(Parte 4) Aula - Expressão e purificação de proteínas recombinantes

O que a gente utiliza aqui pela pela possibilidade que nós criamos com o uso do nosso plasmídio PET 28A é a cromatografia de afinidade. Aqui a gente vai usar uma resina de níquel ou cobalto. Aqui nesse caso dessa foto é uma resina de níquel, tá?

que seria ali o que eu diria que seria a fase a fase estacionária, tá? Eh, esses metais eles têm afinidade com essa tag de restidina inserida na extremidade n terminal da proteína alvo, tá? Aí a fase móvel vai ser o tampão de lis que a gente utilizou anteriormente em primeiro em primeira instância, tá?

O lisado ele é misturado com a resina. para promover a ligação da proteína com a resina, tá? Posteriormente, após algumas lavagens, né, com o próprio tampão de leise, a gente vai utilizar um tampão de eluição.

Esse tampão de de eluição, nesse caso, vai ser um tampão muito parecido com o tampão de lise, com o mesmo pH, tá? Mas a diferença é que a concentração de midazol que já havia um pouco no nosso tampão de de lise vai aumentar bruscamente. Por que o imidazol?

O imidazol ele também tem muita afinidade com esses metais. Então, quando a gente coloca uma pequena concentração de imidazol no nosso tampão de lise, é para evitar que algumas outras proteínas que tidina e não são necessariamente a nossa proteína ou proteínas não necessariamente que tidina, proteínas que vão se ligar inespecificamente à nossa resina, não se liguem por conta do imidazol que vai se ligar um pouquinho com a nossa resina, enquanto a nossa proteína também está se ligando. A partir do momento que a gente aumenta demais a concentração de imidazol, a competição fica muito grande e o imidazol se liga a resina, fazendo com que as nossas proteínas se desliguem da resina.

E a partir disso, a gente vai pegar a nossa nosso sobrenadante do nosso tampão de lso tampão de eluição. E nessas eluições serão os momentos em que a gente vai começar a obter a nossa proteína. Então, toda elição que a gente fizer, vai sair ali uma certa quantidade de proteína.

Nesse caso, a primeira eluição é que sai maior quantidade de proteína, pelo menos nos meus casos. Pode ser que você precise fazer várias eluições até que a sua proteína de fato saia da resina de eh de níquel ou de cobalto e vá pra pra fase móvel que é o tampão de iluição. Esse tampão de iluição é atirado.

Então a gente considera que esse tampão de iluição é onde há a nossa proteína purificada, porque a gente imagina que outras proteínas não vão se ligar a essa cromatografia de afinidade pela alta especificidade, tá? A partir disso, a gente tem diversas formas de analisar se a gente realmente expressou e purificou a nossa proteína de forma correta. Aqui nesse caso, a gente vai usar eletroforese desnaturante, o caso dos SDS page, tá?

A a eletrofarese desnaturante de proteínas é uma técnica que separa as proteínas de uma amostra de acordo com o seu peso molecular, tá? A desnaturação, ela é intencional para eliminar outras características da proteína que possam afetar o nosso resultado da eletroforese. Então, a gente vai usar essa essa esse esse esses agentes desnaturantes das proteínas para eliminar todas as outras características, a não ser o peso molecular delas.

Então, elas só vão ser analisadas em relação ao seu peso molecular, tá? a gente usa o SDS, né, do SDS Page, que é o dacil sulfato de sódio, que é um detergente desnaturante, tá? Ele vai desnaturar nossas proteínas.

Então, as nossas proteínas vão ter uma uma estrutura terciária, uma estrutura 3D. E a partir do momento que a gente usa o SDS, elas são linearizadas, tá? não necessariamente 100% linearizadas, mas elas perdem essa essa característica 3D delas, essa estrutura delas, ó, são desnaturadas e elas ficam todas as proteínas que estiverem numa amostra vão ter cargas negativas agora, tá?

Eh, além disso, a gente usa um agente redutor que é o betamer capito etanol para quebrar pontes de sulfeto que possam haver, por exemplo, entre resíduos de cisteína dentro de uma proteína, tá? Então, a gente quer totalmente eliminar a estrutura 3D da proteína, tá? Eh, e aí o que acontece?

Eh, a gente vai interpretar esse resultado através do deslocamento das proteínas. A gente vai usar um padrão de tamanhos que a gente conhece os tamanhos de algumas proteínas e a gente vai entender. Se a gente tá usando um gel, a eletrofesa é feita com um gel.

Se a gente tá usando um gel e aplicando uma diferença de potencial naquele gel e as proteínas estão andando porque elas têm todas uma carga negativa, então essa diferença de potencial vai fazer com que elas se desloquem. As que são mais pesadas vão ter, ou seja, maiores, com maior peso molecular, elas vão ter mais dificuldade de passar pelos poros do gel, enquanto as com menor peso molecular vão ter mais facilidade de passar. pelos poros do gel e vão se deslocar mais.

Então, a gente vai usar o deslocamento relativo para calcular aproximadamente o tamanho da nossa proteína, o peso molecular dela. E aqui a gente tem como interpretar um resultado de eletroforese. Aqui eu usei uma imagem em que eu tenho um resultado de eletrofese.

Não necessariamente está certo ou errado, só pra gente entender um pouco. Então esse gel ele vai ser colocado em uma cuba que vai passar uma uma diferença de potencial, né, gente elétrica ali nesse gel. As proteínas que você colocou em cá, a gente faz alguns pocinhos aqui, cada pocinho, elas vão correr.

De um dia pro outro você vai usar um corante que se chama comace blue. Existem outros tipos de corante também, tá? Esse aqui é bem comum de se usar, tá?

Como assim blu? E o que vai acontecer? Vai deixar esse gel completamente azul.

Mas a partir de um tempo em que em que esse gel começa a se descorar ali na água ou em uma solução descorante, só as proteínas de fato ainda vão continuar com a cor que o comumsi blue deu para elas, tá? Então, a gente vai só observar as nossas proteínas aqui. Percebam que nesse poço um eu coloquei um padrão de peso molecular.

Um padrão de peso molecular geralmente é comercializado, tá? é uma pequena solução, uma alíquota que tem uma, tem ali cinco proteínas que tem o seu tamanho eh o seu peso molecular conhecido, tá? Então aqui esse 14 é 14 kaltons, 21 kaltons, 31 kgs, 45 kaltons e 66 kodons.

Esse padrão aqui, ele é utilizado porque eu já sei que a minha proteína ela não é tão grande, não é tão pequena. Ela tá mais ou menos ali nessa faixa entre 14 e 66 kodtons de peso molecular. Aí vai depender muito do tamanho da proteína, qual é o o padrão que será utilizado, tá?

E o que que a gente vai fazer? A gente vai basicamente ver qual é a o deslocamento da proteína em relação ao padrão. Então, essas são proteínas que foram aplicadas.

E a gente vai estimar mais ou menos qual é o o peso molecular delas. Por exemplo, aqui a gente tem duas bandas muito juntinhas. Perceba aqui que tá entre 31 e 21.

a gente pode utilizar uma régua para fazer um deslocamento relativo, usar uma regra de três, por exemplo. E a gente vai ver aqui que mais esses essas duas bandas estão mais ou menos em 23, 24 kaltons, que é o tamanho mais ou menos da minha proteína aqui. Essa é a mesma mesma proteína aplicada duas vezes, tá?

E essa daqui é uma uma segunda proteína que não é nenhuma dessas duas, tá? Perceba que tem um deslocamento menor. Já podemos saber que essa proteína é maior que essas daqui.

Tem um peso molecular maior porque teve mais dificuldade de se deslocar ao longo do gel. Então ela tá aqui entre 31 e 21 também. Essa proteína aqui tem aproximadamente 27 kaltons de peso molecular.

a gente pode perceber que ela realmente tá aqui. Veja aqui que a gente também tem outra outra banda aqui que é mais ou menos o dobro. Pode ser talvez um agregado, um artefato, um erro na nossa eletrofora.

Existem erros que acontecem por por uma prática. Depende, depende do seu dia no laboratório. Às vezes algumas coisas simplesmente não dão certo, mas a gente consegue saber que a proteína tá pura, por exemplo, se a gente não tivesse nenhuma banda além da banda que tem o peso molecular mais próximo dela, tá?

Então essa é uma forma legal de si eh ter certeza que a gente purificou de fato a nossa proteína. M.