Video ELISA DIRECTA

técnicas inmunológicas entre las técnicas inmunológicas la técnica Elisa es una técnica muy sensible y Útil para la detección y cuantificación de antígenos y anticuerpos en esta presentación se describe Cómo se realiza un Elisa directo que es el tipo de Elisa más simple y rápido el Elisa directo se utiliza básicamente para la detección de antígeno si bien Su uso es más limitado que otros tipos de Lisa por ser menos sensible y por la dificultad que supone disponer del conjugado que reconoce directamente al antígeno supongamos que hay que preparar una vacuna frente al virus de la hepatitis

b y Para ello se han obtenido por tecnología de ADN recombinante diversas proteínas del virus a partir del Gen correspondiente que ha sido clonado y expresado en levaduras para valorar si alguna de las proteínas obtenidas es inmunológicamente equivalente al antígeno de superficie del virus de la hepatitis b es decir el hbsag se puede utilizar un Elisa directo en este en este caso además de los antígenos en estudio es necesario disponer de un conjugado que reconozca específicamente el hbsag este conjugado está formado por anticuerpos específicos frente al antígeno y que están unidos covalentemente en su fracción

constante a un encima Como por ejemplo la peroxidasa además todas las incubaciones y reacciones necesarias se llevan a cabo en una placa de microtitulación Para Elisa fabricada con un material que permite la adhesión al mismo de proteínas de forma inespe para evaluar la utilidad de los distintos antígenos obtenidos estos se ajustan a la concentración deseada y se utilizan para la sensibilización de la placa de Lisa en cada pocillo se añade uno de los antígenos a estudiar y a continuación la placa se incuba en las condiciones adecuadas muchos de los antígenos quedarán fijados en su pocillo

correspondiente la mayor parte de los antígenos que no se hayan Unido se eliminarán con el sobrenadante aquellos antígenos que pudieran quedar aún sin unir a la placa serán eliminados con tres lavados posteriores realizados con un tampón adecuado el siguiente paso es bloquear los pocillos rellenando todos los huecos que han quedado sin cubrir por el antígeno se evita Así que en las próximas incubaciones se unan a la placa de forma inespecífica otras moléculas no deseadas que podrían interferir con los resultados Como por ejemplo el propio conjugado como sustancia bloqueante se utiliza una proteína que no reaccione

con ninguno de los reactivos utilizados en el ensayo Como por ejemplo la albúmina sérica bobina o bsa se añade la proteína bloqueante a los pocillos y se incuba el tiempo necesario para que se fije a los mismos rellenando así todos los huecos que quedaban una vez finalizada la incubación se elimina el sobrenadante y con él la proteína que no se ha unido a continuación la placa se lava una vez más con el tampón adecuado ahora se añade a los pocillos el conjugado que en este caso son anticuerpos frente al antígeno hbsag Unidos covalentemente a la

peroxidasa y que reconoce de forma directa el antígeno que se busca el conjugado debe incubarse junto con los antígenos en las condiciones deseadas si el conjugado reconoce específicamente al antígeno tras la incubación se habrán formado inmunocomplejos que quedan inmovilizados a su vez al pocillo una vez terminada la incubación se retira el sobrenadante y con él la mayor parte del conjugado libre tres lavados más con el tampón adecuado eliminarán el conjugado que no se ha unido específicamente a los antígenos fijados en la placa finalizados los lavados en algunos de los pocillos de la placa estarán fijados

inmunocomplejos formados por los antígenos iniciales y el conjugado si los antígenos fijados a la placa no son reconocidos por el conjugado utilizado no se forman inmunocomplejos para detectar la existencia de inmunocomplejo se utiliza una mezcla con el sustrato del enzima y un cromógeno cuando el enzima del conjugado es la peroxidasa el sustrato es el peróxido de hidrógeno y el opd puede ser el cromógeno se añade la mezcla de sustrato cromógeno a los pocillos durante la incubación el sustrato se rompe el oxígeno generado hace que el opd se oxide y cambie de color para detener la

reacción se añade ácido a los pocillos el ácido desnaturaliza el enzima y estabiliza el color la reacción positiva Se observa cuando el pocillo pasa de un color amarillento pálido a un color marrón o cremas oscuro es conveniente evaluar las muestras por duplicado o triplicado para evitar errores en la placa que aparece en la imagen las muestras habrían sido evaluadas por duplicado además siempre hay que incluir control positivos en este caso con un antígeno adecuado y controles negativos en este caso sin antígeno los controles sirven para saber que la técnica se ha realizado correctamente así como

de referencia para determinar Cuáles de las muestras evaluadas son positivas y cuáles negativas en este ejemplo serían positivas las muestras con los antígenos que han sido reconocidos por el conjugado anti hbsag y que aparecen rodeadas por cuadros azules Aunque la lectura visual de los resultados es posible en el laboratorio la lectura se realiza norm con un lector de Lisa o espectrofotómetro que aporta una lectura objetiva de los resultados