bom dia a todos bem vindos a mais um seminário do centro de terapia celular que no hemocentro de ribeirão preto lembrando que esse é um projeto que é financiado pela fapesp e tem o apoio da onu estado de são paulo e tem como foco diferentes aspectos é da terapia celular tanto nas na fisiopatologia gênese de doenças neoplásicas de sinop muniz como na terapia é destas doenças com células é preparada é ex vivo bom é eu sou hematologistas o professor do departamento de clínica médica da faculdade de medicina de ribeirão preto meu principal foco de pesquisa são a processo de oncogênicos é eu trabalho em particular com modelos de leucemias agudas mas hoje vou falar pra vocês uma área nova uma área que tem aumentado o interesse não só no nosso centro mas também é teve um grande número de estudos é ponto de vista internacional indicando de o papel do microambiente na progressão tumoral em particular eu vou tá falando aqui de uma célula que são os macrófagos associadas à tumba bom acho que o a primeira noção básica a gente tem que ter é que desde o início da formação do tumor você tem a presença de células do hospedeiro é e que essas células não estão ali é por acaso elas participam do problema do do processo dentro de um balanço tanto de atividades antitumorais uma atividade pro morais as principais células que estão presentes ali nesse nessa massa tumoral são os filmou vários associados ao câncer que do inglês é quem só sei que foi base em células de resposta inflamatória e células derivadas da medula óssea em particular precursores industriais ea moto poéticos a origem dessas células é variável algumas delas se originam dentro da própria massa tumoral outras se originam na massa tumoral e advém também da medula óssea ou do sangue e no caso das células endoteliais é importante também uma transformação através da transição e critério mesma e ainda otério um exemplo bom o tema do meu seminário hoje eu vou me concentrar em células da resposta inflamatória essas células são impostos macrófagos células natural killers e células dendríticas e o processo em que elas estão envolvendo as nature gênese tem a ver com a inflamação crônica inflamação crônica é considerada como um dos roma mark é um dos estados estatais fundamentais duas das marcas do processo do câncer células que estão muito bem definidas que estão envolvidos nesse processo de inflamação crônica incluem impostos segue até 17 é positivo cd4 positivos macrófagos não são qualquer mais próximos são os macrófagos associados à tumor daqui pra frente como está denominando de tam neutrófilos associado ao tumor ou neta o o células nk te do tipo 2 em mastócitos e como essa inflamação crônica contribui para o processo de angiogênese através de liberação de citocinas de fatores de crescimento de protease em particular metaloproteases que tão capazes de gerir a membrana basal do tecido ea liberação de fatores angiogênicos no seu conjunto elas participam do próprio processo de estímulo da célula tumoral são portanto existe uma alça onde a célula tumoral estimula um microambiente um microambiente estimula a célula tumoral na formação de novos vasos no processo de angiogênese e mesmo no processo de invasão com moral ou seja um processo que vai dar origem às metástases afunilando um pouquinho mais nós temos nós vamos lá falando dessas células dos próprios associados ao humor então essa é uma gravura que eu retirei da internet desta página mostra um tumor murino em que as células é em verde são as células neoplásicas tão marcados com flores e nina e as células em rosa vermelho são os macrófagos que estão infiltrando este tomou portanto eles observam que existe um grande número de macrófagos associado ao tumor e o que eles estariam fazendo lá os mais próximos em si de modo geral não só os associados morno eles não são uma população já celular homogênea é já sabia há muito tempo que há um terceiro gama algumas situações se nas produtos microbianos como o lps ativa uma prova chamada via clássica faz com que eles têm um fenótipo funcional que foi denominado dm1 mais recentemente se viu que um outro grupo de citocinas em particular em teresina 10 interesse na 13 interesse na 4 ativam uma prova uma via alternativa com um perfil diferente tanto funcional quanto do genérico e fenotípico e esses próximos passaram a ser chamados de m2 e naturalmente por exclusão aqueles que não estavam ativados passaram a ser chamados de 10 enquanto as funções clássicas palocci ticos numa cróton existido fundamentalmente pelo próprio do tipo m 1 o m2 parece ser uma prova algo que favorece a imunossupressão então ele seria tão dos macrófagos são duas sua população de macrófagos que têm funções opostas e isso a gente vê entre diferentes características né então destaque aqui esse é um é um drama produzido motor rani colaboradores já publicadas há alguns anos que mostra algumas características então podemos vale o m1 são as características que estão aqui a à sua esquerda e o m2 à direita a gente vê que no m 1 por exemplo é mais comum a expressão dos receptores toll do tipo 2. 3 que isso vai diminuindo e por outro lado no m2 existem alguns marcadores não totalmente específicos mas bastante sugestivos como o cd 163 eo receptor de classe 3 do dado do fc receptor de arte da imunoglobulina que é identificado pelo cd 23 veja que nasce toxinas ela o perfil de citocinas reflete muito bem a função diferente entre os dois grupos enquanto o m2 por exemplo nós temos um receptor de khoy da interleucina um e um receptor é rh e enterrada de ensinar um que basicamente são receptores que diminui a resposta internacional dois portanto são receptores que é desfavorecem a resposta do tipo l um do outro lado numa prova onde tem uma resposta há interesse na um muito importante ao tn efe a fifa também muito importante lógico e como esperado ao interno porque esse é o indutor do do m1 e nasce na citocinas nós também temos um perfil diferente onde vou destacar aqui o ccl 2 que ele é importante que o tático para os mais próximos de irem para o a massa tumoral e por último também uma diferença metabólica nuno m 1 vai ter um predomínio do metabolismo da argentina onde a enox a aaa é induzida ela é bem expressa e tem um papel importante funcional ao ponto que o m2 predomina o metabolismo da arj nas bom o que nós já sabemos em relação às vacinas em particular alcina cc ea progressão tumoral então a cl 2 eu já mencionei acerto ela é encontrada em baixas concentrações em particulares foi demonstrado em melanoma acerto está associada a um aumento do perfil nenhuma destruição das células tumorais à medida que você tem um aumento da concentração dessa situação china há uma polarização no sentido m2 e aparentemente ela passa a favorecer a progressão tumoral então esse é um fenômeno que ocorre com várias situações ou é onde dependendo da concentração você pode ter um fenótipo um comportamento induzido é entre outras situações que são encontradas no ambiente tumoral nós temos as xl 8 que comprovadamente hindus angiogênese a ccl 18 que está associada à energia dos linfócitos t ea ccl 22 que está associada à polarização dos linfócitos t no sentido th2 portanto também um sentido de menor e rosa antitumoral ea associação entre esses macrófagos lá entre os titãs ea aiea o filtração do tumor então é só pra gente lembrar os macrófagos eles dirigiram em sua maioria dos monopostos tripulantes estão portanto ele tem que ser atraídos por tomou e como é que eles vão pra lá é as células do próprio estroma tumoral e alguma em alguns casos células tumorais em si secretam fatores como o vegf u a msf que atrai os monstros então pra infiltrar a massa tumoral isso é provado um ponto de vista experimental e animais nocaute tão animais não foi ativado o gene do msf e se demonstrou que nesses animais existe uma menor progressão tumoral uma menor infiltração portanto é ao menos num modelo de câncer de pulmão importante que é modelo de livro além disso não só se force tema menor progressão do tumor primário mas também tem o menor número de metástases é existe a possibilidade embora isso não parece ser verdadeiro pra todos os todos os tumores de uma origem intra tumoral dessas células é uma baixa expressão por exemplo do receptor do cc 2 tem tumor de ovário inibe a transição entre o nosso macrocosmo sugerindo a formação local desses é tumores associados a microsoft associados à a tomou peço perdão pela qualidade é que ficou conhecido laid isso é uma meta análise realizada por esse autor sangue colaboradores e que analisou a relação entre a presença dos tam e o desfecho de diferentes tumores estão aqui ele lista estudos clínicos em que foi avaliado a infiltração portanto o ponto de vista de histopatologia e se isso estava associado a um pior prognóstico à sua direita ou ao melhor prognóstico à sua esquerda e vejam que de maneira geral embora os estudos não sejam homogêneos o resultado dessa meta análise é que a presença de mais profundo dos oceanos a tumor no tecido tumoral está associado a um pior prognóstico só algumas questões pendentes podemos falar várias questões pendentes mas essas são as que ocorrem em que eu acho muito importante a gente discute aqui é então não sabemos por exemplo o que determina a maior ou a menor infiltração do tumor uma falei que existe com certeza um papel das citocinas mas isso não parece ser um fator e além do mais que fatores por sua vez determinou a menor ou maior expressão desta ou daquela situação então não é uma questão se resume ao mediador dessa química táxi é que fatores que determinam a popularização da célula macrophage consentido em mim o m2 é um dos fatores clássicos eles foram determinados em vitro é muito importante para determinar se isso inviável e em diferentes situações que reflitam a as práticas clínicas situações clínicas é existe muito pouca informação sobre tam e neoplasias hematológicas não há porque elas serem diferentes uma vez que na medula óssea nós temos os precursores no sítio certo não sabemos exatamente o papel do tam muda ao longo da sua origem gente sabe que o papel das citocinas de algumas torcidas a gente já sabe que mudamos a câmera genius vamos sabendo exatamente o que acontece com os macrófagos propriamente dito lógico se não este isso pode ser explorado do ponto de vista terapêutico então a pergunta que eu vou tratar com esse estudo que nós desenvolvemos nos últimos dois anos quando 62 anos é se o estado por sepse interfe interfere na progressão tumoral aumentando ou diminuindo a infiltração por tam se ele também pode interferir na popularização dos macrófagos um sentido m2 e se isso for realmente o caso a nossa hipótese é correto seria possível e inibe esse processo e qual seria o efeito desse processo na progressão tumoral irá abordar a lei antes disso porque o estado por sexo né então é esse é um é uma curva de sobrevida do tipo papandayan então aqui lanches nós temos o tempo e no eixo y a sobrevida com ativa e aí então comparado às duas populações com população de pacientes que não sofreram sépsis na curva tracejada ea população de sobreviventes as apps e vocês observam em que para indivíduos da mesma idade nós vemos que os sobreviventes das apps morrem mais precocemente têm um prognóstico pior ele isso não é o prognóstico da sépsis quem nós sabemos que aproximadamente metade dos pacientes que sofrem ceps vão sobre esse sobrevento já resolver o seu processo infeccioso já resolveram suas complicações como é a vida deles a longo prazo e é nós vemos por esse estudo populacional que não é um bom prognóstico uma das questões envolvidas nesses estados o estado pois sépsis é a imunossupressão então existem várias é com vários estudos demonstrando que o estado processe um estado de muita pressão muitas dessas contribuições foram feitas pelo laboratório do senhor fernando cunha aqui nessa faculdade é esse é um estudo por cavazzani colaboradores em que usando um modelo animal decex de sobreviventes de certas ela analisou a infiltração o tamanho do tumor ea infiltração do tumor por células t regulatórias e demonstrou que havia um maior aumento de células t regulatórias e um tamanho moral maior nos sobreviventes a analisar é é a pergunta que de da influência do dada por sexy nos macrófagos associados à tumor nós utilizamos adaptamos um modelo que foi desenvolvido pela sociedade com inúmeras o fernando cunha no qual nós fazemos a ligadura e e perfuração do século certo então com isso a 1 uma os tratamentos de conteúdo fecal no peritônio e esses animais têm uma certa família eles são tratados com o antibiótico de largo espectro ou atendem a 0 e por um período e nós com um período de três dias e nós na verdade estamos interessados nos animais sobrevivem a esse processo aqui simplesmente mostrando então a curva sobrevida né então a se estes animais não receberem tratamento foi tratado só um salina todos eles morrem entre a e 36 dias enquanto os que recebem tratamento 1 com o antibiótico metade deles só sobrevive têm uma sobrevida bastante longa é essa população que nós vamos lutar é é analisado já sabemos que essa população é emo suprimida também por um trabalho é de descaso do senhor josé carlos faria do grupo fernando cunha mostrando que é a suscetibilidade desses animais a infecção por legionella é maior ea mortalidade associada a esta infecção por legionella também é maior mas isso é só para ilustrar o modelo que nós adaptamos para o nosso interesse aqui que era a progressão tumoral nós vamos lá falando agora de melanoma e estão utilizando uma célula que é do melanoma murino que o bê 16 em que expressa lúcifer a dar certo então o que nós fizemos nós utilizamos modelo de ligadura do século sobreviventes e após vários dias 21 de resolver isso é feito de faz nós injetamos as células do melanoma e acompanhamos esses animais nós como nação montando os modelos testamos diferentes doses de inóculo moral pra saber qual é a profissional de injetarmos muitas células talvez você perca maneira de acompanhar suas injetá muito poucas ela pode ser que você não tenha tido ok então esse aqui mostra que de fato é os animais que sofreram o o processo de sexo e foram inoculados após 15 dias né clp então 15 dias o que significa isso com as células do melanoma desenvolveram tumores de maior tamanho nesse caso medidos por pelo pac mêtro então esse tempo por volume temporal e analisamos isso também por bioluminescência acerto em que a gente vê claramente que a massa tumoral dos animais sobreviventes as apps foi muito maior que isso é uma ilustração com 10 mil células mas esse processo se repetiu tanto para 10 30 ou é sem os céus além desses tumores serem maiores esses animais naturalmente sobreviveram - então é onde fica mais evidente estão aqui na curva é com um representado por círculo são os animais que simplesmente não sobreviventes da a sepse não foram inoculados com tumor esses aqui são aqueles que não os não sofrer um processo de ligadura do século não sofrerão set e foram injetados no melanoma e aqui os que foram sobreviventes a 7 e foram inoculados com meu nome mas nunca vemos claramente que esses são os animais que morrem mais precocemente em maior quantidade isso é válido pra trás três para os três golos de novo mas é muito mais claro com 30 mil células e por isso mas em muitos outros experimentos aqui nós onde está essa quantidade de novo além de enxertia do tumor foi mais freqüente nos animais que sofreram ceps então aqui nós temos quantos dos de todos os animais que injetei quantos desenvolver o tumor ea gente vê que nós não detecta muita diferença quando o inóculo tumor é muito alto se você lula muitos e todo mundo vai encher tá mas quando a gente usa o inóculo menor de 10 no céu a gente vê que tem uma diferença oito dos 20 animais controle selvagens desenvolveram humor ao passo que 16 dos 20 mas dos 20 animais que sofreram saques e mia desenvolveram é enxertia do tumor isso é significativo uma questão é bom mas o tom analisando animais que sofreu 17 foram inoculados conclua após 15 dias então criou-se uma doceria isso muito precoce será que nós ainda estamos vendo modificações que foram induzir é sc não estão vendo um fenômeno duradouro então nós desenvolvemos um a mesma metodologia para animais que foram injetados 30 dias após a 7 60 dias após um certo e os resultados reproduz maiores tumores menores sobrevivente então portanto o efeito mundo prestou o sexo ele é duradouro enquanto as metástases bom número de animais que tinham desenvolvido metástase nos diferentes órgãos então aqui só tem um tanto o pulmão dentro dos vasos como no pulmão invadindo parente uma fígado cérebro linfonodos e analisando todos ao mesmo tempo mas não detectamos nenhuma diferença no número de animais que é que tinha um é a sepse é desculpa pelo chão metástases nesses órgãos porém quando a gente analisou o número de focos metastáticos nesses animais ou seja estão aqui nós temos é a formação que dê de uma massa tumoral de um foco do moral no pulmão a gente viu que o número de focos era muito maior nos animais sobreviventes acerto bom mas será que isso é um efeito que a gente observa exclusivamente dependente do tumor primário ou também o esse foco metastático tem uma evolução diferente nos animais então as ot ficamos um pouco o nosso modelo city fazíamos as apps injetá vamos no de 15 o o o as células b 16 e no de 14 nós retirarmos do tumor primário não quer dizer o animal se ele fosse morrer ele morreria da metástase e não do tumor primário e o que a gente vê a mesma coisa a sobrevida dos animais por sexo representada aqui nessa turma 1 foi mais curta do que dos animais selvagens e o volume dessas metástase então isso a gente fez através de um modelo mais simples em que a gente injetava endovenosa o inox moral e analisava os pulmões é após 18 dias e testamos tanto no número de de focos como por bioluminescência no pulmão sua opção por um dos animais que foi retirar de vocês observam então que a a massa das metástases era muito maior nos animais sobreviventes acerto bom mas a pergunta central aqui é os macrófagos associados ou tomou algum desses defeitos estão associados a mudanças humanos nos próprios associados ao tumor então nós utilizamos um marcador se tomem por citometria de fluxo que é o f 4 80 que é um marcador de uma prova e dentro desse marcador de uma prova nós utilizamos dois outros marcadores que é o cd 206 serve mais para frente vai aparecer um outro marcador que aí sim é um marcador mais específico para os maus os associados ao tumor e naqueles animais que foram injetados com 30 mil células nós vimos que a presença dos fãs era muito maior nos animais sobreviventes as apps do que nos animais é controles e isso é a gente ver tanto para os animais que sofreram sete foram no plástico tumor após 15 dias mas também reproduziu em animais aos 30 e os 60 de 60 dias nós estamos por mais um método deu certo então além da simetria de fluxo nós também fizemos a mesma marcação aqui por é no florescência vocês consigam ver aqui mais a o as células tumorais vocês podem podem identificar fez um corte do tumor então as células aqui os lucros estão marcados por dap e os macrófagos tão marcados com f 4 80 ea gente vê que tem muito mais marcação no grupo brigadas no grupo que sofreu sobrevivente a sexy do que no grupo é sair do hotel aqui isso é a contagem desse experimento bom mas será que isso então é um fenômeno ao tópico ou nós podemos transferir isso ter um animal receptor era próxima pergunta nós é fizemos o o animal o modelo de sobrevivência às apps sacrificamos esse animal fizemos a extração da medula óssea e separamos né jogamos os macrófagos uma técnica de invitro acerto foram diferenciados estes macrófagos de animais sobreviventes das apps ou de animais na if acerto foram então com inoculados naquele mesmo modelo que eu já mostrei pra vocês da série de progressão moral com as células b 16 e aí nós medimos o tamanho do moral e os demais parâmetros e aqueles aqueles inóculos que possuíam células macrophage originadas de sobreviventes a sepse produziram tumores de maior volume quando implantadas no receptor aqui indicado pelos círculos preenchidos e também pela leitura de bioluminescência indicando que essa massa tumoral realmente era maior portanto é essa era uma um modelo onde poderia é transferir essa característica do doador para o receptor e esses animais também sobrevive aumentam os receptores de com inóculos de um de animais de sofrer um certo de uma sobrevida mais curta do que os animais live agora nós precisamos saber se esses é é uma próximos tinham alguma característica em particular uma das maneiras de você analisar isso que se aproxima mais de 10 em 1 m2 se existe alguma via que eventualmente possa está mais envolvida foi através da análise de expressão gênica usando macaé então nós isolamos os fãs destes animais na i&d animais pó sepse é ficar uma situação de reais numa análise clássica expressão gênica esse aqui então é o gráfico vulcão na época no porte comparando então o a ata de animais por sexo um tanto mais na ii vejam que a diferença não é tão gritante é que o relativamente um número pequeno de gene foi encontrado diferencialmente expresso entre essas duas sub populações nós encontramos na verdade apenas 61 gene hiper expressos e noventa e oito genes impõe expressos lembrando que aí a comparação é o sepsi versus aí portanto nós fizemos a análise do componente principal é nós vemos aqui em azul são os animais anahí em marrom a otan por sepse existe uma proximidade grande que nós já imaginávamos baseados no número pequeno de diferenças mas o que nos surpreendeu muito foi que na verdade isso a gente comparar com os animais o disco perdão os macrófagos é m2 diferenciados em vivo em r 2 elas estão aqui representados em vermelho sem um só representados em preto então na verdade ele não é propriamente em m2 mas com certeza também não é um m 10 então parece ser um cluster relativamente diferente e nós não temos ainda muita explicação porque essa é justamente a estudar mais para saber porque tem esse comportamento de destaque entre os genes que foram encontrados diferencialmente expresso não temos genes associados agali a genes associados à produção de algumas 6 x 6 x e neto receptores contra os próprios gigantes e como ipi expressos nós encontramos algumas alguns genes do grupo fixou o acerto marco e dentro eo que é são de modo gerais a associados a diferenciação ea ativação é macrophage como a gente já esperava pois nós passamos a analisar a concentração sérica de citocinas nessas condições então nós temos aqui a representação da concentração sérica nos animais daí comparados aos animais sobreviventes acerto com cento mouro são as duas colunas à esquerda ou com humor são as duas pernas à direita então com tumor sempre usando a mesma quantidade de nóqui naturalmente estão sempre falando do modelo b 16 melanoma entre os achados mais significativos nós vemos que existe um aumento da concentração sérica de tnf alfa nos animais sobreviventes a série e ponto morto do tgf beta e do cx l12 isso o cx ser idoso em particular nos interessou muito porque ele é um potencial candidato a ser exatamente oq mil atraente para os monócitos para formar mais macrófitas associados ao tumor e por isso nós investimos então na exibição dessa via dessa sinalização então existe uma droga que o md é 3. 100 que é um inibidor do receptor do xxl 12 que é o ex-servidor se chama cxcr4 então nós fizemos o nosso modelo e tratamos os animais o décimo dia após a inoculação do dado inóculo de melanoma com um de 3.
100 e medimos a progressão tumoral ea sobrevida desses animais o que a gente observou aqui em azul representado enquadrar são os animais na iv tratados com o emmy de 3. 100 e aqui em marrom com o triângulo invertido os animais sobreviventes da série de tratados com a mesma droga é e o que a gente viu é que esse tratamento resultou numa menor massa tumoral nos animais sobrevivem 17 estão tumor por tempo aqui neste mesmo é a correlação com a sobrevida foi a mesma onde os animais que foram é tratado com o amd 3. 100 representados aqui em losango sobreviveram um de forma mais longa que os animais tratados convém é bom mas isso está associado a uma maior ou menor infiltração pelos próprios associados tomou nos repetirmos aquela análise por citometria de fluxo com a marcação com f 4 80 o cd 45 o marcador de antígeno leucocitário comum certa utilizar com um ambiente para a seleção das dessas células e nós observamos que os animais que foram tratados com md é 3.
