Olá, eu me chamo Helena Gabriele de Oliveira Costa, sou doutoranda da Faculdade de Ciências Farmacêuticas e hoje eu irei dar a minha aula do curso de verão em bioquímica e biologia molecular, que tem como tema tipo de estreptomistas sucumbaenses e meio sólido, metabólito primário e secundário. Fala sobre o meu tema, é necessário em fazer uma breve introdução sobre o que é a estreptomista sucuma. Qual é uma bactéria filamentosa, qual possui uma forma semelhante a de fungos filamentosos?
Conforme essa imagem de Muramatso, nós conseguimos ver ali todos esses filamentos apresentados pela estreptomenses. Ela tem uma ramificação que busca nutrientes metabolizando a matéria orgânica relação de enzimas extracelulares. Além de tudo, ela é uma bactéria grampositiva e é uma espécie de actinobactéria pertencente à ordem dos actinomicetales, que nada mais são do que aquelas bactérias que crescem em solos.
Ela tem também um alto conteúdo de guanina e citosina. As estreptomes produzem uma substância volátil, a geosmina. Isso é um fato curioso.
Josmina nada mais é do que aquele odor característico de chuva, que também é chamado de petricor. Elas têm uma capacidade de desenvolver metabólitos secundários bioativos, como, por exemplo, antifúngs, antivirais, antitumorais, iminucipressores e antibióticos. Um fato interessante é que a primeira bactéria do gênero de estreptomisses a ter o mapa genético totalmente mapeado foi a estreptomissis coil color.
E foi aí que começou a se descobrir um grande potencial pro desenvolvimento de fármacos a partir destes metabólitos secundários. Elas têm uma forma de micélio vegetativo e aéreo quando cultivadas em meio sólido e um genoma circular com transcrição de 3. 300 genes, sendo que a maior parte codifica sequências utilizadas em complexas diferenciações morfológicas e uma biossíntese dos metabólitos secundários.
Nessa imagem você pode ver ali a formação dos metabólitos secundários da estreptom sucumbaenses em um cultivo no meio sólido. Pode se notar que ela tem ali uma coloração alaranjada quando liberado xes metabólicos secundários. Já a parte esbranquiçada é ali o início da esporulação dela.
E para se estudar o cultivo, não necessariamente precisa somente ter o conhecimento dos microrganismos. É também necessário que ocorra um estudo e conhecimento dos meios de cultura, porque os meios de cultura serão aqueles que irão influenciar na produção dos metabólitos destes microrganismos. Então, o que são os meios de cultura?
Eles nada mais são do que substâncias que se destinam ao cultivo de microorganismos no laboratório. Os meios de cultivo devem conter substâncias exigidas pelos microrganismos. para o crescimento e multiplicação destes.
Para que os microorganismos eles consigam realizar a síntese de seus próprios constituintes celulares, os meios eles precisam dispor fontes de carbono, fontes de nitrogênio e fontes de eh de energia. Sabe-se que a estreptomas sucumaenses, ela tem uma grande necessidade ali de nitrogênio, oxigênio em alta escala e carbono. Eles também são necessários que contenham alguns sais minerais, vitaminas e outras substâncias que favoreçam o seu crescimento.
E aí, quais são as diferenças entre os sólidos e meios líquidos? O meio líquido é aquele em que os nutrientes eles estão dissolvidos em uma solução aqua. Já o meio semisólido é aquele que possui na sua composição, além dos nutrientes, uma pequena porção de um polissacarídio proevenente de algas marinhas, mais conhecido como agar.
E o meio sólido, ele já tem ali uma grande escala na porção doar quando preparado. Então como nós podemos selecionar o meio de cultura ideal? Além de conhecer muito bem o seu microorganismo e as necessidades dele?
Nós temos que saber quais são os tipos de meios de cultura que tem. Nós temos ali o meio enriquecido, que além das fontes nutricionais usuais são adicionados, este meio de cultura permite o crescimento de microrganismos exigentes que necessitam de fatores de crescimento. Um exemplo desse é estreptomi sucucumbências.
Nós temos também o meio simples, que possui os nutrientes essenciais pro crescimento dos microrganismos pouco exigentes. E o meio seletivo, ele é um meio que favorece o crescimento de determinados microrganismos em detrimento de outros e geralmente devido à adição de substâncias inibidoras. Nós temos também por último o meio diferencial.
Esse meio possui substâncias que evidenciam uma característica que permite separar um grupo ou uma espécie de microorganismo. E aí, como nós selecionamos o meio de cultura ideal? Como tudo, os meios possuem ali pontos positivos e negativos.
E aí, quais são os pontos positivos do sólido? Ele tem uma excelente manutenção para ele ele serve ali para uma excelente manutenção das cepas em laboratório e facilita na identificação de contaminação. Então, através do meio sólido, é possível apenas de olhar você ver se tem uma contaminação ou não devido às características do crescimento das colônias ali no ágar.
Porém, ele impossibilita o uso em sistemas airados e em ausência de crescimento de certas espécies e microrganismos. Sistemas airados nada mais é do que os sistemas de fermentação. Já o meio líquido, ele possibilita o crescimento celular através da difusão de gases ou outros nutrientes durante o processo e aplicabilidade em grande escala.
Então o meio líquido ele já possibilita que você trabalhe em fermentadores e também faça ali uma grande escala, vamos supor, para produções industriais. O meio líquido, um outro ponto contrapartida, ele facilita a contaminação em larga escala, diferente do meio sólido. Então aqui nós temos os pontos positivos e negativos do meio líquido e meio sólido.
E aí, quanto à composição, nós temos ali o meio quimicamente definido, que é aquele que contém tipos e quantidades de substâncias químicas conhecidas e específicas e o meio complexo ou quimicamente não definido, que é aquele que contém componentes conhecidos normalmente de origem animal e vegetal, mas a composição química varia qualitativa e quantitativamente de um lote para o outro. o que dificulta também a sua produção, porque muitas vezes pro início do cultivo é determinado ali um protocolo e este protocolo deve ser seguido e os meios eles não devem variar ou mudar de um lote pro outro. Ele sempre deve manter ali eh seguindo a risca o protocolo que foi estabelecido, porque isso daí pode muitas vezes prejudicar o crescimento e a produção destes metabólos.
E aí os meios de semeadura para cultivo, que são as formas que nós fazemos ali a semeadura, né, os repiques, muitas vezes chamado assim, quando vai fazer o cultivo no agro. Então ali nós temos o isolamento, que consiste na obtenção de uma cultura pura, colônias isoladas de um único microorganismo. Temos que separar de outros que se encontram no mesmo material.
E para isolar uma cultura são utilizadas técnicas de semeadura, que são o método pela qual se transfere um inóculo microbiológico de um meio de cultura ou material a ser analisado para um outro meio de cultura, que é aonde você vai fazer a cultura definitiva. Essa técnica de semeadura por esgotamento, que é a que está aqui na imagem, é uma das mais utilizadas quando se quer isolar culturas puras em amostras ou culturas mistas. formando colônias isoladas e possibilitando a identificação, né, dos microrganismos que cresceram nesse meio.
Então, eh, aqui nós temos alguns tipos de técnica. O primeiro é o power plate ou disseminação, método em profundidade. É necessário que você transfira uma quantidade da cultura para a placa de petro vazia e aí você vai colocar o meio difundido nesta placa sobre a cultura e homogeneizar suavelmente com movimentos circulares, conforme é mostrado aqui na imagem, seguindo este movimento na placa de petre.
Qual o objetivo desse tipo de semeadura? A contagem bacteriana, ele é utilizado para análise de microrganismos anairóbios, adicionando uma outra camada de meio de fundido após o endurecimento da primeira camada. Então você pode utilizar ali nessas duas necessidades.
Muitas vezes ele é mais utilizado na contagem bacteriana, que é quando você quer saber qual é a escala de crescimento das colônias no seu cultivo. E aí nós temos o estria simples, que ele é para transferir uma alçada da cultura pro meio sólido em placa e estrear, estriar, né, com a alça bacteriológica, fazendo ali o segmento de zigzague, que é a estria sinuosa o nome, ou uma linha reta sobre o meio. O objetivo dessa técnica é utilizada aí para visualizar determinadas propriedades metabólicas.
Então ele tem como produ como a produção de enzimas hidrólicas e produção também de pigmentos que eh esses microrganismos podem liberar. E aí nós temos o esgotamento em estrias ou estrias múltiplas, que foi aquela que a gente falou lá no início, o esgotamento. Ele eh para fazer você precisa transferir uma alçada da cultura pro meio sólido em placa e estrear com a alça bacteriológica sobre o meio.
Então você vai fazer essa movimentação de zigue-zague por três vezes, não deixando assim que eh uma estria toque na outra. Eh, ele é utilizado para se ter obtenção de colônias isoladas, como foi dito anteriormente. Então, irá crescer colônias em determinados pontos desse zigue-zague, não estando todas unidas.
e também para reduzir o inóculo a cada estria. Eh, pode-se alternativamente flambar a alça entre uma estria e outra também para que não tenha contaminação. Já o spre plate ou de extensão, que é o dessa segunda imagem, você vai transferir uma uma quantidade, né, da cultura pro meio sólido na placa e espalhar uniformemente com a própria ponta da pipeta ou muitas vezes utilizando essa alça que é conhecida como a alça de eh Drgusk.
Eh, ele é utilizado para obter o crescimento confluente ou muitas vezes para contagem bacteriana. Essa técnica, ela é muito utilizada na realização também de antibiogramas. E aí nós vamos falar aqui como é feito o cultivo da estreptomice sucumbarências.
O padrão de cultivo da estreptomicesis geralmente requer condições laboratoriais específicas. O objetivo do cultivo, ele pode variar desde o isolamento para manutenção ou produção de metabólitos. Então é necessário que você tenha o conhecimento dessas técnicas de semeadura.
conhecimento dos meios de cultivo, para que você possa determinar ali qual o tipo de cultivo, o objetivo dele, como que você vai realizar ele para conseguir obter ali, sejam os metabólitos secundários ou até mesmo as colônias. Então, o que que são esses famosos metabólitos que a gente falou aqui durante toda essa aula? Nós temos ali dois tipos de metabólito, o primário e o secundário.
Agora eu vou falar um pouco e apresentar sobre o metabólito primário. Ele é responsável pela reação catabólica ou anabólica, que resulta em um aumento na produção ali da estepomis, que nada mais é do que a biomassa. O metabolito primário, eles são reações que levam ao aproveitamento da energia e ao poder redutor, que por sua vez são usados para sintetizar os blocos de construção de proteínas, ácidos nucleicos, lipídios, polissacarídeos e materiais estruturais e de armazenamento.
E aí os metabolitos primários tem ali o controle do metabolismo primário do estreptomiceto que reflete na disponibilidade dos nutrientes que a estreptomista vai ter ali, o microorganismo vai ter. A variedade e multiplicidade das vias catabólicas dos carboidratos reflete na variedade e multiplicidade do carboidrato no solo a qual ela está crescendo. Essa multiplicidade de vias levou o estreptomiceto a investir em redes regulatórias específicas e globais, como por exemplo, a repressão da glicose.
E aí nós temos o metabólito secundário. Eles são compostos naturais produzidos com o objetivo principal de proteção e estress a estresses, né, abióticos e bióticos. Os metabólitos secundários, eles agem tanto como agentes químicos na destruição de outros microrganismos e no aumento da sobrevivência do organismo produtor no ambiente.
Muitas vezes já foi comprovado por estudos que a estreptomes ela tem o maior desenvolvimento desses metabólitos secundários quando submetida a estresses e até mesmo contaminações no ambiente em que ela está. Por quê? Porque esses metabólitos secundários nada mais é do que um mecanismo de defesa muitas vezes para esse microrganismo, aonde ele consegue ali se adaptar ao ambiente ou muitas vezes liberando ter uma comunicação entre colônias que estão ali no meio de cultivo para que elas consigam entender o que está ocorrendo e assim se proteger, se defender dos das contaminações que podem estar tendo ali aonde elas estão.
O metabolismo secundário produz moléculas de adaptação que evoluíram para funções diferentes daquelas do metabolismo primário. E aí, através desses metabólitos secundários e muitos estudos que eh foram ocorrendo ali em cima da produção deles, acabou-se que descobriu o potencial farmacológico químico. Então aqui nós temos alguns exemplos dos que foram desenvolvidos a partir desses metabólitos secundários.
O primeiro é o herbicida bialafos, que foi produzida pela estreptomices zicroscópicos, a estreptomicina produzida pela estreptomicesis griseus, o cloronfenicol produzida pela estreptomicis venezuelai, o ácido clavulânico, produzida pela estreptomices clavuligeiros. E por último, o tacrolimus, famoso FK506, um imunossupressor importantíssimo, referência na rejeição de órgãos no tratamento, né? E ele é produzido pela estreptumes sucumbaenses.
E aí nessa imagem nós podemos ver aqui o exemplo da produção de metabólitos secundários por algumas espécies da estreptomisses, né? E aí aqui no canto nós temos a produção dos metabólitos secundários pela estreptom sucumbaienses num tom avermelhado. Então assim, ao mesmo tempo que os estreptomicetos passam por diferenciação morfológica, eles também têm ali uma diferenciação fisiológica.
E isso levou à proposta de que um dos critérios para nomear um composto como metabólito secundário era que ele fosse produzido após a célula crescer. E aí todos os genes envolvidos na biossíntese e resistência a um determinado metabólico secundário estão agrupados em um único loxus do genoma, onde são rigidamente controlados. Os reguladores de metabólitos secundários têm sido geralmente identificados como mutações genétic eh genéticas.
E essas mutações genéticas levam a superprodução de um metabólito ou muitas vezes pode ocorrer de não ter a produção deste metabólito. E aí a liberação dos metabólitos secundários pela estreptomitos comoenses. A liberação ou mais precisamente a indução e otimização da produção deste metabólico secundário estatomi com cumbarências é feito através de ajustes nas condições de fermentações executivo.
Então, nós temos ali as fontes de carbono que servem para evitar o uso de substrato rapidamente assimiláveis, como a glicose, e em alta concentração. E muitas vezes isso pode levar a reprimir a síntese desses metabólitos secundários, que nada mais é do que a repressão catabólica. Já a fonte de nitrogênio, alguns estudos mostram que a adição de fontes específicas, como o extrato de levedura e peptona pode aumentar significativamente a taxa da produção do metabólito alvo, que é o tacrolimos.
Conforme aqui essa imagem, nós podemos ver a estrutura dele, que é o famoso imunossupressor. E aí é um controle de nutrientes. A produção de metabólicos secundários geralmente ocorre na fase estacionária do crescimento bacteriano, quando a limitação de algum nutriente essencial, como por exemplo o nitrogênio ou o fósforo.
Então, tendo este conhecimento sobre a fonte de carbono, a fonte de nitrogênio e o controle de nutrientes, possibilita você selecionar o melhor meio para a produção deste cultivo que leve a produção destes metabólicos. Então aqui eu selecionei três meios que são exemamente famosos e utilizados para o eh para o cultivo da estreptomissumaes. Em primeiro, nós temos o meio ISP, que é o International Streptomissis Project Tum.
E aí ele fornece o quê? Ele fornece os nutrientes essenciais, como extrato de levedura, extrato de malte, dextose, que eh dextrose, que é a glicose, que promovem um crescimento robusto desses microrganismos. Então aqui, eh, eu passei os componentes utilizados.
Então, nós podemos ver aqui que ele contém tudo que é indicado necessário pro crescimento do microrganismo. E aí ele tem que tá em condições adequadas. Sabe-se que o pH essencial é entre 7,0 e 7,3.
O a temperatura necessária pro cultivo da estreptomícias é a temperatura ambiente. Então ela sempre deve estar entre 27 a 30º. E assim faz com que eles expressem os perfis de desenvolvimento e produção desses metabolitos secundários.
Segundo, nós temos o TSA. Ele é extremamente rico como fonte de nitrogênio. Ele é o tripitic soy agar, né, que nada mais é o caldo da triptona de soja.
Em agar, a combinação de caseína e peptona de soja, onde deixa o meio altamente nutritivo. Então aqui nós temos treptona, eh, peptona de soja, cloreto, fosfato, glicose e o pH ali entre 7,3. Por último, nós temos o meio gin, que ele é o glucose e a estaltose, um meio rico em glicose e carbono, mas ele também fornece ali a peptona, a qual é uma fonte de nitrogênio.
Esses componentes, eles fornecem nutrientes essenciais, como fonte de carbono, nitrogênio, vitamina e mineral, necessário para o crescimento e desenvolvimento dos microrganismos, contendo também o pH em 7,2. Então aqui eu apresento os meios essenciais, como realizar esse cultivo, como você ter um conhecimento das fontes essenciais ali para o crescimento, desenvolvimento dos metabólitos secundários e do microrganismo que será cultivado. Nós também temos que ter um conhecimento além do microrganismo para que possamos estar fazendo bom cultivo e entender como manusear, como mexer, o que eles precisam pro desenvolvimento e assim conseguir ter ali sucesso no cultivo e produção desses metabólitos secundários.
Aqui deixo as referências utilizadas e o meu muito obrigado por essa aula e pela atenção. Espero que vocês gostem e aproveitem bastante esse conhecimento adquirido.
