Avaliação do perfil de suscetibilidade aos antimicrobianos

Olá meu nome é Luísa eu sou biomédica microbiologista mestre em ciências pelo Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo Doutora em biotecnologia aplicada à saúde da Criança e do Adolescente pelas faculdades pequen ppe e atualmente assistente de pesquisa no Instituto de Pesquisa pela pequeno prícipe então dentro do módulo noções básicas de microbiologia eu fui convidada a fazer uma breve apresentação sobre a avaliação do perfil de sensibilidade aos antimicrobianos também conhecido como antibiograma bom então aqui eu vou fazer uma breve introdução sobre o teste de sensibilidade aos antimicrobianos vou falar um

pouquinho da sua apresentação qualitativa e também da técnica quantitativa e vou finalizar minha apresentação falando sobre a interpretação do teste de sensibilidade aos antimicrobianos bom então entre as funções do laboratório de microbiologia né do laboratório clínico de microbiologia sem dúvida destacam-se a recuperação e identificação de possíveis agentes etiológicos né responsáveis aí por processos infecciosos a avaliação do perfil de sensibilidade aos antimicrobianos desses microorganismos que foram recuperados de processos infecciosos a caracterização da epidemiologia local isso significa a compilação de dados ou a geração especialmente né de dados Nem sempre a compilação é realizada pelo laboratório clínico

de microbiologia mas gerar os dados referentes a quais microorganismos são mais frequentes em determinado ambiente de assistência à saúde bem como os perfis de sensibilidade desses microorganismos a detecção de pacientes colonizados por microorganismos multirresistentes E também o monitoramento aí de surtos e de microorganismos emergentes em instituições de saúde bom e aí dentro da rotina do laboratório de microbiologia eh os exames mais realizados pelo setor São obviamente a bacterioscopia né que é um resultado rápido preliminar que também é muito M informativo Especialmente quando de um de um líquido estéril né e a realização da cultura o

teste de sensibilidade aos antimicrobianas então o antibiograma ele se relaciona ao resultado da cultura isso é ele só vai ser realizado para aquela situação em que a gente tem um resultado de Cultura positivo para um microrganismo que foi recuperado de uma amostra biológica que é representativa eh de um processo infeccioso em um paciente e por isso então o resultado do antibiograma ele sai geralmente após o resultado da bacterioscopia e após ou em paralelo a identificação o isolamento e a identificação de um microrganismo um resultado aí de Cultura bom e aí como eu comentei anteriormente então

para realizar o antibiograma a gente tem que ter inicialmente o isolamento e a identificação de um microrganismo a partir de uma amostra biológica que seja representativa de um processo infeccioso no paciente e o teste de uma maneira bem simplificada nada mais é do que a exposição de um inóculo microbiano então eh uma concentração padronizada desse microrganismo frente a uma concentração conhecida que pode ser fixa ou variar de um determinado fármaco que tem ação antimicrobiana isso é realizado dentro de um ambiente controlado então num tempo específico numa temperatura também adequada E aí o que a gente

vai avariar é se esse fármaco ele teve a capacidade de inibir ou então de matar o microrganismo Então a gente vai avaliar se houve inibição do crescimento microbiano nessa met olia em vitro ou não bom e qual que é a importância do antibiograma né a sua importância ela se dá especialmente pelo fato de que ela orienta as estratégias de tratamento ele também serve para triar possíveis mecanismos de resistência especialmente mecanismos de resistência adquiridos da célula bacteriana Então a partir do fenótipo resistente é que a gente geralmente vai investigar os mecanismos de resistência E aí nesse

contexto ele também acaba tendo um propósito de controle de infecção eh hospitalar e também de saúde pública possibilita a caracterização da epidemiologia local que por sua vez também acaba tendo um papel aí no direcionamento das terapias empíricas bom é muito importante eh citar que a realização e a Interpretação do teste de sensibilidade aos antimic pradas eh é validada por grupos de especialista que por sua vez for formam né comitês que produzem documentos específicos que vão ser utilizados pelo setor de microbiologia então pelo microbiologista para realização desse teste e também especialmente para interpretação dos resultados dos

Testes que são feitos aí dentro do laboratório esses comitês eles se baseiam em informações que são relacionadas tanto ao microrganismo quanto aos fármacos dos antimicrobianos e também em evidências da literatura né então em evidências aí que são trazidas por ensaios em vitro e também ensaios emro eh Então são considerados aí para padronização do teste e a Interpretação desde informações como estrutura celular do microrganismo ou do grupo bacteriano as suas resistências intrínsecas os mecanismos de resistência mais comuns adquiridos como também características dos fármacos como as apresentações de cada um deles características de fármacos sinética e fármaco

dinâmica deles e também aí as variáveis técnicas e os estudos clínicos daqueles fármacos para grupos populacionais com infecções de determinados então toda essa informação justifica o porquê o número de antimicrobiano por exemplo testado pelo teste de sensibilidade eh aos antimicrobianos ele pode variar de acordo com o microrganismo não só pode como ele varia eh em relação ao tipo de microrganismo que foi isolado e também de qual tipo de amostra biológica ele foi isolado Então porque isso se refere ao ao sítio de infecção que o paciente tem né e por isso eh também ualmente o Clínico

sente falta de alguma droga no antibiograma então para alguns microorganismos não existe eh a padronização especialmente da interpretação do teste de sensibilidade aos antimicrobianos para alguns fármacos então eu vou aproveitar aqui a minha fala para para expressar a importância da comunicação entre o clínico e o microbiologista para entender o por eventualmente algum fármaco não está dentro do resultado do antibiograma ou então o por não foi feita a realização do antibiograma para algum microrganismo que foi isolado eh na rotina Laboratorial Opa desculp eu vou aproveitar esse slide também para trazer aqui os principais grupos de especialistas

né comitês vinculados à padronização do antibiograma Então a gente tem aqui o grupo americano que é muito conhecido pela sua sigla clsi o grupo Europeu também muito conhecido pela sua sigla eucast E aproveito para dizer né para esclarecer para alguns que no Brasil desde 2018 o que tá em vigor na verdade é esse outro comitê que é o BR Cash que na verdade utili os documentos do grupo de especialista europeu eh harmonizando os dados e os documentos para nossa realidade Nacional então ele é conduzido por um grupo de especialista grupo de especialistas brasileiros mas ele

se baseia em toda a documentação europeia tentando harmonizar PR nossa realidade Nacional bom aqui falando então um pouquinho sobre as diferenças técnicas né e trazendo exemplos de técnicas aqui de antibiograma qualitativo e antibiograma quantitativo bom o antibiograma qualitativo também é conhecido como disco de fusão ou então a técnica de kirb Bauer Sem dúvida alguma é a abordagem mais antiga paraa realização do teste de sensibilidade aos antimicrobianos e ele permanece como eh uma das técnicas mais utilizadas dentro dos laboratórios clínicos e Vale reforçar que ele é bastante adequado paraa maioria dos patógenos bacterianos aqueles mais frequentemente

isolados incluindo algumas bactérias fastidiosas existe padronização por essa técnica qualitativa é bastante versátil eh em relação ao número de bactérias paraas quais eles ele pode ser realizado e também paraa grande maioria dos agentes antimicrobianos em que ele pode ser utilizado eh ele é amplamente difundido porque Tecnicamente é relativamente simples e ele não requer nenhum equipamento eh especial paraa sua realização basicamente você precisa de insumos muito comuns ao laboratório de microbiologista e profissionais bem treinados para sua Red Bom basicamente Então o que o microbiologista faz nessa técnica é o preparo de uma suspensão bacteriol né Então

a partir daquele microrganismo em cultura pura que foi isolada de uma amostra biológica representativa de um processo infeccioso ele faz uma suspensão bacteriana transfere essa essa suspensão bacteriana pra superfície de um ágar específico como se fosse um tapete na superfície desse áre e em seguida ele começa a fazer a aplicação dos discos de papel impregnados com cada um dos fármacos que ele pretende testar frente à bactéria que foi isolada depois de um período de incubação específica e uma temperatura específica eh a droga durante esse período de cada um dos papéis que foram colocados dos discos

de papéis que foram colocados na superfície do ágar vai se difundir no meio de cultura e paralelamente a essa difusão eh ele vai acabar atuando ou não sobre o microrganismo que foi aplicado na superfície da placa então basicamente Se esse antimicrobiano for ativo contra o microrganismo que tá sendo avaliado ele vai inibir o seu crescimento ou então ele vai matar o microrganismo e isso Vai resultar na inibição do crescimento microbiano ao redor daquele disco de papel que antes era impregnado com o antimicrobiano Então vai formar um Malo ao redor desse disco que é essa inibição

do crescimento microbiano então basicamente o que tá de Amarelinho aqui seria o crescimento do microrganismo e o que tá em branco seria a inibição desse crescimento micr ano depois da incubação da placa o que o microbiologista vai fazer a partir daí é a leitura do diâmetro de inibição Então vai avaliar esse alo de inibição em milímetros para depois fazer a Interpretação para cada um dos discos cada um dos fármacos e em relação à capacidade ou não de inibição desse microrganismo diferente da técnica qualitativa a técnica quantitativa ela é realizada de uma forma um pouco mais

complexa e a sua interpretação também é um pouquinho diferente então ele se inicia da mesma maneira né então o microbiologista ele faz um preparo de uma suspensão bacteriana numa concentração padronizada do microrganismo só que ao invés de transferir isso pra superfície de um ágar e aplicar discos com concentrações fixas de cada um do fármaco o microbiologista trabalha aqui por exemplo quando a técnica é a microdiluição em caldo com placas de 96 Possos existem outras apresentações de placas também aqui é só uma forma de exemplificar com diferentes concentrações de cada um dos fármacos que vão ser

avaliados para aquele microrganismo aqui para simplificar essa explicação a gente vai considerar que essa placa que tá desenhada aqui ela é toda para um fármaco só e em cada linha a gente vai testar um microrganismo diferente então a gente estaria aqui testando vários microrganismos em uma única placa mas existem apresentações de placas em que cada uma das Linhas é um fármaco e cada uma das colunas são diferentes concentrações desse fármaco percebe percebam que na organização dessa placa a gente gente tem uma concentração crescente do fármaco a gente vai testar frente a essa bactéria então a

gente começa com concentrações mais baixas e elas vão aumentando ao longo da distribuição da placa tá e percebam que também que a gente tem duas colunas que a gente não tem nenhuma concentração de fármaco porque os métodos laboratoriais requerem controle de qualidade e nesse caso aqui a gente precisa de um controle de qualidade de esterilidade da placa então para garantir que as nossas soluções com antimicrobianos não estejam contaminadas com outros microorganismos e também de viabilidade da célula bacteriana então a gente precisa eh validar que o inóculo bacteriano que tá sendo aplicado nessa placa ele está

viável as células estão viáveis Então esse seria o nosso controle positivo então além da suspensão bacteriana a gente precisa produzir a placa de microd diversão em caldo ou adquirir comprar essa placa a próxima etapa então é fazer a transferência desse nóc bacteriano pra placa que contém os ou o fármaco distribuído em concentrações crescentes para poder então Eh dar início a parte prática né que de execução e depois incubar isso e fazer a interpretação dos resultados então depois que a gente faz o inóculo né a distribuição do inóculo da célula microbiana que a gente tá testando

a gente vai incubar isso em um tempo específico numa temperatura específica e diferente do crescimento microbiano em placa o crescimento microbiano em meio líquido que é onde estão eh diluído os fármacos e também feita a suspensão bacteriana e o crescimento microbiano aparece com uma turvação de cada um desses Pocinhos aqui representado por essa coloração marrom então percebam que para cada linha a gente teve uma diferença em relação ao crescimento microbiano então o controle positivo que avalia a viabilidade do microrganismo que a gente tá testando tá Turvo né Então tá marrom todos positivos o controle negativo

de esterilidade do teste tá sem o crescimento microbiano então também ele tá adequado E aí para cada um dos microorganismos que a gente testou para essa placa com concentrações crescentes de um mesmo fármaco a gente tem uma distribuição do crescimento diferente e aí essa distribuição do crescimento é que vai nos levar a interpretação do resultado Então o que a gente vai fazer paraa leitura é avaliar Qual foi a primeira diluição do fármaco capaz de inibir em vitro o crescimento microbiano então por exemplo nessa primeira linha a gente teve o crescimento do micro-organismo nos Pocinhos com

baixas concentrações do fármaco até aqui a concentração de 4 mg por ml o primeiro poço que inibiu o crescimento microbiano foi o Pocinho com 8 MG por ml então a menor concentração do fármaco capaz de inibir em vitro o crescimento desse microrganismo foi a concentração de 8 MG por ml Então essa é a Mique ou assim né que é a menor concentração de antimicrobiano capaz de inibir o crescimento em vitro do microrganismo então nas técnicas quantitativas a gente consegue dar um valor de inibição diferente da técnica qualitativa em que a gente testa concentrações fixas de

cada um dos fármacos existem outras metodologias que também são técnicas quantitativas eu trouxe aqui a técnica com fitas de Gradiente ou tiras de gradiente de concentração porque ela é uma técnica que vem sendo amplamente utilizadas nos Laboratórios clnicos de microbiologia e que vem trazendo a possibilidade ao clnico de ter acesso aos valores de concentração inibitória mínima né de ou líquido em inglês eh para alguns fármacos que são testados no laboratório como que funciona essa técnica e eu trago isso para vocês entenderem um pouquinho de algumas limitações dessa técnica a gente faz aquela preparação da suspensão

bacteriana então de uma concentração específica pro inóculo bacterian faz a transferência desse Inc bacteriano pra superfície de um meio de Cultura sólido né então pra superfície de um maga E aí nesse caso ao invés da gente usar um disco de papel impregnado com uma concentração fixa do fármaco a gente tem aqui uma fita uma tira que tem diferentes concentrações né concentrações crescentes do fármaco ao longo dela então percebam que após um determinado período de incubação numa temperatura específica nós temos aqui o crescimento microbiano no ágar e ao redor dessa tira a gente vai ter a

formação de uma elipse não mais um alo de inibição por quê Porque aqui a gente tem uma apresentação diferente de várias diluições desse fármaco e aonde essa elipse a borda dessa elipse encosta aqui na tira de gradiente de concentração a gente identifica Qual foi a menor concentração do fármaco capaz de inibir esse crescimento microbiano percebam que de uma maneira eh até um pouco grosseira bem simplificada dessa metodologia ela quase que é é uma adaptação da técnica de disco de fusão né então ela embora seja muito útil pelo laboratório clínico Ela também tem suas limitações por

quê Porque percebam que essa técnica ela também precisa que o fármaco ele se difunda no meio de Cultura assim como a técnica de disco difusão então eventualmente ela não é utilizada para alguns fármacos porque Um dos problemas na padronização do antibiograma deles é justamente essa dificuldade de difusão da droga na placa de meio de Cultura então por isso que para alguns Esse é um dos motivos pelos quais para alguns fármacos só a técnica de microdiluição de em caldo é validada que é inclusive considerada a Técnica Padrão ouro para avaliação da sensibilidade aos antimicrobianos bom em

relação à interpretação do antibiograma dos Testes de sensibilidade aos antimicrobial aí a gente chega aqui no que é conhecido como pontos de corte Clínico O que são os pontos de corte clínicos eles são nada mais nada menos do que a interpretação dos resultados do antibiograma que é realizado no laboratório de microbiologista seja ele pela técnica qualitativa em que o microb biologista faz a análise do alo de inibição da droga ou então pelas técnicas quantitativas que seria a identificação ali da concentração inibitória mínima então cada categoria de sensibilidade ela é definida pelos seus pontos de corte

específicos para cada grupo bacteriano e para cada fármaco para cada agente antimicrobiano almente eles eram definidos como S clinicamente sensíveis i a sigla i clinicamente intermediário e r clinicamente resistentes e eles servem para predizer a resposta Clínica no paciente com infecção então basicamente é essa interpretação para cada um dos fármacos que saem no antibiograma que fazem com que o Clínico eh reflita sobre quais seriam as opções de tratamento para aquele processo infeccioso Então os pontos de corte Clínico eles correspondem às Exposições necessárias de determinado antimicrobiano para inibir o crescimento das bactérias né dos microorganismos baseados

aí em Todas aquelas evidências da padronização do antibiograma desde evidências em relação ao microrganismo como em relação à droga como também a ensaios clínicos e evidências aí sobre as metodologias utilizadas para teste de sensibilidade aos antimicrobianos só para vocês terem uma noção do tipo de documento que o micro que o microbi trabalha desculpa dentro do laboratório de microbiologia então para cada grupo bacteriano e eventualmente gênero bacteriano então aqui eu trouxe a tabela de padronização dos pontos de corte clínicos pro estafilococos e nós temos informações sobre qual é o microrganismo Quais são as drogas que seriam

testadas que podem ser testadas para aquele microrganismo E aí a gente tem informação sobre como seria a interpretação paraas técnicas quantitativas Então qual seria a concentração inibitória mínima para classificar esse microrganismo como sensível intermediário ou resistente aquele fármaco e os pontos de corte também paraa técnica qualitativa disco de fusão ou KB Bauer para fazer o mesmo tipo de interpretação nesse mesmo documento nós temos as informações em relação às dosagens considerando que a interpretação desses testes tem relação com a exposição de cada um desses fármacos aqui também eu chamo atenção pro fato de que eu até

já comentei anteriormente eventualmente para alguns fármacos frente alguns microorganismos uma das técnicas eventualmente não é padronizada então por exemplo quando a gente pensa aqui em glicopeptídeos especialmente vou usar aqui a lincomicina como exemplo para estafilococos nós sabemos que a técnica de disco de fusão ela não é padronizada né ela não é adequada paraa realização do teste de sensibilidade aos antimicrobianos então percebam que na tabela a gente tem pontos de corte interpretativo aqui exclusivamente pra técnica quantitativa e aqui exposto que ela deve ser realizada pela técnica de microdiluição em caldo que como a gente já comentou

anteriormente é a técnica referência para esse tipo de avaliação bom mas essa interpretação que eu comentei anteriormente já é uma interpretação eh defasada né entre os anos de 2019 e 2020 o comitê europeu o elc dos quais o qual hoje a gente usa a documentação harmonizada paraa nossa realidade Nacional revisou eh as interpretações os pontos de corte clínicos pros fármacos e microrganismos que a gente tem padronização levando em consideração todo aquele compilado de informação que eu já comentei anteriormente e alterou a interpretação do antibiograma então a definição dos pontos de corte Clínico Embora tenha mantido

as siglas s i e r Então hoje o que é o significado das siglas s i e r no antibiograma s é considerado o sensível dose padrão isso é quando há alta probabilidade de sucesso terapêutico utilizando o regime de dosagem padrão daquele antimicrobiano e embora seja a sigla i a interpretação mudou e esse é o ponto mais importante hoje o i não é considerado como indeterminado isso é não sensível um ponto de dúvida né evitar usar o i hoje ele é interpretado e validado como sensível aumentando exposição ou então sensível exposição aumentada quando há alta

probabilidade de sucesso terapêutico porque a exposição daquele fármaco foi aumentada ajustando-se o regime de dosagem ou a sua concentração no local de infecção e o r seria o resistente quando há alta probabilidade de falha ter terapêutica então mesmo quando não há o aumento da exposição então percebam que agora considerando essas mesmas siglas s e i são considerados sensíveis a diferença entre eles é que para um deles que é a sigla i nós temos que aumentar a exposição e o r seria a única sigla que de fato não recomenda o uso daquele fármaco a partir do

resultado do antibiograma porque H alta probabilidade de falha terapêutica mesmo quando aumentando a exposição para exemplificar um pouquinho essa mudança eu trouxe aqui eh os pontos de corte clínicos para benzil penicilina na verdade considerando aqui um conjunto de dados de isolados clínicos de streptococos pneumônico Então esse gráfico aqui nada mais é do que a relação de uma eh escala crescente de concentração inibitória mínima de benzi penicilina Então a gente vai aqui de 0.002 eh milg por L até 512 MG porl e aqui o número de isolados que foram distribuídas para cada uma dessas concentrações inibitórias

mínimas então perceba que aqui é é em percentual porque a gente tem uma coleção muito grande né 36.28 observações de strepto coox pneumoni frente a benzi penicilina essa distribuição aqui dos isolados ela tá apresentada em três cores né então a cor verde aqui seria um dos isolados que estão nessa área que seria conhecida como a área de sensibilidade né então são isolados que não t mecanismos de resistência adquiridos pra resistência a Benz penicilina eh depois a gente tem uma área aqui numa coloração alaranjada que seriam os microorganismos que estão classificados como sensível aumentando a exposição

então o que que é isso são microorganismos que estão em amarelo porque eles t um mecanismo adquirido de resistência mas comprovadamente se ajustando a exposição à benzilpenicilina eles são sensíveis então a gente teria aqui alta taxa de sucesso terapêutico e a taxa a a a parte do gráfico desculpa aqui em vermelho as barras em vermelha são microorganismos que TM mecanismos de resistência adquiridos Mas que mesmo aumentando a exposição a gente não tem sucesso terapêutico ou um percentual alto de sucesso terapêutico então aqui os microorganismos são considerados resistentes e aqui os microrganismos são considerados sensíveis entretanto

verde mais escuro são sensíveis em dose padrão Verde um pouco mais claro aqui é a área de sensibilidade aumentando a exposição Então os pontos de corte que definem essas três áreas estão aqui né então o selvagem sem mutação é até 0.064 e aqui a gente vai ter os resistentes a partir de uma concentração inibitória mínima de quatro bom então como considerações finais dessa breve apresentação eu quero reforçar né Essa importância do antibiograma como uma técnica que orienta as estratégias de tratamento e especialmente essas novas definições de sensível intermediário que agora é sensível aumentando exposição embora

a sigla seja i e resistente que elas enfatizam a estreita relação entre a sensibilidade do microrganismo e a exposição dele no local de infecção o termo não sensível agora Portanto ele acaba brindo apenas os microorganismos resistentes os microorganismos s e i são aqueles em que são sensíveis então tem alta taxa de sucesso terapêutico em dose padrão Ou então aumentando a exposição muito obrigada