o Olá eu sou país aluno sou pesquisadora da Embrapa agroenergia e atua na área de processos fermentativos e enzimáticos nessa vídeo aula eu vou falar um pouco para vocês sobre produção de enzimas microbianas Essa vídeo-aula ela dá continuidade a uma vídeo aula de produção de enzimas microbianas ministrada pela pesquisadora Mônica Damaso onde ela focou nos tipos de fermentação e na produção de enzimas em escala de bancada e escala piloto aqui nós vamos falar sobre a utilização de processos e etapas de dar um frio e é sobre a utilização de processos de produção de enzimas microbianas
né com intuito de maximizar a produção das enzimas a gente vai falar um pouco sobre os meios de Cultura para produção de enzimas né os componentes do meio de cultura sobre as condições de cultivo e sobre metodologias utilizadas para utilização do processo e sobre dar uns trem da produção de enzimas microbianas nós vamos falar sobre as etapas posteriores a fermentação Ou seja a separação e concentração dos enzimas a purificação EA formulação é E aí e os meios de Cultura eles precisam apresentar algumas características para produção de enzimas por exemplo ter composição adequada para o crescimento
do microrganismo e produção da enzima isso porque nem sempre a composição mais adequada para o crescimento do microrganismo é também para a produção da enzima então às vezes o microrganismo cresce muito bem e não produzem enzimas Então o que a gente faz ele geralmente é quando produzimos enzimas utilizamos indutores da produção de enzimas Por exemplo quando utilizamos lipases usamos é olhos como indutores quando produzimos celulares utilizamos materiais lignocelulósicos como todos e E além disso os meios de Cultura eles precisam ter baixo custo de obtenção transporte e estocagem ter uma elevada disponibilidade e não dificultar os
processos de separação do produto isso porque os processos de purificação são processos Claros Então se temos um meio de cultura que dificulta o processo de separação Possivelmente a gente pode inviabilizar a produção das enzimas e e os meios de Cultura eles podem ser composição quimicamente definida ou podem ser complexos os meios de Cultura de composição quimicamente definida tem os componentes qualitativa e quantitativamente definidos ou seja os componentes do Meio eles são mais puros e você sabe exatamente quanto você colocou de cada componente nesse meio já nos meios de Cultura complexos as matérias-primas são agroindustriais né
Por exemplo melaço sucos de frutas materiais amiláceos e resíduos como por exemplo é bagaço de cana-de-açúcar palha de arroz farelo de trigo Então se por um lado esses meios de Cultura complexos eles são mais baratos por outro eles são mais difíceis de serem padronizados né porque a gente sabe que essas matérias-primas água industriais e resíduos nem sempre têm a mesma com bom né a composição deles Varia muito com diversas questões né em relação à época do ano por exemplo é época de chuva solo enfim o e sobre os componentes do meio de Cultura em algumas
alguns componentes que os meios de Cultura precisam ter para o crescimento dos microrganismos e produção das enzimas por exemplo a fonte de carbono que pode ser por exemplo açúcares como a glicose e sacarose melaço é o amido ou materiais lignocelulósicos né mas é importante a escolha dessa fonte de carbono porque o a síntese de enzimas ela está sujeita a repressão cada cólica muitas vezes então a glicose por exemplo que é um açúcar que é excelente para o crescimento de microrganismo ela é repressora para síntese de algumas enzimas e é bom além da ação de carbono
é o meio precisa ter uma fonte de hidrogênio que pode ser orgânica ou inorgânica né como orgânica a gente tem como exemplos sulfato de amônio nitrato de sódio e podes orgânicas alguns exemplos são ureia e extrato de levedura triptona ele cor da maceração do Milho que é um resido e os microrganismos precisam ainda de sais minerais como o cloreto de sódio e Sulfato de Magnésio por exemplo alguns sais em quantidades Muito pequenas como por exemplo Sais de Ferro cobre e manganês e precisam também de vitaminas como por exemplo riboflavinas biotina e piridoxina e e além
dos componentes do meio de cultivo para utilização né de processo a gente tem que levar em conta também as condições de cultivo é que são ligadas aos equipamentos né então por exemplo a gente pode cultivar um micro-organismo para produção de enzimas tanto em escala de bancada na em frascos pequenos como faz cuscuz como que por exemplo e Jacques né que são agitadores orbitais Obá duras né E estufas também né no caso de fermentação em estado sólido E além disso a gente pode produzir enzimas Já enviou reatores né fermentadores e escala de bancada ou já em
uma escala maior Então as variáveis que que se deve estudar né para otimização da produção de enzimas seriam temperatura PH são variáveis bastante importantes né na otimização e cada microrganismo tem uma temperatura e um PH onde a produção da enzima vai ser maximizada outra variável importante é agitação então a gente consegue controlar a agitação tanto no shake né e seria uma agitação orbital quanto nos fermentadores né agitação pelos imperadores né pelas hélices além da agitação implementadores a gente consegue ainda estudar a variável aeração e a gente consegue boa o oxigênio ou ar no meio de
curtir né E além disso a gente ainda pode estudar no caso de fermentação em estado sólido a umidade né Cada microrganismo vai ter uma umidade adequada para a produção da enzima ou falando então das metodologias é para utilização de processos para produção de enzimas Você já foi maximizar a produção de enzimas a gente pode tanto trabalhar com experimentos simples quanto experimentos fatoriais nos experimentos simples os tratamentos são compostos por um só fator é um por exemplo se a gente escolhe estudar a temperatura como variável a gente só modifica a temperatura um fator de cada vez
depois que a gente escolhe a melhor temperatura a gente escolhe um próximo na próxima variável para ser estudada Os experimentos fatoriais os tratamentos são compostos por uma combinação de fatores dois ou mais fatores então a gente pode modificar variar dois fatores ao mesmo tempo então os fatores são as variáveis né é temperatura por exemplo PH concentração de um componente no meio de cultivo agitação aeração e os níveis são os valores dessas variáveis que a gente vai testar então temperatura a gente pode estudar em três níveis 25 30 e 35 graus por exemplo é bom nos
experimentos fatoriais então a gente já era uma matriz de experimentos onde a gente essa Matriz vai usar a combinação desses fatores né nos seus níveis que a gente vai testar depois a gente então faz Os experimentos faz uma análise estatística e obtém uma equação onde a gente vai poder estudar então os fatores a gente vai ter um efeito principal que o efeito de cada fator independente do efeito de outros fatores e o efeito da interação que o efeito simultâneo dos fatores sobre a variável observada pode acontecer de um fator interferir no efeito de Outro fator
e nesse caso dizemos que a interação bom então para ir buscar aqui quando a gente utiliza metodologia de um fator por vez aqui no exemplo a gente está estudando as variáveis PH temperatura e concentração de um componente no meio de cultivo então a gente fixa valores de PH e temperatura e modifica concentração faz vários experimentos com diferentes concentrações desse componente e verifique em qual concentração o maior produção da enzima bom então a gente utiliza essa concentração né onde houve a maior produção da enzima fixa essa concentração e vai estudar então a temperatura aí testa várias
temperaturas com ph e concentração fixados que aí vai descobrir em qual temperatura é a maior produção da enzima descoberta maior temperatura de fixa esse valor e estudo então PH de vários PH sou de descobrir qual que eu pegar que produz a maior quantidade de 15 a tá bom qual é a desvantagem dessa metodologia é que a gente só testa um fator por vez Então a gente não tá interação entre os fatores a gente testa por exemplo é diferentes concentrações mas no mesmo PH em uma mesma temperatura a gente não sabe qual seria o comportamento dessas
diferentes concentrações em outros pegasse e outras temperaturas né uma saída né para resolver esse problema seria fazer uma matriz né uma combinação de todos os fatores assim todos os fatores a gente resolver esse problema entretanto Isso resultaria numa quantidade tão grande de experimentos que provavelmente inviabilizaria a nossa a nossa pesquisa então a gente não consegue fazer essa combinação de todos os fatores a gente trabalha então com experimentos fatoriais aqui no exemplo é um delineamento composto Central rotacional que é um tipo de experimento fatorial Oi gente então testa uma combinação dos fatores em alguns níveis de
forma que a gente consegue fazer menos experimentos do que se fizesse uma combinação de todos os fatores mais a gente consegue cobrir toda essa região aqui então a partir do um delineamento composto central rotacional por exemplo a gente depois é capaz de construir gráficos com essa com esse formato aqui são gráficos de superfície de resposta né onde a gente tem a áreas regiões de menor produção de enzima até a regiões de maior produção de enzimas Então a gente vai a trabalhar com essas áreas da gente tem que taxas dessas dessas variáveis onde há a produção
de enzima é maior é bom as principais vantagens então Os experimentos fatoriais em relação aos experimentos simples são é que podes estudar dois ou mais fatores no único experimento e que pode ser por meio dos fatores dos desculpe dos efeitos das interações verificar se um fator é independente ou dependente de outros e as principais desvantagens são que o número de tratamentos ou combinações de níveis de fatores cresce rapidamente com o aumento do número de níveis em cada fator ou mesmo com o aumento do número de fatores ou seja se você quer estudar vários níveis e
vários fatores Pode ser que os seus experimentos sejam inviabilizados né pelo número de tratamentos que você vai ter que fazer ó E além disso a interpretação dos resultados se torna mais difícil à medida que aumentamos o número de níveis e de fatores no experimento tá bom passando então para as etapas de dar um estranho a gente tem a fermentação então tudo que a gente faz antes da fermentação a gente chama de upstream e o que a gente faz após a fermentação a gente chama de dar um dos três então a bwin seria a seleção de
microrganismos preparação de meio preparação de inóculo e depois da fermentação o dar uns prints seria a Lise celular no caso de enzimas intracelulares etapas de separação de purificação e formulação da enzima Então as etapas de dar uns primos elas dependem do processo fermentativo e não é do tipo de enzima por exemplo se enzima entre o celular o essa celular se ela extra-celular basta separar as células do sobrenadante para obter a enzima né porque ela é secretada da tela né pro meio por meio de cultivo então ela vai estar na parte do sobrenadante se você tem
uma enzima intracelular que você vai precisar fazer A Lise celular ou seja ruptura dessas células para liberar as enzimas né então é E além disso as etapas de downstream também dependendo do tipo de fermentação por exemplo se você faz uma fermentação submersa Você vai precisar de uma etapa mais que seria a etapa de extração da enzima desse sólido fermentado Então esse só as enzimas são aderidas na superfície do sólido que você precisa fazer uma extração sólido-líquido para retirar essas meninas é bom as etapas de dar um fim dependem também da finalidade a que se destina
o produto Porque se o seu produto seus foi em cima vai ser destinada a um produto da Indústria Farmacêutica por exemplo a gente vai precisar de enzimas com alto grau de Pureza E aí provavelmente vamos precisar de mais etapas de purificação e uma Purificação é mais cara se a gente vai utilizar enzimas para a Indústria Têxtil ou para produção de biocombustíveis por exemplo a gente não precisa de uma enzima tão pura e a purificação etapa cara né do processo então a gente pode simplesmente não fazer Purificação nessa fazer a separação ou fazer uma Purificação parcial
é bom aqui para ilustrar ajustem então a fermentação após a fermentação se enzima extra-celular bata fazer a separação da enzima das células e depois a gente faz uma concentração desse sobrenadante onde estão as enzimas e se eu em cima for intracelular a gente faz primeiro A Lise celular para tirar essas enzimas de dentro das células e depois faz a separação dos enzimas desses pedaços de células né que que sobram aí no no processo depois então a gente faz a purificação a gente pode ter várias etapas de purificação pode ser uma pode ser tubos podem ser
várias etapas dependendo do grau de Pureza que a gente precisa da enzima e dependendo do grau de dificuldade de separar essa enzima dos outros contaminantes do meio e depois eu Purificação então a adição de alguns componentes né que é o que a gente chama de formulação para então a gente obter o produto final né a enzima comercial E além disso a gente pode também secar essa essa enzima né geralmente por liofilização passa também pelo processo de formulação e obtêm o produto final a enzima seca para comercialização e o bolo com relação a separação se as
enzimas porém intracelulares então como eu disse a gente precisa romper as é luz para isso a gente pode utilizar métodos mecânicos lhe de química térmica ou enzimática e geralmente da preferência a se dá preferência a enzimas que são Extra celulares né porque a gente não precisa dessa etapa de ruptura das células né uma etapa menos no processo E além disso a purificação é facilitada por quê Porque quando a gente rompe as células além da nossa em cima de interesse outras proteínas são liberadas da célula ácidos nucleicos e uma série de contaminantes né que vão para
o meio de cultivo então a purificação desse material vai ser muito mais complexa e provavelmente mais cara tá bom depois a gente precisa Então é separar as enzimas né tanto dos restos celulares no caso de enzimas entre os celulares que foram rompidas né de descobri células que foram rompidas no caso de enzimas intracelulares quanto precisamos separar o as enzimas das células no caso de enzimas extracelulares para isso a gente utiliza métodos de separação por exemplo filtração centrifugação extração população ou flotação depois disso então a gente tem um extrato com o volume grande e uma quantidade
de proteína relativamente baixo então a gente faz uma concentração desse material para facilitar a purificação os métodos de concentração são são variáveis né são por exemplo EA evaporadores a vácuo precipitação e E aí a mão a próxima está aqui então é a etapa de purificação é ela pode utilizar vários métodos como extração líquido-líquido cristalização e principalmente métodos cromatográficos principalmente a cromatografia líquida como a cromatografia de exclusão por tamanho de troca iônica por interação hidrofóbica ou por afinidade Então essas cromatografia ela se baseam na utilização na utilização do seu extrato líquido né esse extrato líquido ele
é bombeado para dentro de uma coluna cromatográfica essa coluna ela possui uma fase estacionária sólida preenchendo nessa coluna aqui no caso da exemplo é uma cromatografia de exclusão por tamanho Então dentro da coluna nessa coluna recheada de um polímero partículas de um polímero poroso então é as proteínas pequenas ela elas entram nos poros dessas partículas e retardam o seu caminho né descendo a coluna as proteínas maiores elas não conseguem entrar dentro dos poros porque o tamanho da proteína é maior do que do poro então elas passam por entre as partículas passando mais rapidamente e descendo
mais rapidamente dentro da coluna Então a gente tem depois a gente faz é e a gente coleta né Essas essas frações Então a gente vai ter na dentro da coluna A gente já vai ter uma separação primeiro vão sair as proteínas maiores que não entraram nos poros das das do polímero e no final vão sair aquelas pequenas Que se perderam ali pelos poros do polímero Então a gente vai ter uma separação por tamanho e a gente pode separar também por carga por exemplo no caso da cromatografia de troca iônica é que é basicamente a o
mesmo que o mesmo esquema só aqui dentro da coluna A gente tem uma resina que pode ser católica que pode ser iônica e as proteínas a gente sabe que as proteínas na superfície Elas têm cargas né Então dependendo da proteína elas vão ter diferente elas vão ser diferentes cargas e essas cargas elas vão interagir com o material de dentro da coluna Diferentemente então assim interagem mais vão sair a entrar menos vão sair nas primeiras frações cromatografia por interação hidrofóbica é a ideia a mesma mas a interação hidrofóbica Então você tem um material hidrofóbico as proteínas
que interagem mais com esse material elas vão demorar mais a saída coluna as outras proteínas vão sair mas rapidamente e a curvatura pedirá que me dar a gente vai ter alguns ligantes nesse material de dentro da coluna que vão se ligar algumas proteínas e vão retardar também a sua saída na coluna então a gente consegue assim separar as proteínas E aí Tá bom depois da Purificação a gente tem a parte de formulação das enzimas né as enzimas elas podem ser comercializados tanto na sua forma líquida quanto em Pó em pó geralmente elas são utilizadas para
não perder a sua atividade catalítica né E aí a gente também coloca alguns aditivos né que vão estabilizar essa enzima né vou fazer com que ela não perca essa atividade e vão preservar a formulação para que não haja contaminação microbiana não como estabilizantes a gente tem soluções de força iônica determinada de sais neutros como sulfato de amônio e fosfato de potássio por exemplo carboidratos ou proteínas inertes como por exemplo Albumina de soro bovino e os próprios substratos das enzimas e como preservativos a gente pode adicionar cloreto de sódio polióis de baixo peso molecular como por
exemplo glicerol sorbitol oi liton né todos esses componentes eles atuam diminuindo a atividade de água do meio então fazendo com que a água não esteja disponível para o crescimento de contaminantes que podem né contaminar a líquido esse meio além dessas substâncias também usamos como preservativos dessas de ácido benzóico e antibióticos para evitar a o crescimento de bactérias não é isso que eu tinha para mostrar para vocês hoje eu agradeço pela atenção e deixa o meu contato para quaisquer dúvidas obrigada tá
