então ela vai entendendo para um para um lado positivo nessa corrida liga a uma fonte de energia e espero o tempo o tempo certo Para que ocorra então a minha corrida e eu vou observando aqui ó a minha bandinha roxa descendo lembra que eu curei então essa coloração é justamente para que eu ver para que Observe essa corrida acontecer aí depois o tempo necessário que acabou a minha corrida eu tenho Então as minhas proteínas separadas por tamanhos separados Então por peso molecular Então desse

jeito tenho a minhas proteínas bonitinhas aqui ó aqui as proteínas todas bonitinhas ó tem um fragmento Digamos que eu procure um fragmento proteico de 60 cadea é o peso certo eu fiz a corrida belezinha aqui aí as proteínas ó estão separadas Eu tenho algumas proteínas aqui com esse peso de 60 assim como tem algumas outras proteínas com outro peso e aí a gente pode fazer a seguinte pergunta essa proteína que tá aí digamos ó aqui em cima do slide eu tô vendo aqui ó fragmento proteico que eu procuro é um fragmento de 60 kda aí

eu pergunto para vocês pensem essa aqui ó essa proteína que tá aqui no gel que tá nessa altura de 60 Essa é a proteína que você procura o que que vocês acham Pensa em um pouquinho a resposta é não porque não gente porque eu tenho diferentes proteínas com o mesmo peso molecular porém não significa que é aquela proteína que você quer então como é que eu faço para descobrir se essa proteína é ou não é a proteína que eu procuro um como é que eu faço isso para que eu faça a descoberta para saber se

aquela proteína que parou ali na altura de 60 porque eu corro um padrão de peso molecular né gente deixa eu voltar aqui ó que eu acabei não mostrando isso direito para vocês então aqui ó nós temos Opa padrão aqui ó padrão de peso molecular isso vem junto com os kits de Wesley eu compro isso E aí o pipeta aqui que são proteínas conhecidas que vão vão entrar no Gel com tamanho já que o tamanho conhecido então por exemplo essa aqui pa de 100 aí eu tenho a proteína de 60 proteínas de 25 A proteína de

10 eu inserir aqui no slide um pouquinho aqui nessa aula um pouquinho mais para frente o padrão de peso molecular mas daqui a pouco eu mostro para vocês aguentem aí mas vamos aqui para transferência então para eu descobrir se é sua proteína de interesse o que é que você precisa fazer você vai ter que transferir essas proteínas que foram separadas para o peso molecular no gel de poliacrilamida para uma membrana essa membrana pode ser uma membrana por exemplo de nitro celulose Porém você não quiser fazer a transferência eu posso pegar esse gel e colorir esse

gel então eu posso por exemplo corar esse gel tomasse Blue ou com nitrato de prata e aí eu vejo no Gel a minha corrida muita gente que vai publicar algum artigo mostrando é o singlot faz dois Jazz é um gel para justamente você mostrar a corrida aí você corta com tomate ou faz impregnação com nitrato de prata e muito cuidado aí com nitrato de prata Viu para quem não conhece nitrato de prata nitrato de prata é um é um pózinho que vem no frasquinho que você compra né e ele é branquinho e às vezes o

povo ia pesar isso no laboratório deixava cair na bancada aí você passava os cotovelos na bancada né para usar a balança para pesar uma outra coisa e aí você manchava a o braço a pele porque o nitrato de prata ele gruda em proteína tanto é que aí tá vendo que impregna aqui né a proteína ele mancha e na pele ele fica um ponto preto e aquilo só sai depois você troca a pele então não sai nem a pau aquilo né depois depois de um tempo que sai então você pode fazer o seguinte você pode coral

e usar esse gel para mostrar junto na publicação ou na sua tese sei lá junto com a com a transferência já já vocês vão entender melhor Vamos ler o tecido aqui ó porém se você precisa apenas mostrar as proteínas separadas no Gel Você pode tratar o gel para a preservação das proteínas com coas e nitrato de prata também Bora para transferência Bora para transferência então como eu falei o singlot Na verdade ele não começou ainda né o que a gente fez foi a eletroforese e no gel de poliacrilamida para que eu tenha para que eu

tivesse a separação proteica por peso molecular por tamanho de proteína aí eu preciso transferir isso para uma membrana nessa transferência então eu vou usar hoje é o que tá lembrando aqui escrito gel Olha que as bandinhas que foram passaram pela eletroforese e separaram e em contato direto com o gel Eu Vou grudar aqui uma membrana de intro celulose ou pvdf essas membranas elas parecem inclusive o rolo dela vem igualzinho a um rolo de papel manteiga já vira o papel manteiga que é usado na cozinha parece com a membrana de hidrocelose você recorta ele você pegar

com bufa Lógico né para não contaminar ali passar gordura da mão nem contaminantes na mão nessa membrana de nitrocerose recorta do tamanho do gel e coloca ele em contato direto com o gel tá vendo aqui ó você gruda uma com a outra nem que gruda né põe em contato e aí você coloca alguns papéis filtro aqui ó tanto de um lado quanto do outro ou você pode chamar de blocos em paper para ficar chique mas é um papel filtro e aí você põe algumas camadas Depois você coloca uma esponjinha depois papel filtro e aí você

Veda depois numa aparato e esse aparato fechado você vai colocar para uma cuba de transferência então depois que você fizer isso por exemplo aqui ó aqui tá o gel aqui tá membrana litro celulose Aqui tá o papel filtro a esponja aí você fecha tudo isso ó pá fechou aqui ó que não tá aqui ó que nem um sanduíche mesmo e insere isso aqui inserindo isso aqui que a sua cuba de transferência você dá a voltagem amperagem corretos e as proteínas que foram separadas no gel de poliacrilamida ela serão transferidas para membrana de nitrocelose vamos ver

como é que é isso aqui como é que isso acontece ó Então as proteínas que foram corridas aqui no Gel foram separadas eu faço que a transferência após a transferência as proteínas serão então a gente pode encontrar essas proteínas na membrana acontece que essa proteínas que foram transferidas para membrana elas não são visíveis Então quando você bate o olho nisso eficiência fala assim será que transferiu mesmo aí você fica na dúvida né olha aqui ó as bandas não são visíveis na membrana após a transferência o que é que a gente faz né tem uma outra

substância no laboratório gente que chama pão só que aliás aquilo tem uma cor muito bonita é um vinho uma cor de vinho assim bem bem forte e aí você trata sua membrana com esse pão só e aí o pão só ele vai revelando a transferência então você passa a ver umas bandas meio rosadas aqui tá em azul mas quando a gente coloca o console fica meio rosa na verdade você fez a transferência não tem banda nenhuma tá não dá para ver nada a membrana continua branca do mesmo jeito que antes da transferência você olha parece

um transferiu nada aqui tá azul só para só para mostrar que teve a transferência mas na real você pega ali o negócio e vê a membrana Branca mas quando você coloca o pão só o pulso ele colore proteína então fica umas manchinhas rosas no lugar das bandas Então você pensou é meio que um confirmatório para mostrar que houve a transferência beleza não é obrigatório colocar o consor Mas eu sempre colocava o pulsor porque fala colocava porque faz tempo que eu não faço um smb lote para saber se realmente teve a transferência e você lava a

membrana algumas vezes e aí a gente vai o quê tratar membrana né porque agora que a gente vai agora que é a parte do és sem blot mesmo vamos ver como é que a gente trata essa lembrando então então com essa membrana já transferidas Lembrando que a gente não vê nada né a membrana vai estar em branco a primeira coisa que eu vou fazer com essa membrana vai ser bloquear os sítios reativos da membrana com uma alta concentração de proteína aí mudou aqui o slides são professor que está mostrando essa vaca aí do lado porque

que tem uma faca isso gente porque geralmente esse bloqueio dos sítios reativos da membrana a gente faz com leite então tem a latinha lá de leite em pó leite Molico que é um leite desnatado a gente coloca no tampão na concentração de cinco microgramas por ml e deixa ali uma hora uma hora e pouquinho esse Leite reagindo com a membrana justamente para que você não tenha a ligação que a gente vai colocar anticorpo monocronal sobre a membrana para que esse anticorpo não ligue em outro em outro local da membrana eu bloqueio a membrana e esse

bloqueio é justamente para tampar todos esses sítios reativos para que os anticorpos que a gente vai colocar já já vocês vão ver aqui o passo a passo né os anticorpos que serão colocados na membrana não se ligue em outros locais então primeiro você faz o que eu bloqueio e a gente faz um bloqueio também com Molico né quando a gente faz a técnica de Elisa para fazer a mesma coisa para bloquear os sítios reativos da placa de Elisa na placa de 96 Poços bom então algo que também é muito importante são as lavagens as lavagens

que a gente faz na membrana a gente faz com um tampão que é o PBS normal tampão fosfato só que ele tá acrescido com detergente o que é o Twin 20 a 0,05 E aí sempre quando a gente faz o sing glog o Elisa e a gente faz a gente precisa fazer as lavagens esse é o nosso tampão de lavagem é o PBS com 0,05% de 20 então o que que a gente vai fazer depois da Lavagem eu vou incubar membrana então com anticorpo primário então se eu estou procurando por exemplo vamos voltar no exemplo

lá do tumor estou procurando a proteína bcl2 que que a gente acha que é ela que tá super expressa no tumor e que tá evitando que a radioterapia faça efeito naquela célula tumoral então eu coloco o quê um anticorpo monoclonal né para quem não sabe anticoncepcional aqui no canal eu tenho uma aula sobre esse corpo no canal dá uma espiada lá uma aula bem interessante também então eu coloco a membrana em algum recipiente nesse recipiente então aí eu coloco o meu anticorpo monoclonal primário anti aquilo que eu estou procurando Então esse centro de corpo aqui

pode ser Anti bcl2 é um corpo específico para aquilo ou seja ele vai ligar nas bandas todas não ele vai apenas na banda que tiver a proteína que eu tô procurando no nosso no nosso exemplo bcl2 mas poderia ser qualquer outra proteína Ah aqui eu coloquei ó anticorpo anti proteína de 60 kda ai tô usando o exemplo do começo ali é que eu achei tão interessante falar do bcl2 que eu acabei meter no bcl2 aqui no meio mas enfim isso não importa o que importa é que vocês entendam a técnica como a técnica funciona aí

depois que eu fiz esse incubação com anticor primário ó o que vai acontecer esses anticorpos eles vão ligando Aonde eles têm que ligar como anticorpo a região variável dele que a região que liga né aqui ó também tem aula de corpo aqui no canal tá gente muito provavelmente Quem tá assistindo essa aula de westing glote já teve aula de imuno básica E aí meio que já sabe Para que que serve os anticorpos as funções anticorpos região variável e região constante a maioria das pessoas já sabe do que se tratam de corpo então de corpo liga

especificamente onde ele tem que ligar então já que o anticorpo ligou é essa é a sua proteína e esse anticorpo Olha que o vidrinho dele eu fiz questão de colocar essa essa legenda aqui no tubo justamente para a gente pensar um pouco mais como se tivesse no laboratório ele é um antissed 60 Rabbit e significa o quê que esse anticorpo no plural ele foi feito no coelho não porém ele é específico para quê para ceder 60D camundongo Mouse Especifique certo ele foi o anticômodo no canal ele pode ser feito dentro de alguma mamífero dentro de

um coelho de uma cabra um camundongo de um rato nesse caso aqui foi feito em que foi feito em Coelho ó antes de 60 Rabbit mas ele é mouse específico então é para detecção da proteína de 60 kda do camundongo certo poderia ser humano poderia ser a quero ver se fosse o exemplo do tumor poderia ser um anteceder não anti bcl2 Rabbit Ou seja que foi feito no Rabbit mas filma específico específico para ver se ele 2D humano entenderam gente então depois dessa primeira incubação que que eu faço lavagem tem que lavar tirar aqueles anticorpos

que não ligaram ali eu sempre faço as lavagens muito importantes isso aí depois que eu fiz a lavagem eu vou fazer a incubação da membrana com anticorpo secundário então a incubar a membrana com anticorpo secundário conjugado a enzima que pode ser a peroxidase por exemplo então aqui voltando a primeira imagem da incubação da minha membrana essa que é a proteína que você procura né A proteína de 60 Cadê a com anticor primário aqui né que tava lá no slide anterior e aí vou fazer a incubação com o anticorpo secundário esse este corpo secundário é um

anticorpo anti anticorpo conjugado com enzima ó esse vermelhinho aqui é um anticoacoante corpo e o verdinho é a enzima peroxidase por exemplo então ele tem aqui ó anti GG ou seja esse anticorpo ele é um anticorpo contra o quê IgG de quem de coelho porque o primeiro anticorpecente de couro pretinho aqui ele não foi feito no coelho Então eu preciso ter o que um anticorpo que ligue aonde em coisas de coelho então por isso que ele é anti Rabbit anti Coelho GG e ó linked hrp linked ou seja ele conjugado a uma peroxidase certo só

que aí até aí a gente não tá vendo nenhuma reação a gente tá acreditando que tem a minha proteína minha banda né de 60 cadea e os anticorpos tanto primário quanto secundário ligaram mas a gente não vê nada a gente não revelou nada ainda para que eu possa obter a visualização eu preciso adicionar na sequência né o substrato da enzima antes de colocar o substrato em cima também faço o quê lava essa membrana né Cada incubação de seja de corpo primário secundário o Molico né o leite para cada incubação pós incubação eu faço uma lavagem

com aquele pedestre aí depois a lavagem eu coloco o quê adiciono o substrato nesse exemplo substrato que a gente está usando é o 4cloro 1 naftal que ele atua na perioxidase então Quatro cloro 1 naftal ele Ó a enzima peróxidada ela catalisa a oxidação do substrato em um produto colorido insolúvel visível que se deposita na membrana quando se deposita na membrana essa membrana vai aparecer uma corzinha na membrana e a banda Então ela é revelada próximo slide eu tenho aqui uma foto disso aqui então a banda fica bem escurinho aqui a minha banda As outras

bandas elas estão aqui ó as bandas de outro tamanho só que como a ligação do anticorpo é altamente específica e eu fiz a revelação agora só no final eu não vou ver não vou não verei as outras bandas e vejo apenas o que veja apenas a banda de interesse e aqui vocês estão vendo que a banda estão ficando mais fininha provavelmente é uma cinética aqui de alguma coisa que eles fizeram E aí eles viram que a Amanda que a banda tá mais grossa tem a maior concentração daquela proteína e aqui a banda tá bem quase

nem aparecendo ó Isso significa o quê Tem algum tipo de cinética que foi feito nesse experimento aí onde foi diminuindo a concentração dessa proteína naquele extrato celular naquele extrato proteico e daquelas células que vieram de algum lugar aqui eu tenho um outro exemplo aqui eu tenho o padrão de peso molecular né que são as proteínas conhecidas aqui eu corri a minha amostra que é esse gel gente é o gel que foi curado com comasse build Blue por isso que tá assim dessa cozinha meio arroxeado E aí eu posso comparar para publicação colocar a membrana de

nitro celulose onde foi feito essa enloud onde foi feita a transferência aí eu mostro que no Gel eu mostro a banda no Gel aí eu mostro a mesma banda quer dizer não é a mesma né porque eu fiz dois dez diferentes um gel eu fiz só para curar o gel e eu ter esse gel e o outro gel eu fiz para fazer a transferência na membrana então aqui eu mostro as duas coisas ó a transferência com anticorpo aqui antes a proteína de 60 kda e aqui a mesma proteína no Gel eu posso fazer isso comparado

e aqui ó no próximo slide foi quando eu coloquei o padrão de peso molecular com proteínas conhecidas ó então por exemplo aqui ó miosina betacalaxy Beta galactose é Albumina sérica bovina ovo Albumina lisozina Menorzinha tá vendo ó Ou seja eu coloco esse padrão de peso molecular sempre quando eu faço o Extra Bloch na eletroforese eu faço a pipetagem da do meu padrão de peso molecular no primeiro Lane ó no primeiro dentinho Aqui é onde eu faço a pepetagem tem gente que faz no final né Eu gosto de fazer no primeiro e aqui segue para as

outras amostras né ao longo do gel segue as outras é porque que é bom eu tenho um padrão de peso molecular é bom justamente para fazer saber mais ou menos aonde tá minha proteína ali minha proteína de interesse né se eu quero procurar a bcl2 que aquela proteína te apoptoide que ela tem mais ou menos 32 kda então ó calhou de ter aqui ó proteína mais ou menos desse tamanho ó aqui eu tenho um peso molecular Entre esses dois tá vendo bom além de fazer a revelação do blotin pelo 4 cloro naftal né fazendo a

deposição desse produto insolúvel visível na membrana eu também posso fazer uma uma eletroquímioluminescência que é chamado de ecl esse aqui é o kit ó para a gente fazer isso nessa eletroquímica membrana com esse com esses dois líquidos eu coloco metade de um metade do outro sobre a membrana Então vamos lá ó incuba membrana com o substrato que me iluminescente que é o ecl aí vai ter reação com a peroxidase né lembra que da peroxidase que é anticorpo conjugado então aqui ó é a membrana de nitrocerose Aqui tá o fragmento proteico esse vermelhinho é o anticorpo

primário purificado que é um anticorpo anti sei lá ou a proteína de 60 hda ou bcl2 né que o exemplo que eu tô usando aqui durante a aula e eu também tenho aqui ó o anticorpo secundário que é um anticorpo anticorpo conjugado com a perioxidase e neste exemplo a gente está fazendo a revelação da banda por Eletro que eletroquímica então ocorrerá uma reação química que emite luz A 425 nanômetros aí vocês podem estar pensando assim mas pro se esse negócio emite luz como é que eu vou capturar essa luz para eu ter mostrar isso para

poder publicar isso gente antigamente O que que a gente fazia Eu Já Fiz muito isso fazer ficar em câmera escura eu pego uma chapa fotográfica sabe lembra quer dizer não sei se vocês lembram se é tão antigo antigamente tinha câmera de bater foto eu tinha eu tinha uma câmera dessa na minha adolescência uma câmera câmera de bater foto que era um filme fotográfico se colocar um filme lá atrás né E aí você rebobinava esse filme para poder levar na no lugar para fazer a revelação das fotos e esse filme fotográfico se ele é exposto a

luz ele vela então vende-se né esses filmes em chapas né chapas fotográficas que como se fosse aquela chapa de raio x já fizeram raio x tipo Ai quebrou um osso vamos ver se quebrou o braço mesmo com braço trincado faz um raio x né aquela Chapa azul aqui não é uma chapa fotográfica que quando a luz é exposta ele vela e fica escuro não é pega uma chapa antiga que vocês vão ver então o que que eu faço eu ponho a membrana em contato com essa Chapa fotográfica Porque a membrana ela foi tratada com esse

L vai ter essa reação química né com a perioxidase ela vai emitir luz e essa luz então que é gerada ela é capturada numa Chapa fotográfica porque se tem luz não achava fotográfica aquela vela e fica essas bandinhas pretas aqui então desse jeito é um jeito diferente de você obter o mesmo resultado você pode fazer diretamente na membrana de nitrocelerose você pode fazer a revelação da banda capturando ela através não colocando a chapa fotográfica o bom dessa técnica da eletroquímica luminescência é que você pode estripar a membrana que que significa isso tirar esses anticorpos aqui

ó tem uma solução de striping você vai tirando esses anticorpos e você pode procurar uma outra proteína usando a mesma membrana sem precisar fazer um eletroforese tudo de novo entendeu então uma das vantagens de fazer eletroquímica justamente essa você reaproveita membrana de nitrocelose para procurar outros fragmentos proteicos já naquela anterior que você você tem a reação do 4 cloro naftal diretamente na membrana aí a membrana vai ter aquele resultado aí você você não pode mais usar membrana porque pareceu a manchinha a manchinha colorimetrica ali não tem muito o que fazer hoje em dia gente a

gente já consegue capturar a luz gerada em uma câmara escura aí você vai ter uma máquina fotográfica ali em cima e essa imagem é enviada diretamente para o computador então já deu uma boa facilitada ali né você já coloca tem um uma câmera escura Você coloca ali a tua membrana já com o SL vai ter na reação química e com essa Câmara em cima essa câmera aliás vai capturando essa luz e isso é transferido direto para o computador e aí você já pode meio que usar para botar na tua tese ou usar para publicar E

aí vai beleza de falar do blotin como teste confirmatório para infecção do HIV o HIV gente é um vírus da imunodeficiência humana que leva a AIDS né que matou muita gente na década de 80 90 ainda vem matando mais com os medicamentos atuais você conseguiu segurar um pouco mais alinhar os óbitos por conta das infecções de HIV inclusive aqui no canal tem uma aula de imunologia do HIV para quem se interessa dá uma procurada aí então quando eu tô infectado com HIV e eu não sabia eu fiz um teste de triagem que pode ser um

teste de Elisa por exemplo ou um teste rápido eu não posso apenas fazer um teste Começar o tratamento então eu faço pelo menos dois testes o teste confirmatório para o HIV é o singlot e como é que isso funciona para isso eu vou ter proteínas definidas do HIV conhecidas separadas é diferente tá gente quando eu pego uma amostra diretamente biológica sei lá peguei as células do tumor extrair as proteínas daquele tumor vou correr aquele extrato proteico que tem várias proteínas que eu nem conheço quais são que vão correr ali no gel de Poli aquela amida

para fazer a eletroforese e vou ter um padrão de bandejamento para fazer esse teste de HIV Eu já faço uma corrida aqui no gel de proteínas conhecidas ó do HIV uma mistura definida de proteínas ver é separada por eletroforese em gel e transferidas para uma membrana aí você pega e transfere essas proteínas que se separou no Gel já pronta você sabe que são proteínas HIV você não tá procurando proteína do HIV certo o que você correu no Gel foi proteína do HIV você já sabe disso E aí o que foi transferido para membrana foram as

proteínas do HIV você já sabe disso né é um pouco o raciocínio é um pouco diferente quando você procura uma proteína que você não sabe no extrato proteico que você não sabe e aqui neste caso você sabe quais foram as proteínas que foram separadas que passaram pelo processo de eletroforese Belê Qual que é o passo seguinte o passo seguinte é você colocar o soro ou plasma do paciente que tá com suspeita sobre a membrana porque porque se o paciente que fez o primeiro teste de gênero positivo para HIV Bora testar em método para confirmar a

infecção do HIV esse outro método é o singlot Então se o paciente a pessoa tem o HIV consigo dentro dela houve uma resposta imunológica com produção de anticorpos anti HIV certo então o que que eu vou fazer eu vou pegar essa membrana de nitrocelerose onde eu tenho as proteínas do HIV que foram passadas pelo processo e vou colocar por cima o soro do paciente colocar então o soro do paciente o soro do paciente vai ter o quê anticorpo anti HIV porque o sistema imunológico reconhecer o vírus e fez uma resposta imunológica com essas com esse

anticorpo anti HIV presente Então nesse soro aí os anticorpos do paciente ó vão ligar onde vão ligar as bandas das proteínas HIV que eu já sabia que eram proteínas do HIV concordam gente então o que que eu faço depois eu vou incubar a membrana com anticorpo anti-corpo humano conjugado com peroxidase adicionar o substrato da enzima e depois eu tenho a revelação dessas bandas é desse jeito que a gente faz já o teste de westing glote como confirmatório para infecção do HIV aí aparecer nas bandas aí meu amigo tá com HIV mesmo bora fazer o tratamento

né importantíssimo tá acabando já a aula gente aguenta aí só vou mostrar algumas curiosidades aqui para vocês agora na verdade é uma curiosidade só tá teve um cara ele foi o primeiro cientista que transferiu DNA que ele fez eletroforese né de um gel para uma membrana assim o nome da técnica ficou salder Block porque aí pegou que o sobrenome do cara para fazer para homenageá-lo como o nome da técnica e por analogia na ordem gloting ficou para transferência de RNA e o s em lote para transferência de proteínas gente é isso que eu tinha para

falar para vocês tá bom acessem as outras aulas se vocês têm dúvidas Me sigam aí nas redes sociais deixem as suas perguntas que na medida do possível eu vou respondendo para vocês tá bom porque também eu sou professor na universidade tem as Minhas alunas meus alunos de laboratório dos alunos que eu tenho que fazer correção de TCC tem as aulas propriamente dita preparação de aulas Então eu tenho uma agenda bem cheia aí né então na medida do possível se vocês forem se comunicando comigo eu vou dando as respostas pelas redes sociais pelo YouTube tá bom

é isso um abraço para todo mundo espero que vocês tenham gostado da aula e nos vemos no próximo vídeo aqui no nosso mundo canal abraço