Determinação de proteínas por Kjeldahl (Bromatologia)

bom pessoal eu vou iniciar aqui a prática que vocês vão fazer né que vocês vão realizar que é a de proteínas Então como a etapa a primeira etapa da determinação de proteína pelo método de KLE ela é uma etapa demorada que leva 4 horas então eu vou fazer adiantar essa parte pesando as amostras pesando a mistura catalítica e adicionando o ácido e colocando para digerir na aula vocês vão Então e observar o final da digestão porque ela vai terminar em aula e daí a gente vai fazer as etapas subsequentes então paraa destilação e depois titulação

de cada uma das amostras como a amostra de vocês acabou a gente resolveu abortar a missão de usar elas eu selecionei aqui duas amostras que são aveia e batata palha tá bom da a gente vai fazer tanto a análise de proteína de lipídios usando essa mesma amostra então vou fazer a pesagem aqui uma coisa interessante para essa análise é que nós usamos Então esse frasco de pildo que é esse frasco onde ocorre a digestão vocês vão observar ele amanhã e nós pesamos a amostra num papel manteiga ou papel de seda que é um papel que

não contém nitrogênio uma vez que a análise de proteína ela é feita com base na quantificação de nitrogênio nós conseguimos então fazer a pesagem aqui colocar esse papel junto com a amostra dentro do nosso frasco e assim não ter o risco de perder né nada da amostra e o papel não vai interferir na análise ele vai ser digerido junto mas não vai interferir no resultado Tá bom então eu vou colocar ele aqui eu vou fazer el como se fosse um primeiro aqui como se fosse um e uma trouxinha tá que depois a gente vai usar

para enrolar isso daqui e colocar dentro do frasco tá então eu coloco coloc ele assim parar a balança e a pesagem daí é de 1 g daí eu vou marcar essas pesagens para vocês para que vocês daí possam fazer o cálculo já identifiquei os frascos também isso é importante né gente tem que identificar o frasco para poder saber depois Qual é n senão não dá tá então 1 g de amostra que de aveia po fazer não sei se vocês conseguem ver daí eu acredito que não mas tá dando [Música] 1,002 tá então a a amostra

aqui do do tubo um 1,002 isso a gente também tá anotando né daí o que que nós fazemos aqui eu com cuidado então eu até cortei eh o papel um pouco maior para que eu tenha é melhor que eu tenha um excesso de papel aqui um pouquinho a mais de papel do que falte e depois ruim de fazer isso aqui então o que a gente faz a gente enrola ele como se fosse aquelas Bombinhas Sabe aqueles estalinhos que a gente joga no chão e estora então é mais ou menos isso Ó faço uma uma troxinha

com a amostra e assim nada da amostra foi perdido daí vou colocar aqui diretamente no frasco pronto eu vou repetir esse processo agora para todos eles anotando esse peso ok bom pessoal agora já pesei todos então vocês podem ver aqui estão os frascos com a nossa amostra ali enroladinho no papel né e agora eu vou adicionar a mistura catalítica na metodologia a mistura catalítica é é pedido 5 G Tá mas ela não vai interferir na nossa análise em termos de de quantificação Então não preciso pesar exatamente de 5 G tá bom assim como a amostra

também não é exatamente um eu vou anotar o peso porque isso vai ser considerado no calul mas a mistura catalítica em particular ela não é considerada no cálculo ela só é utilizada só não né então é um motivo bem especial mas ela tem dois objetivos eu tenho aqui sulfato de cobre e sulfato de potássio O sulfato de cobre e O sulfato de potássio eles vão ter aun a a função de aumentar o ponto de ebulição do ácido sulfúrico que a gente vai adicionar aqui um pouquinho porque a gente vai usar temperaturas altas de 400° então

para evitar que ele evapore a gente adiciona eh o a catalisador e também de eh acelerar o processo de oxidação da nossa amostra na etapa de digestão então a mestura catalítica ela é bastante importante para que eu consiga usar a temperatura mais elevada e digerir mais rápido a nossa amostra sem perder nada né É claro que esse mais rápido é relativo porque essa etapa ela dura aí 4 horas então mesmo assim demora 4 horas se a gente não utilizasse a mistura catalítica teríamos que usar temperaturas mais baixas e consequentemente o tempo muito excessivo para e

muito maior para conseguir a digestão Tá bem então Vou pesar aqui vou olhar mais ou menos quanto dá uma espátula se chega próximo Aí a 5 g e daí vou adicionando nos outros uma quantidade semelhante tá Não precisa pesar exatamente tá bem pessoal daí eu pesei então a mistura catalítica já para todos já coloquei em todos aqui é o último daí a gente coloca diretamente tá não tem problema então eu só inclino Dobra a barquinha assim coloco diretamente ali dentro mais ou menos 5 G tá ficou todo bem bem próximo a esse valor feito isso

agora a gente tem então os frascos com as amost prontas né então vocês observarem ali eu tenho os o frasco com o a mistura catalítica e amostra agora eu vou adicionar o ácido sulfúrico concentrado são 20 ml pessoal eu adicionei Então os 20 ml de de ácido sulfúrico e olha só o primeiro tubo que eu acabei de adicionar ele já está ficando escuro tá vendo ó O último é esse aqui tá começando a a já se dá mostra e aqui é o primeiro ele vai ficar totalmente Preto né nessa nessa etapa inicialmente totalmente preto eu

vou ver se eu consigo ainda pegar um uma fazer umas imagens dessas para eu mostrar para vocês e depois ele vai ficar totalmente límpido como vocês vão ver depois eh aqui eu já liguei o bloco dig gestor uma temperatura por enquanto um pouco baixa 100 g tá então vou adicionando aqui diretamente no bloco dig gestor daí o que eu faço é colocar um funil Zinho aqui em cima para evitar para que vai forma vapor ali né E daí esse vapor ele condensa e volta volta lá então mesmo assim a gente liga Claro a capela né

agora tá desligado porque eu preciso falar PR vocês Vou colocar aqui para evitar perdas né e vou já aumentar para 150º aqui inicialmente tá então vou setar aqui para 150 daí depois o que a gente vai fazer que eu vou fazendo n ao longo aí do dia que vocês vão terminar [Música] amanhã a gente vai aumentando isso pronto a gente vai aumentando essa temperatura gradativamente porque a temperatura de digestão ela é 400º só que se nós colocarmos diretamente a 400º a reação ela é muito muito eh forte e gera a perda inclusive forma eh chega

a espirrar ácido e daí vira uma bagunça dentro da Capela tá então o ideal é que nós vamos aumentando a temperatura aos poucos Geralmente eu vou aumentando aí A cada 30 minutos eu aumento 50º até chegar a 400 esse processo inteiro de digestão leva em torno de 5 horas de 4 horas porém se ao final dessas 4 horas a gente olha ali e ele ainda está não está totalmente gerido porque ele tem que ficar bem límpido né se não estiver assim daí a gente tem que deixar um pouquinho mais mas normalmente entre 4 e 5

horas é suficiente Beleza então vou ver se eu consigo registrar mais umas imagens para mostrar para vocês ó aqui então a gente vai fazer a toda a destilação da nossa amostra tá mostrando aqui para vocês como ficou a amostra tá lembrem-se que ela quando a gente começou ela tava escura vocês lembram né eu mostrei lá então agora depois que que ela digere ela fica límpida dessa forma aqui tá aparecendo aí bem pessoal tá eh daí então aqui que eu tenho O sulfato de amônia sulfato de amônia o importante é que a amônia em si tem

uma um nitrogênio então todo o nitrogênio da proteína foi eh a amostra foi digerida liberou o nitrogênio e esse nitrogênio está contido nesse sulfato de amônia tá que não é volátil Ele está solubilizado aqui mas ele não volatiliza então para separar esse cara daqui eu vou adicionar hidróxido de sódio o hidróxido de sódio entra em contato com o sulfato de amônia libera a amônia volátil o nh3 daí então agora tem uma forma de amônia que se volatiliza daí é que entra o papel da destilação daí eu vou aquecer gerando vapor lá na Caldeira vou acender

aqui ó olhem lá atrás ali onde Tá acendendo que tem água tá vendo Então lá é uma caldeira Eu tenho um recipiente com água e uma serpentina que aquece essa água quando aquece essa água gera vapor esse vapor ele vem por aqui e borbulha dentro da nossa amostra daí a amônia que está aqui vai aquecer vai volatilizar vai percorrer todo esse caminho chegar no condensador condensar e ser coletada no ácido bórico tá então o que a gente vai fazer eu Primeiro de tudo vou medir 50 ml de ácido bórico Lembrando que esse ácido bórico ele

é em excesso Ou seja eu tenho a quantidade de ácido bórico que é muito maior do que a quantidade de de amônia que vai reagir com ele e o que a gente vai titular depois esse exesso não esse a parte que reagiu o Borato de amônia que foi formado Tá bom então vou medir aqui 50 ml do ácido bórico 50 ml de ácido bórico que né novamente falando ele não é Rosa ele é transparente quando a gente prepara mas aqui ele tem o indicador misto então que vai ficar nesse PH ele fica Rosa depois ele

fica verde e depois ele fica Rosa de novo tá então esse daqui ele vai aqui na extremidade do na na saída aqui do destilador conecto ali tá Dá um medo né de cair mas não não cai não daí aqui eu vou conectar o nosso tubo então aqui eu col eu conecto aqui ergo giro isso daqui para ele encaixar então ele encaixa fica bem preso aqui fecho aqui daí agora então primeira etapa que que eu tenho que fazer adicionar o hidróxido de sódio aqui eu coloquei hidróxido de sódio 50% ele é bem concentrado tá então fica

é é uma solução tem que ter cuidado de manipular tá então aqui eu vou adicionar o hidróxido de sódio eu vou abrir essa essa válvulas inha para ir adicionando lentamente tá às vezes ele fica Ah agora foi agora foi mesmo ele foi tranquilo não foi Violento mas é isso aqui que acontece quando ele fica escuro e eu tenho a conversão da amônia do sulfato de amônia e amônia volátil tá então ele gera essa mudança de cor agora reparem que aqui o ajuste de temperatura lá da caldeira tá no mínimo Então agora eu vou colocar aqui

no máxximo tá essa válvula tá fechada e eu vou borbulhar vapor ali para des L amostra de fato tá então agora a gente deixa a mágica acontecendo né mágica não né química daí cada quando a amônia é coletada no ácido bórico ela vai formando o Borato de amônio quando esse Borato conforme ele vai se formando né ele vai mudando o PH e a gente começa a ver a mudança de cor então reparem Daqui um pouco vocês vão olhar no nível dos olhos aí vocês vão começar a ver ele mudando de cor daí o que eu

tava explicando pro outro grupo é que a gente deixa destilando até dar 200 ml tá Por quê Porque e eu garanto né com esse volume eu vou garantir que toda a amônia que eu tenho na nossa amostra foi coletada ali então para garantir eu eu destilo ali até 200 ml se eu usar o micro kildo daí eu uso 200 mg de amost e não 1 G né então é é bem menos cinco vezes menos daí também todos os volumes aqui vão ser menores Tá mas para esse equipamento ele a gente os frascos que a gente

tem são todos para não para micro né que o micro É esse aqui já tá mudando né e ali ele tá rosa e tá porque não tá homogêneo se eu mexer Eli Ele fica verde ainda tem um rosinho ali n bem pouquinho né tranquilo áf ácido sulfúrico tem aqui ó é porque aqui o que que acontece a gente quando eu pesei eu não disponibilizei ainda para vocês o vídeo vou colocar ele completo Tá mas na primeira parte eu peguei peguei 1 g da amostra pesei num papel manteiga coloquei com papel e tudo aqui dentro coloquei

o catalizador né que é o sulfato de amônio e sulfato de potássio que é um parece um eu não sei se aqui ó parece um sabão em pó tá então esse aqui é o catalisador coloquei mais ou menos 5 G dele aqui depois disso eu coloco 200 ml de ácido sulfúrico o ácido sulfúrico é que vai fazer a digestão tá daí lóg precisa de calor né então eu uso ali temperatura de 400º para isso mas é aqui que vai acontecer a digestão del ó Foi pessoal daí eu vou fechar eh fechar não vou diminuir a

temperatura tá eu para ajudar resfriar um pouco porque eu não posso tirar ele borbulhando né eu ligo um pouquinho aqui a recuperação do nível da caldeira daí entra água fria lá e resfria tá então vocês vão ver que já vai parar de borbulhada aqui um pouquinho daí eu já aproveito para recuperar um pouco o nível e resfrio para tirar mais rápido feito daí esse tubo ele tá bem quente Então a gente não pode pegar ele sem a luva tá tá então toda a m que a gente tinha aqui volatili passou para lá e deixou ente

por causa do ácido bórico é porque daí reage a amônia volátil reage com ácido bórico forma Borato de amônia então aqui na solução eu tenho ácido bórico e Borato de amônia e aí eu vou titular a quantidade de Borato de amônia que formou então o ácido clorídrico agora ele vai reagir com o Borato de amônia formando de novo ácido bórico e a proporção de amônia para buraco é um para um um para um e para ácido clorídrico também tá então tiro aqui daí é tá quente até mesmo com essa luva aqui se a gente fica

muito tempo segurando isso aqui ele começa a ficar difícil Lembrando que esse aqui eu tô jogando aqui nessa pia que é a pia que vai paraa cisterna então aqui eu tenho resíduo químico então por isso que vai ali direto tá daí aqui agora o o Earl Mayer ele tá tranquilo aqui ele ele tá frio tá então eu só vou pode pode pegar tranquilo aqui da eu só lavo um pouquinho com água destilada né para tirar algum resíduo que eventualmente possa ter ficado e foi se vocês quiserem como o deles já deu um volume mais alto

se vocês quiserem transferir pro pro pro de 500 tá daí só eu acho que vocês vão usar talvez eles depois então daí passem uma água de uma lavadinha nele que a gente vai usar tá bom i