fala pessoal tudo bem com vocês aqui é o professor Wesley Essa é a terceira aula do curso de técnicas e processos biotecnológicos e nessa videoaula discutiremos as técnicas de Engenharia Genética parte um bem nas aulas anteriores nós comentamos acerca da escolha do microrganismo visando aí a produção de um bioproduto em escala industrial e etc e ao término da aula dois eh eu havia começado a discutir com vocês as questões envolvendo Engenharia Genética e nós havíamos comentado inclusive desses dois princípios né de técnicas noing e knockout aqui não se recorde quando a gente fala de uma
técnica nokin é basicamente você visando ah inserir um determinado gene de maneira a qual você tem aqui a obtenção de uma determinada característica por sua vez a técnica de noc ela basicamente faz a remoção completa de um gene de maneira a qual esse organismo agora que você criou esse organismo ogm Ele vai ter a perda de uma característica existente não necessariamente trata-se de um organismo transgênico né Porque lembre-se que o organismo transgênico é aquele que recebe um gene de uma outra espécie nesse caso você só pode criar um ogm propriamente dito beleza mas a ideia
é que quando você fala de nokin e noout é isso um vai inserir um gene outro vai remover um gene e de maneira muito simplificada a gente precisa entender que quando se fala de Engenharia Genética tudo isso vai ser pautado justamente num Dogma central da biologia né no qual você tem um DNA o DNA ele tem a capacidade de sofrer replicação isto é ele se duplica esse DNA por sua vez através da transcrição ele forma uma molécula de RNA esse RNA ele também pode se replicar e por sua vez o RNA ele sofre a tradução
formando as proteínas acrescido a isso nós também sabemos que é possível a partir da molécula de RNA formar-se molécula de DNA através da transcrição reversa portanto as técnicas de Engenharia Genética elas vão visar fazer Justamente esse processo de replicação transcrição tradução de maneira a qual você vai utilizar-se de uma estrutura denominada como vetor de expressão e esse vetor de expressão Como eu havia comentado com vocês anteriormente pode ser tanto um plasmídeo bacteriano quanto um vírus que ele é construído para fazer com que a gente tenha a expressão de um determinado gene dentro de uma célula
de interesse de maneira Qual é importante vocês entenderem que a ideia de um vetor de expressão é justamente uma estrutura que ele é utilizado para fazer a integração de um gene específico em uma célula alvo de maneira a qual diante a a integração desse Gene específico nós teremos e instruções para que haja aí por exemplo a expressão gênica dentro dessa célula de maneira a qual você vai ter aí a proteína codificada pelo Gene beleza e aí você D tá se perguntando prô Mas por que que você tá enfatizando tanto isso né porque nós veremos gurizada
que justamente os vetores de expressão são ferramentas básicas de qualquer biotecnólogo de qualquer pessoa que trabalha com biotecnologia quando se trabalha por exemplo com proteínas sintéticas então o cene da coisa é vocês entenderem que o construto de um plasmídio eh de um bacteriófago por exemplo é muito importante para que a gente consiga fazer esse direcionamento do gene de interesse para que aí haja a expressão gênica de acordo com aquilo que foi desenhado aí visando a a produção do bioproduto importante ainda nós entendermos o conceito formal do que que é eh a utilização dessas desses vetores
de de expressão tanto plasmídeo quanto bacteriófago a ideia por exemplo é que nós tenhamos aqui ó um plasmídeo bacteriano ou seja um pedaço de DNA circular a gente vai ali recorta uma parte específica integra por exemplo o fragmento de DNA que tem o gene de interesse un esses fragmentos e você vai ter o vetor recombinante esse vetor recombinante ele precisa agora ser inserido dentro por exemplo de uma célula Hospedeira que pode ser por exemplo um uma bactéria E aí ele começa por exemplo fazer a multiplicação celular e expressar o gene de interesse A ideia é
que a gente faz técnicas em vitros que permitem tanto o isolamento quanto a manipulação quanto a alteração e a expressão de DNA a sacada gurizada vocês entenderem que tudo isso parte desse princípio de você utilizar-se de um vetor de expressão para que a célula Hospedeira faça a produção do gene de interesse beleza E isso se dá basicamente a priori a princípio lá nas técnicas moleculares que datam da década de 70 então o PCR sequenciamento de DNA o conhecimento sobre as endonucleases e a partir da década de 90 nós temos agora técnicas altamente eficazes para fazer
a quantificação de DNA proteínas e RNA então vocês verão por exemplo que há uma evolução natural da engenharia genética de maneira Qual a priori a gente consegue amplificar o material genético Mas a partir da década de 90 e digo mais especialmente agora no século XXI o que nós temos são as técnicas ômicas eh as ômicas que permitem por exemplo A proteômica para fazer eh processos com proteínas a metabolômica que pensa nos metabólitos glic lipidica E genômica transcriptômica epigenômica então tem aí um uma série de várias ferramentas ômicas que permitem com que a gente desenhe aqui
ferramentas genéticas de maneira cada vez mais efetiva e otimizando ainda mais a questão de custos então essencialmente O que que a gente vai falar nessa videoaula nós falaremos aqui das técnicas de isolamento de DNA de escolha do vetor as técnicas de clivagem por enzimas de restrição e ligação e falaremos também sobre a transformação ou transfecção Beleza então vamos lá quando se fala por exemplo em técnicas de isolamento do DNA o que que é importante vocês entenderem que isso Visa basicamente obtenção de DNA genômico ou por exemplo a gente pode fazer aqui a síntese de DNA
complementar a partir de RNA mensageiro O que significa dizer RNA complementar A ideia é que você forma DNA a partir de RNA Então você usa por exemplo uma transcriptase reversa e a partir de uma molécula de RNA você consegue produzir DNA complementar e isso vai ser muito importante por exemplo para que você consiga amplificar o material genético de um vírus de interesse então por exemplo Ah o sars cov 2 que era o vírus que causava covid-19 é um vírus de RNA mensageiro é um vírus de RNA perdão e aí você pode pegar esse RNA viral
transformá-lo em um DNA viral e a partir disso você faz a amplificação desse material genético para fazer aí a detecção se há ou não eh amostra do vírus no organismo você ainda pode fazer amplificação de um gene mediante a técnica de PCR né que é reação em cadeia da polimerase e por fim você pode fazer ainda DNA sintético isso daqui é muito importante inclusive quando se fala de biologia sintética Beleza então as premissas do processo de isolamento de DNA são essas acrescido a isso é importante nós entendemos aqui a escolha do vetor e a escolha
do vetor é importante no âmbito de quê trata-se de uma molécula de DNA que vai levar o DNA alvo até a cel Hospedeira e e a partir desse carreamento até a célula Hospedeira Você tem o processo de replicação E aí você tem a produção do Gene que você Visa e expressar E aí nós podemos ter aqui os plasmídeos que podem ser plasmídeos replicativos ou integrativos nós também podemos ter aqui os cromossomos artificiais bac pac por aí vai e os bacteriófagos lâmbda bacil vírus a gente pode falar do aden vírus Beleza então vamos lá que que
é o plasmídio propriamente dito o plasmídio essencialmente são moléculas de DNA extrac sircular Beleza então ele é extracromossomal e eles são capazes de se reproduzir independentemente do DNA cromossômico ou seja o plasmídio é uma estrutura de DNA circular presente em bactérias gurizada que carrega consigo informações genéticas e até mesmo alguns genes que são muito importantes por exemplo dentro da realidade eh imunológica de uma bactéria para resistência a antibióticos então ele carrega alguns genes por exemplo que são extremamente importantes na resistência bacteriana a antibióticos E aí os vetores o que que é importante vocês entenderem os
vetores eles são constituídos aqui por algumas regiões tá então tem tem regiões aqui promotoras tem aí ó operon likee tem Hi genes Associados por exemplo resistência ampicilina tem as origens de replicação e essa é a estrutura básica de um plasmídeo Nós também temos aqui alguns plasmídeos Como por exemplo o Ique o bac e essa estrutura por exemplo de um fago falando Mais especificamente sobre os plasmídeos não sei se é de conhecimento de vocês mas a gente tem aqui por exemplo um mapa de um plasmídio E aí no mapa de uma de um plasmídio Quais são
os elementos que são importantes a gente entender ó a gente tem um marcador de seletividade a gente consegue eh indicar região promotora a gente pode marcar e delimitar os sítios de restrição onde que você vai inserir o gene aonde que inicia essa replicação E aí a a título de curiosidade nós temos aí qu saber da nomenclatura de um plasmídeo Então eu peguei esse plasmídio o p c19 ó P de plasmídio o c da Universidade de Califórnia e aqui tem o número Beleza então sempre que você tem um plasmídio ele é nomeado dessa maneira e aqui
como que é um fago um fago basicamente é uma partícula viral que infecta as células bacterianas e essencialmente ele se Ancora aqui na célula bacteriana e despeja aqui o material genético para dentro da bactéria de maneira a qual a bactéria começa agora a replicar essas moléculas de DNA do fago beleza acrescido a isso uma terceira questão a ser elencada aqui na nossa aula gurizada são justamente as enzimas de restrição e ligação entendam que enzimas de restrição ou também chamado de endonucleases são basicamente eh enzimas que vão fazer e a função de clivagem elas vão cortar
pontos específicos da molécula de DNA de maneira a qual você consegue reconhecer por exemplo dentro ali da estrutura do plasmídeo regiões aonde você tem aqueles sítios de restrição você vai lá corta essas regiões e consegue inserir por exemplo o seu gene de interesse posto isto que que é importante de vocês entenderem quando se fala das enzimas de restrição ou as endonucleases são basicamente enzimas que nós encontramos aqui em bactérias e também em outros procariotos tá então em algumas arqueias por exemplo E aí essas enzimas de restrição elas conseguem se reconhecer e se ligar a sequências
muito específicas que a gente chama de sítios de restrição E aí ela Prom um corte na dupla hélice da molécula de DNA então nós temos alguns exemplos aqui a eco R que foi aqui a partir de colle a Ban hii a rid 3 e por aí vai e por sua vez a DNA ligase ela vai promover a união dos fragmentos de DNA e para formar uma fita sem que haja por exemplo eh lacunas espaços tá E aí o que que é importante vocês entenderem quando a gente fala da da DNA ligase A A ideia é
que ela faz uma ligação de regiões complementares Ou seja você tem lá a o gene que você acabou de inserir E você tem a sequência de DNA por exemplo do plasmídeo o gene que você inseriu mais a sequência de DNA elas tê que ser complementares em si de maneira qual ela promove a catálise da da ligação fosfodiester da ligação cinco linha de uma fita de DNA ligando-se ao grupamento hidroxila da Porção Terminal da extremidade três linha beleza e aí você tem a produção de um esqueleto intacto de Açúcar fosfato então essencialmente a lig a DNA
ligas ela promove uma ligação fosfodiester entre essas regiões de maneira complementar Então vamos lá ó como que se dá a clivagem pelas enzimas de restrição Então você tem aqui a có ri ela promove a clivagem em um ponto específico Beleza então um ponto importante a ser trazido é que essas extremidades Elas têm que ser coesivas beleza e aqui você ainda pode ter um corte em extremidades que a gente chama de extremidades cegas de maneira qual uma vez que você faz a clivagem desses pontos específicos você consegue por exemplo utilizar-se aqui do DNA exógeno Ou seja
aquele DNA que você vai inserir você liga aqui nessas extremidades E aí utilizando se da DNA gaze você tem aí o construto do seu eh vetor recombinante beleza acrescido a isso então vamos lá ó você tem aqui e uma fita de DNA dup aí você tem aqui o sítio de restrição então a endonuclease reconhece essa porção e corta esse sítio produzindo aqui extremidad com DNA fita Simples então você vai ter isso aqui ó Chap encontrou-se vai lá cliva de maneira qual você vai ter ISO aqui beleza uma vez que você formou agora essas porções recortadas
Você pode ter agora a exerção do Gene Alvo Mais o mío beleza e é importante ainda ser acrescido aqui a vocês que essas extremidades elas precisam ser complementares tá e elas sendo complementares elas conseguem se unir entretanto percebam que ainda tem aqui umas lacunas né E aí vem a DNA ligase e sela essas lacunas Beleza então A ideia é justamente isso você pensar que a priori você tem ação das enzimas de restrição as nucleases e posterior você tem aí ação da DNA ligase Beleza então vamos lá Quais são as etapas que a gente tem que
ter em mente na hora que a gente pensa em construir um plasmídeo recombinante primeiro você tem que fazer o isolamento do Gene Alva da sua célula Beleza então você pega o gene Alva por exemplo o gene da insulina e você vai lá e isola ele posterior a isso você tem que pegar um DNA de DNA circular o plasmídeo Beleza e você faz a remoção dele da célula bacteriana você faz isso E aí você tem agora dois dnas dois fragmentos de DNA e você faz a clivagem utilizando o qu a mesma enzima de restrição beleza cliv
aí você vem os fragmentos aí eles T que ter Obrigatoriamente pessoal eles tem que ser complementares entre si Então você tem que ter sessões de DNA fita simples com bases nucleotídicas expostas no final de uma molécula de dupla fita beleza e aí você vai mais adiante agora E você faz o quê o plasmídeo bacteriano ele é cortado em dois pontos usando as mesmas enzimas de restrição beleza a medida em que essas extremidades complementares e tanto do Gene quanto do plasmídeo se unem elas podem se unir aqui por pareamento mas recordem que eu falei anteriormente que
embora você tenha esse pareamento e ainda tem lá uma lacunas né E aí o que que a gente faz esses dnas eles são unidos pela DNA ligase E aí você tem agora um plasmídio linear ele vai ser circular beleza e aí esse plasmídio uma vez que ele já tem agora o gene de interesse inserido ele é agora novamente inserido Numa célula bacteriana aonde você vai ter a produção aí das mais diversas cópias do Gene que você tem interesse beleza [Música] e uma outra técnica muito importante aqui de Engenharia Genética gurizada é a transformação ou a
transfecção que essencialmente nada mais é do que a introdução de um material genético exógeno Ou seja é um DNA que não é da célula para que você tenha aí expressão gênica silenciamento gênico ou até mesmo algumas Outras aplicações que a gente pode ver mais adiante o fato é que quando a gente fala de transfecção a gente tem a utilização de métodos químicos e biológicos acrescido a reagentes que permitem com que haja transferência do material genético então alguns exemplos que a gente poderia falar aqui ó choque térmico eletroporação biobalística infecção viral aqui tem um um foi
minha secretária que escreveu errado tá peço desculpas agrob bactéria quando a gente fala de espécies vegetais E aí a gente vem dar uma pequena pincelada aqui para vocês entenderem Então vamos lá que que seria transfecção química é basicamente você inserir esse DNA exógeno utilizando-se aqui do cloreto de cálcio Então você faz uma um precipitado com cloreto de cálcio e você faz a incorporação por endocitose a taxa de eficiência gera de torno de 2% Então você tem aqui ó um tampão fosfato cloreto de cálcio e o DNA ser transferido tá tem a precipitação aqui do DNA
e você faz aqui essa adição do precipitado nas células em cultora algumas células vão absorver outras não então aqui é uma taxa baixa mas é uma é é uma metodologia que é também passível de ser utilizada nós temos aí a transfecção mediante a utilização de lipossomo Então você vai ter aqui um lipossomo com caráter catiônico beleza ou seja ele tem que estar carregado positivamente que ele é utilizado para fazer o encapsulamento do DNA esse lipossomo por sua vez gurizada o que que é importante ele vai ser carregado e ele se liga a membrana plasmática aonde
você tem aí a transferência de DNA Então vamos lá ó você tem aqui a síntese do lipossomo com caráter catiônico você insere o DNA ser transferido esse lipossoma ele se funde a membrana celular e você tem aí a integração absorvição do DNA pelas células a gente ainda pode ter aqui uma transfecção com peptídeos tá então você tem alguma sequência de peptídeos que podem se ligar por exemplo ao ao DNA e ele promove essa transfecção por endocitose beleza acrescido a isso uma outra metodologia que a gente pode utilizar é a transfecção física que pode ser por
eletroporação basicamente você faz uma desestabilização da membrana eh mediante a exposição a um campo elétrico Então você forma basicamente poros E aí você tem a a transfecção do material genético Você pode ter por choque térmico ah aí ideia por exemplo é que você aumente a temperatura e isso Altera a fluidez da membrana de maneira a qual você tem a formação de poros E aí você faz uma meio que uma facilitação pra entrada do DNA e também a gente pode utilizar aqui biobalística que é basicamente você fazer eh o se bombardeia literalmente a sua célula alvo
com microprojetos aí que tem o DNA ser transferido Beleza e você ainda pode ter a transdução que é basicamente uma situação na qual eh você faz a transferência do DNA isógeno para umaa outra célula mediante a utilização de um vírus que é um vírus recombinante e aí tem alguns aspectos que merecem ser pontuados e observados com muito carinho primeiro Quais são os fatores que a gente tem que levar em conta o tipo de célula que você vai fazer aí a a transdução Além disso se a expressão desse ele é transiente ou estável Isto é se
vai ser pontualmente ou vai ser continuamente a eficiência da transdução e a facilidade de infectar ou a dificuldade de infectar essa célula alvo Ou seja a gente tem que pensar em um conceito da virologia que é chamado de permissividade ou seja essa célula é suscetível e ao mesmo tempo permissiva a infecção beleza E aí quais são os tipos de vírus que a gente pode utilizarse adenovírus adenovírus Associados retrovírus lentivírus E por aí vai ainda é importante ser trazido que nesse processo de transformação ou transfecção eh A ideia é que você vai fazer justamente essa transferência
de um plasmídeo aí de uma célula bacteriana onde você vai ter a cópia aí desse Gene a ser produzido beleza e aí um ponto a ser trazido ainda é que a gente tem as técnicas clássicas de clonagem que podem ser replicativas integrativas ou centromérica quando a gente fala de uma técnica de clonagem replicativa A ideia é você joga o GLI eem muitas cópias independentemente da replicação do DNA cromossômico vai ser produzido tá é uma técnica que é mais instável ou seja tem aí a pressão de seleção e o gene não se integra ao DNA cromossômico
beleza nós temos aqui a técnica integrativa ponto importante ser trazido você tem aqui a construção de um plasmídio esse plasmídio ele vai utilizar-se aqui de ferramentas baseadas em trocas alélicas que podem ser trocas de cramento simples ou duplo de maneira Qual você tem aqui a a inserção do Gen no DNA cromossômico ou seja Diferentemente da técnica replicativa na técnica integrativa você tem integração do DNA exógeno ao DNA cromossômico e por fim nós temos aqui a técnica centromérica que é utilizada em leveduras tá na qual o vetor não se integra ao Genoma mas ele possui sequências
que permite uma replicação sincronizada ao DNA cromossomal ou seja na hora que a célula eh fungica a leved vai se replicar ela permite por exemplo que você tenha a a replicação também acontecendo simultaneamente beleza e é isso pessoal se você tiver gostado dessa primeira vídeoaula sobre técnicas de Engenharia Genética deixa o seu like curta compartilhe se inscreva deixe emites e é isso muito obrigado um super abraço e até a próxima fui
