agora a gente chega a parte 4 e última do delineamento experimental vamos falar sobre minimização de erros como resolver o problema da irredutibilidade uma das coisas é identificar corretamente as unidades experimentais se é um rato é um rato se é uma célula é uma célula se é uma rata prenha é uma rata prenha se é uma gaiola é uma gaiola e não os quatro ratos que estão dentro desta gaiola é conhecer os efeitos que influenciam os desfechos minimizando Então as fontes de erro Como assim minimizando as fontes de erro se você já sabe que tem
algo que afeta sua variável um barulho afeta um experimento então vamos fazer o experimento no local em que o ruído seja controlado ao invés de fazer o experimento sem a condição controlada e a posteriori querer retirar um dado porque você não gostou porque naquele momento talvez tenha tido um barulho é e também aumentar a capacidade de generalização dos dados incluindo intencionalmente fatores de variabilidade Quantas unidades experimentais a gente tem aqui unidades que são alocadas de maneira independente e randômica para uma condição por exemplo um rato uma ninhado uma gaiola uma placa de Cultura o poço
em uma placa de cultivo é isso que você aloca de maneira independente que você faz uma randomização quem que eu vou tratar vai ser o rato ou vai ser a rata prenha vão ser os filhotes ou a rata é vai ser então um efeito que você tá vendo alinhada e não nenhum rápido então por mais que você tenha uma rata prenha tendo uma ninhada de 10 filhotes você tem um n de um Como que você lida com isso você precisa de vários NS 1 para ter um n de 10 Poxa vida mas cada ninhada tem
10 ratos eu vou precisar então sem animais no total para ter um n de 10 sim exatamente isso que significa mas para cada um desse grupo de 10 o que que eu faço você tira a média e isso vira um n igual a um Essa é a unidade em que você randomiza o tratamento é onde que eu vou tratar as minhas células Elas já estão distribuídas nos Pocinhos se ela já estão distribuídas nos passinhos e somente a partir daí você faz o tratamento cada Pocinho é um n Mas você faz um tratamento em um animal
e você tem uma placa em que você enche a placa com 96 passinhos do mesmo animal ou n é de um porque quem você é randomizou para um tratamento foi um animal já as unidades biológicas são as entidades sobre as quais gostaríamos de fazer alguma referência queremos entender humanos queremos entender ratos queremos entender células e as unidades observacionais É onde a medição é feita eu falo bastante da rata prenha porque frequentemente a gente estuda os filhotes então a randomização acontece na unidade experimental rata prenha mas a medição é feita em um filhote e somente aqui
nas unidades experimentais em que a gente tem replicatas legítimas que de fato aumentam o n amostral Considerando o desfecho a gente tem efeitos do tratamento efeitos biológicos efeitos técnicos e o erro experimental por exemplo efeitos de tratamento que pode ser um tratamento pode ser o ambiente pode ser um composto pode ser uma lesão uma intervenção que você fez é aquilo que você quer ver se causa um efeito no seu desfecho a gente tem efeitos biológicos como o sexo a idade a linhagem do animal que você tá utilizando algumas vezes esses efeitos biológicos também podem ser
feitos do tratamento ter efeitos técnicos como a ordem a sequência que você faz o experimento o horário a leva no seu experimento Então você faz um experimento com duas cortes de animais você faz um experimento você pega os animais no mesmo dia do mês mas primeiro você faz com metade dos animais e depois você faz a outra metade dos animais porque seu experimento é muito demorado para cada unidade experimental e você precisa de um tempo para processar essa informação toda é para realizar esse experimento Então você acaba tendo levas diferentes e a gente tem os
erros tratamento erro de tratamento eu experimental erro amostral e erros de mensuração a gente vai falar um pouquinho mais sobre eles agora então erro de tratamento é quando o seu tratamento não é igual para todos por exemplo uma administração intraperitorial um animal pode ter recebido mais do que o outro e algum animal pode ter tido um erro no volume da seringa veio uma bolha você tá tratando com uma suspensão ao invés de uma solução E aí você não misturou antes de colocar na seringa um procedimento de erro na injeção em si acabou sendo intramuscular isso
afeta a farmacocinética isso pode ser reduzido por treinamento e por seguir protocolos a gente tem erros experimentais que envolvem a variabilidade individual dos animais Então você tem uma situação em que você espera ver um comportamento de medo esse animal todo arisco nesse ambiente onde ele recebeu o choque nas patas esse eu esperava mas se animais que podem estar bem tranquilos nesse mesmo ambiente isso é natural isso é inerente a espécie inerente a variáveis biológicas a gente tem erros amostrais Será que amostra selecionada é representativa da população Será que o método que você escolheu para alocar
animais em um grupo ou outro foi de fato apropriado todos esses erros podem ser reduzidos por aumento do n das unidades experimentais inclusive erros técnicos sim você alivia erros técnicos tendo um n maior mais claro aí entra um princípio ético é interessante ter um n maior para você ter resultados mais conclusivos sim mas essa é a última etapa você deve fazer tudo que for possível antes de recorrer simplesmente ao momento via Força Bruta que aumentar o n Total a gente tem erros de mensuração por exemplo aqui a gente tem uma subjetividade no comportamento animal Digamos
que a gente esteja avaliando o tempo de mobilidade desse rato nesse cilindro com água definiu que a imobilidade pode ser difícil e duas pessoas podem discordar a mesma pessoa pode discordar dela mesma se ela for analisar um vídeo em um dia e cinco minutos depois na verdade e além disso além desse erro da subjetividade E aí de novo a importância do segmento para pessoa não ser enviada também tem uma outra questão se esse é um teste que é utilizado para avaliar comportamento tipo depressivo Será que realmente está medindo nesse teste o que é medido aqui
tem a ver com depressão mesmo esse teste esse modelo tem uma boa validade de constructo se ele não tivesse medindo aquilo que ele se propõe a avaliar ele não tem uma boa validade isso leva um erro de mensuração a gente tem erros de mensuração por fatores um pouco mais técnicos também como essas imagens desses botes acontecendo aqui se você tem botes que são pouco confiáveis que vende amostras de modelos animais você acaba tendo que tem um n maior para conseguir compensar essa falha técnica isso vem da experiência técnica isso vem da calibragem dos equipamentos ruído
de fundo qualidade dos reagentes Às vezes a gente recebe um reagente mas precisa de mais de um e a gente recebe um agora e o próximo só vai vir daqui 6 meses fica guardado no freezer a gente tem quedas de luz Será que tá funcionando bem ainda a gente tem alguns problemas logísticos que acabam influenciando nos nossos resultados também então esses erros podem ser reduzidos por validação de reagentes calibragem de equipamentos realização das análises em duplicatas duplicatas que não aumentam o n mas reduzem o erro técnico Por exemplo quando você faz uma Elisa e você
faz em duplicatas você reduz um erro técnico de pipetagem se você fizer em triplicatas você vai reduzir ainda mais um erro técnico vai sair mais caro mas você tá reduzindo um erro técnico é utilização de modelos com melhor validade de constructo que avaliam aquilo que de fato você gostaria de avaliar mas possíveis soluções então individualmente para resolver o problema da reprodutibilidade a gente tem que ter um bom desenho experimental um bom planejamento estatístico e há uma falta de randomização e uma falta de Line falta de segmento e o que é curioso é que os artigos
que não relatam randomização em blindney possuem tamanhos de efeito maiores curioso não é é digamos que você esteja avaliando um efeito de um tratamento um efeito se um fármaco tem um potencial efeito antidepressivo quando os autores não relatam que a randomização foi feita isso faz com que o efeito seja maior Ou seja o tratamento funciona mais do que quando a randanização não é feita isso cheira a viás isso cheira a que algo mais aconteceu aí na prática toda de procedimento científico envolvendo esses estudos que levam a gente a ter na verdade uma menor Confiança dos
dados que é curioso um tamanho de efeito maior acaba fazendo com que a gente fique mais suspeito por falta de procedimentos de renderização e de blinding randomização como que a gente faz isso quais são os procedimentos para a gente fazer o que que é randomização é alocação aleatória das unidades experimentais em grupos que isso vai ser feito sem viés consciente ou inconsciente em geral fazer randomização gera grupos com médias parecidas tanto para os parâmetros conhecidos como desconhecidos se você randomizar adequadamente um grupo de animais entre um grupo controle e um efeito modelo de uma doença
muito provavelmente você vai ter os dois grupos com o peso corporal muito parecidos entre eles antes do experimento começar em tamanhos de amostra pequenos é impossível ter grupos completamente iguais mas arrandamos ação ainda assim ajuda então por exemplo aqui a gente tem esse grupo de animais separar a metade de baixo para um grupo e a metade de cima para outro não é uma boa prática de randomização porque não foi aleatória Separar uma gaiola inteira para um tratamento e outra gaiola inteira para ser um grupo controle não é uma boa prática A não ser que você
saiba que o seu tratamento vai interferir com os outros animais da gaiola você dá um ciclo estimulante para um animal Você precisa fazer isso cronicamente se com estimulante deixa os animais agressivos e vão afetar os animais controle a ponto de contaminar o seu experimento não faz sentido você se você já sabe disso a priori sabe que afeta o experimento não faz sentido você mantê-los da mesma gaiola Seria o ideal se não afetasse mas se afeta você já não pode fazer isso e se você não domina essa gaiolas para um tratamento quem é a unidade experimental
a gaiola não importa que tenha 10 camundongos numa caixa grande você tem um n experimental de um a randomização ela também acontece quando você tá pepetando então os equipamentos acabam não lendo exatamente igual em todos os pontos de uma placa ou o gel não corre todo igual em um lote então é importante que tenha uma randomização de como vai ser feita a pipetagem coisas que acontecem também as experimentos dos controles e um dia e os tratados em outros controles de manhã os tratados à tarde ou começar o experimento pelos controles e terminar com os tratados
são procedimentos que não são adequados a gente tem variação entre dias a gente tem ritmo cerca de anos o experimentador fica cansado estressado isso pode afetar o experimento a estabilidade dos reagentes pode não ser tão estável assim pode não ter uma boa estabilidade fazendo com que mude ao longo do tempo Ok mas às vezes a gente já tem alguns fatores conhecidos se você tem machos e fêmeas você já tem peso corporal você já sabe onde estão as gaiolas você pode fazer o que a gente chama de block que é alocar igualmente machos e fêmeas entre
os dois grupos um erro experimental muito grande pode ser devido a variação muito grande entre unidades experimentais e unidades experimentais formarem subgrupos por exemplo machos e fêmeas Digamos que todos os seus controles sejam machos e todos os seus tratados sejam fêmeas Poxa mas aí você tem uma diferença de sexo junto seria ideal que eles estivessem adequadamente mesclados pelas unidades experimentais estariam agrupadas em bets em grupos formando subgrupos como no caso aqui machos e fêmeas ou se você tem um grupo tratado e um grupo controle e ao fazer a randomização ou não fazer uma boa randomização
você acaba que tem um grupo controle com maior peso corporal e o grupo que vai ser tratado com o menor peso corporal eles estão partindo já com alguma diferença e realmente a gente teria o mínimo de diferenças possíveis antes e aí que entra o blog Digamos que a gente tenha esse grupo de animais aqui e que já tenha alguma diferença conhecida entre as bolinhas rosas e as bolinhas azuis a gente pode fazer o procedimento de Blocker que é o que é separar aqui esses pares e sortear entre controle e tratado controle e tratado controle e
tratado controle e tratado isso vai garantir uma maior homogeneidade entre os seus grupos um exemplo aqui de como essa homogeneidade pode acontecer eu sorteei números aleatórios usando esse site aqui randon.org eu sorteei um n de 10 para um grupo A e um n de 10 para um grupo B aleatoriamente então isso foi feito de maneira completamente randomizada a gente tem os grupos a e b não há uma diferença estatisticamente significativa entre a e b mas o b não parece um pouquinho mais para baixo parece Tem como melhorar isso tem como melhorar se a gente pega
esses dados e organiza eles numa única coluna e agora organiza eles do maior para o menor e para cada dupla se no caso a gente quiser a formação de dois grupos cada dupla é sorteada para um grupo A ou B A BBA Abba assim por diante aqui vocês podem reparar que eu fiz uma inversão né ABBA ABBA e o seguir esse padrão oficialmente Tem que haver um sorteio para cada dupla para ser da maneira mais randômica possível mais aleatória possível isso que tá feito aqui sortear cada dupla para um grupo é o que a gente
chama de randomização estratificada que é uma é um subtipo do Blocker isso vai fazer com que a gente tenha grupos mais homogêneos no início do experimento então quando a gente compara a distribuição aleatória com a distribuição após a randanização estratificada a gente parte de uma homogeneidade muito maior entre os grupos eles compartilham as mesmas médias e a mesma variação nem sempre a gente tem dados preliminares para poder fazer uma randomização estratificada mas sempre que você tiver É adequado utilizar fazer o uso disso o blocking ele pode ser completo ou bem completo Como assim incompleto Digamos
que você tem uma gaiola com três animais Mas você tenha os seguintes níveis dos fatores você tem o seu grupo controle e você tem três doses controle mais três doses tá 4 mas você tem gaiolas com três animais Apenas não tem como ter todos os grupos dentro da mesma gaiola então o Block fica em completo mas se o tratamento não afeta de maneira significativa o seu grupo controle presença de um animal tratado não é esperado que afete o grupo controle é melhor que você tenha o máximo de grupos possíveis dentro de uma mesma gaiola então
melhor você ter esses grupos ainda que não todos dentro de uma mesma gaiola do que apenas um tratamento por gaiola quanto ao blinding e segmento então o Blind e o cegamento serve para redução do viés inconsciente em ensaios clínicos a gente tem ensaios cegos single Blind em que apenas a pessoa voluntária participante do estudo não sabe o tratamento que ela tá recebendo mas os avaliadores sabe e a gente tem ensaios duplos Cegos em que nem o avaliador e nem o voluntário nenhum deles sabe qual é o tratamento que está sendo aplicado o cegamento só vai
ser quebrado no final na hora da análise dos dados em ensaios clínicos a gente só tem um ensaio cego e quanto mais etapas forcego melhor quanto mais cego melhor por exemplo não saber que os ratos um e dois são do mesmo grupo é uma coisa boa de se ter mas é pouco viável você pode soluções A e B você sabe quais animais você vai tratar com a a e você sabe quais você vai tratar com a b você não sabe o que é a e b uma outra pessoa preparou para você excelente mas melhor ainda
se você não soubesse o que você tá injetando se você tá injetando A ou B se você injeta a no rato um e a do rato 2 você sabe que os ratos 1 e 2 pertencem ao mesmo grupo e isso seria melhor se você não soubesse mas pera aí agora Ficou esquisito como que eu não vou saber como que eu vou pegar o conteúdo na seringa e administrar para o animal bom Outra pessoa faria isso uma pessoa colocaria na seringa te Passaria o conteúdo você administraria sem saber o que está administrando pouquíssimo viável o mais
importante é cego no final na análise algumas situações é pouco viável também o segmento porque você precisa saber de dados prévios para poder fazer randomização e alocação nos grupos o segmento acaba sendo complicado mas tenta fazer o máximo possível E é claro relate até que ponto foi cego isso é extremamente importante quanto ao uso de controles a gente costuma ter controles positivos e controles negativos por exemplo um grupo veículo em um tratamento é o seu grupo controle negativo a gente tem por exemplo um experimento em que você tem o grupo Salina E você tem um
fármaco com possível efeito antidepressivo que vai ser testado Poxa mas ambos os animais vão receber uma injeção ou uma gavagem ou um alimento diferente para aqueles consumo o fármaco Será que isso teriam efeito Será que a injeção teria um efeito então você pode adicionar um grupo Na Ivi que não recebe a injeção Então você tem o grupo soro fisiológico o grupo Na Ivi que não recebe a injeção e o grupo que recebe o tratamento o que seria o controle positivo neste experimento se eu estou testando um fárma com possível efeito antidepressivo eu posso adicionar um
controle positivo que tem um efeito antidepressivo conhecido o ensaio está funcionando como deveria isso ele não estiver eu volto no ponto de até quando a gente tem que validar e otimizar o modelo e padronizar o modelo até que ele funcione de acordo com a literatura Porque tudo que é controle positivo só vai ser publicado quando der o resultado esperado de um controle positivo mas quantas pessoas será que já testaram o controle positivo e não viram nenhum efeito será que esse controle positivo ele é tão bom assim mesmo por um lado a gente espera que não
seja porque se a gente tá testando nesse caso aqui antidepressivos porque a gente testa possíveis a gente depressivos porque os que a gente tem disponíveis não funcionam tão bem quanto a gente gostaria então é esperado que justamente esses controles positivos que vem dos antidepressivos que não funcionam tão bem quanto a gente gostaria não funcione tão bem nos nossos próprios modelos animais é outra coisa é o controle simultâneo versus o controle histórico então a ideia do controle é controlar para fatores desconhecidos além de ser um parâmetro de referência é o controle histórico serve para você avaliar
puxa Será que o parâmetro que você tava olhando uma contagem de células ou fator inflamatório tá mudando ao longo do tempo enquanto você acumula dados ao longo de vários anos no laboratório então o controle histórico tem essa função a função que ele não tem é servir de grupo controle para um experimento é você fazer uma análise estatística em cima dele então a gente tem que ter um controle simultâneo para realização de um experimento Um Outro fator é o alinhamento de experimentos que tem durações diferentes ou grupos que acabam tendo duração diferente Você vai testar algo
que o tempo é inerente você quer ver se fazer algo por um exercício por uma duas ou três semanas vai ter um efeito diferente de algum parâmetro metabólico dos seus animais você começa todos juntos e vai fazendo as análises escalonadas ou você começa separado e termina todo mundo junto tem vantagens e desvantagens em cada um deles é uma vantagem de você começar todo mundo junto é que todos começam com a mesma idade mas por outro lado você terminar todo mundo junto todos terminam com a mesma idade se aqui for uma idade muito juvenil Talvez o
início seja muito importante amado por exemplo importante começar na mesma idade agora vocês já forem adultos talvez terminar com a mesma idade faça mais sentido outra coisa é o tempo de processamento das amostras quanto tempo que as amostras vão ficando freezer bom uma vai estar mais fresca que a outra se você fizer dessa forma e aqui vai estar todo mundo junto você provavelmente vai processar as amostras todas juntas e vai ter todo mundo o mesmo tempo de freezer Mas cada experimento vai ter a sua particularidade só é uma coisa que é importante você pensar antes
de fazer o seu experimento um ponto que eu queria destacar aqui frequentemente a alta variabilidade dentro de um grupo é culpada da gente não encontrar diferenças entre grupos porque se as barras de erros estão muito grandes a estatística Não vai dizer que dois grupos são diferentes e o que que as pessoas tendem a fazer remover outros layers fazer o máximo possível para redução da variabilidade e o que que eu sugiro para vocês aumentem a variabilidade parece contra intuitivo de certa forma é mas vamos pensar que o aumento da variabilidade de forma controlada e homogênea entre
os grupos poderia potencialmente levar resultados mais robustos mais reprodutíveis e mais generalizáveis lembre a gente quer transpor os resultados que a gente obtém frequentemente para a espécie humana Então faz sentido a gente ter resultados que sejam mais variáveis porque na situação humana a gente tem uma série de fatores que são incontroláveis e uma das coisas que é possível fazer que é muito básico e simples é a utilização dos dois sexos utilize machos e fêmeas essa é uma Esse é um aumento de variabilidade importante é que leva uma amostra mais representativa e isso pode ser útil
na sua pesquisa para ter resultados mas confiáveis e falando sobre sexo tem um Outro fator que pode levar a diferenças nos resultados e é que claramente é um pouco polêmico mas tem dois artigos importantes publicados mostrando que o sexo do experimentador influenciava as medições dos experimentos em um experimento quando o experimento era feito por pesquisadores homens os animais tinham aumento do estresse e Esse aumento do stress levava a analgesia e atrapalhava todo o experimento que era feito com dor porque se os animais já estavam tendo analgesia induzida por estresse não tinha como ver os efeitos
de analgésicos porque eles já estavam com analgesia nesse experimento aqui o fármaco cetamina o ketamina anestésico mas também uma droga de abuso também um Psicodélico não clássico e também um antidepressivo o efeito antidepressivo dele não acontecia quando Quem fazia o experimento era mulher então para um parâmetro não dava certo quando era homem para outro parâmetro o experimento não dava certo quando Quem fazia o experimento era mulher e aí a gente pode se perguntar né se o sexo do experimentador influencia tanto assim será que um modelo que a gente está usando ele é robusto suficiente para
reproduzir a situação humana talvez talvez não seja Então essa é uma coisa importante a ser considerada não levem isso tão a sério porque tem apenas dois papers publicados com relação a esse assunto e também tem um fator que a gente não escapa que é um pouco de sorte a descoberta da penicilina é uma delas mas também é associação entre a h pylori e a úlcera envolve o fator de sorte é envolve um fator de sorte e rigidez estatística porque o experimento em que seria utilizado para comprovar que a úlcera tinha relação com infecção por H
pylori proliferação de H pylori envolveu o cultivo de células de conteúdos do local de pessoas com úlcera nos primeiros 30 pacientes não tinha nenhum efeito não tinha crescimento de H pylori a incubação Durava dois dias por um erro incubação dos próximos começou a ser de cinco dias de um grupo de pessoas da próxima leva foi de cinco dias e aí as H pyloris apareceram em todos os outros pacientes talvez fosse fizesse muito sentido cancelar o experimento mas havia um planejamento estatístico de fazer mensuração em sem pacientes e sem pacientes tiveram a sua mensuração teve a
parte que envolveu um erro mas esse erro acabou envolvendo também um pouco de sorte é uma sorte é algo inerente a pesquisa científica E com isso a gente termina a parte de delineamento experimental e vamos falar sobre cálculo de amostra na sequência
