ELISA - Enzyme Linked Immunonosorbent Assay

E aí e vamos falar um pouco sobre o Elisa um teste sorológico imunoenzimático [Música] que permite a detecção de antígenos ou anticorpos específicos mesmo quando estão em pequenas quantidades e o Elisa se baseia na interação antígeno-anticorpo e funciona através do uso de uma enzima que é capaz de reagir com substrato para causar alteração e sua coloração Mas como isso acontece existem quatro tipos de Elisa o teste direto ou indireto o sanduíche e o teste foi competição aqui falaremos sobre o Elisa indireto [Música] e o Elisa indireto utiliza dois tipos de anticorpos o primário e secundário

o anticorpo primário é o que deve ser detectado em sua mostra específico para o antígeno da sua placa tirar o anticorpo secundário ver junto com o kit do teste Elisa e possui especificidade para os anticorpos primários eles vão se ligar e esses anticorpos possuem uma enzima conjugada a ele para realização do teste normalmente são utilizadas placas com 96 micropoços que já vem com o antígeno fixado em cada um desses Pocinhos a amostra de soro sanguíneo ou seja mostra que queremos saber se possui ou não as coisas específico será inserida no micro poço permitido então que

os anticorpos primários da mostra-se linha aos antígenos dos Poços será realizado uma lavagem para retirada de todos os elementos que não se ligaram aos antígenos da placa inclusive os anticorpos sanguíneos não específicos para o antígeno de interesse em seguida ser adicionado o anticorpo secundário e se ligar aos anticorpos primários já fixados na placa será realizada então uma nova lavagem para retirada dos anticorpos secundários que não se fixaram E então ser adicionado substrato que se reagir a coenzima q foi conjugado ao anticorpo secundário o que causará alteração na coloração do poço essa placa será lida por

um equipamento de detecção quantificar essa out a cor atestando maior ou menor presença do antígeno portanto se minha mostra continha de corpos para o antígeno da placa os anticorpos secundários se ligaram à ele e o posto mudou de cor ou seja minha mostra é positiva o Elisa faz reações de ligação de antígeno com anticorpo invisíveis aos olhos se tornarem visíveis através de tonalidades de cor agora vamos ver como será feito na prática o que utiliza para detecção de anticorpos vem com dilui dois de amostra com o tampão de lavagem que ainda será diluído em água

destilada com os anticorpos secundários já conjugados com a enzima e com a solução que contém o substrato que reagirá com a enzima [Música] EA solução que para a reação do substrato EA enzima Stop Solution vem também com controle negativo um controle positivo [Música] e também o calibrador que será mensurado e permitirá o cálculo das amostras positivas e negativas além da placa que já possui os antígenos fixados além dos materiais do kit é necessário utilizar uma micropipeta multicanal uma micropipeta simples ponteiras [Música] em microplacas para diluição das amostras e calha para os diluentes do que [Música]

para a diluição da amostra colocamos o diluente nas micro placas de 96 Poços Lembrando que as quantidades utilizadas devem seguir as recomendações do fabricante do seu kit e [Música] bom então acionamos amostra lembrando de uma organizar bem [Música] e após diluir todas as amostras essa solução deve ser transferida para a placa de Elisa que veio junto com o kit [Música] E aí [Música] bom então a placa deve ser incubada coberta e estufa 37 graus durante 30 minutos nesse momento os anticorpos específicos se presentes na amostra ficarão fixos nos antígenos da placa [Música] e ao fim

dos 30 minutos a placa deve ser retirada da estufa iniciar o primeiro processo de lavagem o [Música] conteúdo das placas é dispensado Oi e o tampão já de moído é adicionado nos micropoços e dispensado esse processo de adicional tampão e dispensar o conteúdo deve ser feito seis vezes e após as seis lavagens devemos secar a placa retirando todo o excesso de água somente os antígenos e os anticorpos fixados deverão permanecer na placa nesse momento e após seca é hora de adicionar o anticorpo secundário na placa [Música] e então levar para incubar em estufa 37 graus

por mais 30 minutos e após os 30 minutos descartar o conteúdo da placa e repetir o processo de lavagem e secagem aqui teremos os antígenos os anticorpos das amostras e os anticorpos que são secundários na placa é hora de adicionar o substrato devemos contar 10 minutos de incubação e temperatura ambiente a partir do momento em que adicionamos o substrato na placa e após esses dez minutos então adicionado a solução de parada [Música] É nesse momento temos a placa pronta para leitura e já é possível ver a diferença de coloração entre os micropoços e para a

leitura essa micro placa é acondicionado em um leitor de microplacas que faz a espectrofotometria e mede a quantidade de luz refletida e absorvida em cada um dos micropoços esse equipamento traz o resultado numérico em uma planilha e para realização do cálculo de positivos e negativos é necessário seguir as instruções do fabricante e [Música] [Música]