Expressão e purificação de proteínas recombinantes - Fundamentos em Biotecnologia

oi bom dia pessoa meu nome é vitor luiz e eu vou ministrar essa aula de expressão e purificação de proteínas recombinantes entender um pouquinho o que que seria proteínas recombinantes e como que seria o processo de expressão e purificação dessas proteínas antes a gente tem que voltar alguns passos entendeu o que que é o dna recombinante e como que o dna recombinante pode estar produzindo uma ruma a proteína recombinante onde então a tecnologia do dna recombinante é um conjunto de técnicas que permite aos cientistas identificar isolar e multiplicar expressar genes de qualquer organismo bom então

dna recombinante modo geral e também de um modo simples uma molécula híbrida por quê porque virar a gente fala que ganhar como não tinha uma molécula híbrida é exatamente que eu vou fato de unir dois fragmentos de dna que são obtidos de diferentes sons ou seja então é combinação de sequências gênicas sequências de dna obtida em frente sons que no final é se resume em uma única molécula uma única molécula de ácido nucleico só que maneira que isso é produzido com tecnologia do dna recombinante a técnica né para produzindo com a ida não crescer dna

recombinante é clonagem molecular é a técnica central da tecnologia deles ela com eu lamento e na propagação de moléculas de dna e tem só que da gente entendeu um pouquinho entender alguns termos quem certo vetor e duas vídeo tá bom então certo é o fragmento de dna a ser clonado ou seja aquela sequência gênica e possui o gene de interesse esse gene será transcrito né traduzido e modificará a sua proteína de interesse para o seu estudo né esse é sim certo essa sequência gênica ela é obtida através do uso de algumas enzimas de restrição mas

pra frente a gente vai falar um pouquinho melhor sobre essas enzimas mas elas funcionam exatamente fazendo o corte em regiões específicas da do genoma para que você rickli essa sequência de se decide nome desse genoma e posta inserir no vetor e o que que é o victor a molécula de dna usada como veículo para inserção do inferno o diretor ele possui algumas características específicas esse victor ele pode ser diferenciado em um vetor de clonagem né que é que é exatamente desde que estamos falando agora é clonagem molecular eo vetor de expressão para você poder expressar

a sua proteína recombinante que você quer estudar então escutando expressão ele ele ele ele possui algumas algumas características específicas para que ocorra né a clonagem molecular gente vai tá falando um pouco melhor sobre isso mais para frente mas só para vocês irem pegando alguns alguns termos para vocês irem se habituando né alguns termos um bom então como que é feita a clonagem de um gênero de modo geral é aquela ocorra de fato ocorra dois essenciais para clonar o primeiro é que anteriormente que a ligação de um fragmento de dna de interesse a uma outra molécula

de dna com a ligação do seu incerto ao seu vetor certo pregação de um fragmento de dna de interesse a uma outra molécula de dna assim de formar o dna recombinante depois que você formou o dna recombinante esse chamado combinar combinar que a obtenção é demais transformantes as matérias que o seu dna e que isso é essencial para que você obtenha o maior número de cópias desse doce dna recombinante então o processo de transformação bacteriana é essencial para você obter o maior número de cópias desse dna e para você dá seguimento prosseguir estudo para os

objetivos do estudo é bom pessoal então para ficar mais fácil a visualização daquilo que eu tava falando anteriormente assistir uma animação e como aceito cartonagem no quarto dos processos né etapas da clonagem molecular eu vou falando com vocês conforme animação por for passando na tela um pontão primeiro de tudo você precisa preciso identificar a sequência janta que você quer clonar é pra você identificar essa sequência genética existem algumas técnicas e a principal técnica e uma das técnicas mais modernas é fazer o sequenciamento conhecimento dessas bases né que compõem o gênero do qual você quer estudar

e depois você tem certeza que esse é o seu um certo você começa você inicia as etapas de né bom então como eu disse existe um certo que é ou não é e depois que você fez a identificação da assim certo ou seja dessa sequência que você quer clonar você precisa inseri-la né num vetor de clonagem como eu disse anteriormente o vetor de clonagem ele possui algumas características únicas essas características elas é tão compostas né por um por uma região de origem uma região de resistência a antibiótico e uma região que é possível e se

usa enzimas de restrições para né esse esse vetor seria o seu pênis nada existem regiões como promotor e terminador são essenciais para o processo econômico e como estava dizendo existem algumas regiões são possíveis de algum de algumas passagens pelas enzimas tá fazendo aqui ele tá ele tá colocando em cima gestões essas enzimas são específicas para determinadas regiões dos genes não é qualquer enzima que você coloca que vai te levar o gênio que você quer e depois que você insere essas essas enzimas tanto no incerto e vai retirar frequência gênica que você tanto do vetor e

vai abrir o retorno lembra que esse vetor é uma é um dna circular então ele abre para que vocês aqui junto para retirar a região se você quer falar e o que que vai acontecer no vetor agora é tão lindo é só naquela região que é possível né que é passível na verdade disse privada isso abre a molécula de armamento a uma molécula circular e se tem um espaço para que você insira o seu incerto e através de um mix né de ligação uma solução de ligação é que ocorre essa essa ação do incerto com

vetor e como vocês podem ver né na animação e você coloca as moléculas já crivados do seu incerto né são as sequências gênicas específicas ah e também as moléculas do retorno que já estão abertas para que o seu incerto se ligue ao seu retorno oi e esse obtenha né no final a a molécula de dna recombinante e aí existem algumas enzimas nesse processo todo como a minha ligado que você insere para para ter a ligação né do do enxerto com o vetor bom então existe todo um processo enzimático nessa nessa etapa tá bom então você

insere né em vinho uma ligação entre um certo eu sou tão tendo assim não é uma molécula de dna circular que é composta pelos um e depois que isso tá pronto qual é o próximo passo próximo passo é aquele papo mariano eu disse anteriormente então você minissérie essa molécula aí bíblica esse dna após mundial em um organismo que é passível de replicação e quando essa bactéria estiver replicando né processo de divisão celular dela ela também vai replicar o seu material genético e junto com a replicação do seu material genético ela fala a replicação aquele dna

recombinante que você inseriu dela só um adendo aqui o dna recombinante não é dela você quiser né por um alguns processo que a gente vai entender posteriormente só depois que você faz o cultivo né dessa dessas peças bactérias você pode fazer um processo chamado de purificação de dna e onde depois você vai obter apenas as cópias desse desse dna e maneira limpa para que você possa utilizar em futuras é transformações que ele tá fazendo aqui aqui tá cultivando a bactéria para que se obtenha maior número de cópias né número abundante de cópias desse dna recombinante

para depois posteriormente fazer a publicação desse dna e ter uma uma mostra né desse dna recombinante purificado e também é limpo né para que se use conforme for o objetivo do estudo em questão é bom gente então esses foram os passos para produzir uma molécula de dna recombinante e agora a gente vai começar a falar um pouquinho da expressão de proteínas recombinantes não então seria eu tenho que combinou só quando você acabou de estudar né o processo de clonagem molecular é para fazer um dna recombinante é o que esse dna recombinante procure ficar geralmente uma

proteína né para moléculas codificadoras né de proteína então essa proteína é dita como recombinante também então a proteína a vinda de uma molécula é criada artificialmente parcialmente dita como dna recombinante é tá certo então são proteínas produzidas artificialmente a partir de genes isto é advém da técnica de dna recombinante é as coisas aplicabilidades dessas proteínas recombinantes são importantes estudar essas proteínas recombinantes fazer os os passos de expressão e depois purificação é e como que se da habilidade dessas pessoas proteínas podem serem usadas e higiene maneiras terapia gênica né que a possibilidade de introdução de um

gene no organismo e consequente correção de doenças genéticas melhoramento animal e vegetal então produzir plantas existentes através né a diferentes meios nutritivos criação de modelos animais também nesse caso são ideais para estudo da estrutura da função da relação de um gênio certo então possui diferentes diferentes aplicabilidades e contam com obter uma proteína recombinante depois da clonagem do gene de interesse e para a gente entender isso a gente precisa antes entendeu o que é um sistema heterólogo de expressão pro tempo o que seria um sistema heterólogo o sistema heterólogo de expressão nada mais é que induzem

o organismo pressão uma determinada proteína de seu interesse que normalmente ele não expressa bom então vamos dar um um exemplo aqui então você induz uma bactéria no caso explica cole a produzir uma proteína é no caso essa proteína o exemplo aqui é a telomerase só que essa tela brasil que você quer estudar ela de vem é uma pelo merazi de leite maninha certo nós humanos nós possuímos pelo mercado também alguns outros organismos mas a telomerase que você quer estudar química então ela de vende leite mana só que para você expressar essa essa proteína é larga

utiliza-se de um sistema ou seja você utiliza-se de um outro organismo pra tá fazendo essa expressão em larga escala e pra tá fazendo os estudos posteriores né é o material lembra que a gente já comentou um pouquinho da transformação bacteriana no no processo de clonagem e é exatamente a mesma ideia só que a gente precisa aprofundar um pouco mais o do conhecimento a ser pela transformação bacteriana então antes a gente vai falar um pouquinho de células competentes então para você fazer a transformação bacteriana que é o processo no qual você vai pegar o seu dna

recombinante colocar é colocar na na bactéria e fazer com que a bactéria estresse os genes de ser esse dna recombinante antes você precisa que elas estejam aptas para receber um dele ar episódio seja um dna da qual não faz parte do genoma dela esse processo se chama é da e da escrita core no caso geralmente utilizamos escrita cole existem outros sistemas de heterólogos de expressão como leveduras mas o mais usual é a escritório então você precisa tornar-se competente processo para tornar torná-las elas competentes é adivinha tratamentos com algumas com algumas soluções que modifica a membrana

essas bactérias modifica para que seja possível utilizar o utilizar o que seja possível é a utilizar não me fugiu a a palavra para que seja possível inserir né o dna que só a nossa essa bactéria tão a membrana ela digamos que se torna mais fácil da bactéria receber né esse dna que só escrevi errado fala o nome dela bom então a transformação bacteriana ela consiste na inserção do plasmídeo contendo seu gene de interesse para que por meio da expressão heteróloga o produto do gene ser expresso ou seja só proteína recombinante seja esquece a que a

gente tem a imagem de um plasmídio essa imagem na verdade o plasmídeo no qual eu trabalho no meu projeto de iniciação científica contendo domínio específico da frase de leite humano então nesse especial esse é um brasileiro inscrição né onde tem o gene específico que vai purificar até namorado em 16 semanas e contendo outras outras características que a própria do vetor onde depois que o torno as bactérias as células competentes eu faço processo de transformação bacteriana e aí tá bom então é que se faça triana pouquinho sobre meios de cultura e seletividade dessas peças bactérias e-mail

aos meios de cultura então cultura das bactérias seja contigo sólido ou seja cultivo líquido é necessário uma gama de nutrientes para divisão da saúde utilizados durante o cultivo é importante que haja efetividade desses organismos o que que é isso quer dizer quando eu quando eu falo que é importante que haja criatividade desses organismos eu quero dizer que no meio de cultura onde você está cultivando essas bactérias transformadas sim ou se não para para fazer o processo de competência para depois você transformar é importante que haja antibiótico pax de utilidade desses organismo lembra que eu disse

que o doutor possui algumas regiões específicas a gente já viu isso lá na animação anteriormente existe uma região no retorno é uma região de resistência e geralmente resistência algum antibiótico como canal me ensina por um fenicol ampicilina e geralmente essa resistência ela ela não é vista essa resistência a esse determinado antibiótico ela não é vista na bactéria que você tá utilizando então se você tiver uma bactéria que não esteja transformada como esse dna recombinante e colocar o antibiótico de reses o que o teu próprio veneno combinar de conferir você vai acabar matando essas bactérias porque

ela não não faz parte do organismo delas do genoma delas conferir resistência a esse determinado antibiótico e é exatamente por esse meio que se dá o processo de seletividade porque quando você transforma essas essas bactérias com esse dna combinando confere tensão certo antibiótico e quando essa bactéria recebe esse esse dna e é como se fizesse parte do genoma dela então ela vai se tornar resistente a esse então vamo pegar um exemplo uma uma mas olha ela só possui resistência a um determinado antibiótico procuram perigosa então se eu tenho uma cultura cloranfenicol elas vão aguentar elas

vão resistir porque hoje é norma próprio dessa bactéria confere resistência ao cloranfenicol agora é seu adiciona um outro antibiótico e ela não está transformada com com aquele gênio que você quer que é inserir ela por meio do dna recombinante porque ela não tem tempo então vamos vamos cortar eu coloco a linha na piscina ela não tá transformada ainda então ela ela não ela não tem resistência depois antiga nós estamos provavelmente né ela morrerá agora como eu transformo com dna recombinante e conferem é que que tem uma região de resistência a um determinado antibiótico como por

exemplo pela medicina é quando eu adiciono além de crônica nicola que a própria resistência da bactéria tradicional para piscina também essa bactéria tá transformada ela vai viver numa boa entendeu ela vai continuar o seu processo de divisão celular fazendo cópias e cópias daquele daquele dna recombinante que você inseriu nela e aquelas que não receberam a sua cópia ganha combinante vai morrer então esse processo de criatividade essas bactérias as bactérias que não foram transformadas morreram porque não possuem resistência ao antibiótico o que é conseguido através do dna recombinante ou seja do plasmídeo e tem o seu

incerto e e a sua sequência né do do exame que vai expressar sua proteína então ela ela morrerá agora as transformadas não as transformadas continuarão produzindo cópias e cópias desse seu transmitir esse seu dna recombinante que posteriormente vai estressar a tua proteína de interesse oi e agora que a gente tá falando um pouquinho sobre o processo de criatividade por meio de antibióticos nesse nesses meios de cultura vamos falar no próprio meio de cultura né então além de cultura ele consegue uma gama de nutrientes que é importante para divisão celular do organismo que está inserido neste

meio de cultura que geralmente é uma bactéria uma escrita como um dos meios mais comuns são conhecidos como meio lb6 só b - ok meio macconkey dois gama de meios de cultura mas mais utilizados precisem escultura vai muito do organismo que você tá é o utilizando para o seu sistema heterófilo como eu falei anteriormente existem outros organismos existem esses planos existem leveduras as bactérias também é e aí quando você utiliza bactérias e sem as minhas férias então existem presentes quis né de de bactéria pede 21 de três é o rio enfim existem e nn imagens

e a diferença pode influenciar expressão da sua da sua proteína e depois que você utiliza a técnica de transformação cirúrgicos você realiza na verdade a técnica de transformação depois que você faz o cultivo e tem nos seus clones é geralmente esse cultivo ele ele é feito através de meio sólido e também meio líquido nem líquido é para fazer um trenó porque depois eu vou tá explicando mais para frente a a importância de um trem inóculo e depois o cultivo em meio sólido para que se tenha colônias isoladas por que é importante no processo de transformação

e cultivo dessas bactérias que se tem colônias isoladas e livre e é contaminação para não interferir nas próximas etapas né o portão aí você precisa fazer a confirmação da transformação é você precisa realmente saber se o seu incerto é tá naquela colônia certo você vai ter uma placa de petri com meio de cultura e diversas colônias ali que são as bactérias e em teoria elas estão transformadas porque lembra daquele fato que eu falei para vocês sobre o uso do antibiótico de existem então se ela cresceu no meio onde onde existe o tanto antibiótico próprio dessa

bactéria como antibióticos e resistência conferido através do vetor então tese em teoria é essa colônia têm clones obtendo o gene de interesse que eu quero estudar é só que nem sempre isso acontece às vezes e esses clones não possuem o gene de interesse então é importante que se realize a técnica chamada pcr e posteriormente eletroforese para gente ter certeza que aquele crônica ter certeza que aquele clone na verdade é contém beleza então depois que você tem as suas bactérias transformadas é você preparar para confirmar com as colônias utilizadas são a expressão da proteína contém certo

desejável é necessário que você cut técnica conhecida por pensar o nome então se prepara suas amostras você pega seus colonos você como a pcr é uma até então onde vai amplificar determinado gene que você queira analisar é então você tem que preparar mostra que você precisa o time snapchat moléculas iniciadoras e vai ser popular na região franqueada do gene para fazer essa amplificação esses primers são específicos porque você quer analisar um gene específico esses fragmentos precisa terem específicos do gene que você quer analisar e aí essa aplicação é feita ela tá com liberada então em

cima né que vai mimetizar a dna polimerase no processo de replicação do dna ou seja ela vai começar esse material e né no processo da você vai ter um n número de cópias só desse gênio é porque a altura ao longo do processo de pessoa que você tem ciclos em ciclos e ciclos então acaba ciclo vai vai acontecendo processo de amplificação né e depois você executa uma técnica chamada eletroforese que a gente vai tá falando mais para frente de uma maneira mais aprofundada o que que seria essa técnica de eletroforese então aqui nessa última imagem

eletroforese em gel de cross cê g é visualizada se aquela colônia que você utilizou é tem então você prepara uma amostra contendo até o seu gênio interesse você coloca no gel ele e ele vai sou seu controle e depois você coloca as amostras amplificadas por pcr esse essa mostra bater com seu controle ótimo quer dizer que a coluna que você utilizou realmente pontinha o seu gênio de 22 em gel de agarose ela é feita em gel de agarose porque a os dez utilizados para fazer essa técnica eles diferem conforme a essa forma que você quer

analisar então para dna geralmente a gente utiliza gel de agarose que a proteína a gente eu te é um gel de poliacrilamida é totalmente diferente desse a gente vai tá falando um pouquinho disso mais para frente é bom pessoal depois que você já tem bactéria transformado com aquele dna recombinante que possui o gene de interesse que codificar a a proteína da qual você quer estudar é importante que se conheça essa proteína é importante que se faça a caracterização funcional essa proteína por meio por meio da expressão então para que sobre o tem uma boa qualificação

proteica é imprescindível que se conheça a sobre a solubilidade da proteína desejada e alguns outras e algumas outras características também então como que você pode fazer isso por meio de um teste de solubilidade a partir de um ensaio diminuindo são essenciais diminuição é a gente a gente diz me indução porque a gente utiliza muito pouco de volume de meios de cultura para expressar essa proteína então nesse e não tá expressão pensando na publicação dessa proteína a gente vai ver que quando a gente é deseja publicar essa proteína a gente tem que trabalhar um volumes em

larga escala para obter uma quantidade né a concentração entender como é que funciona choveu solúvel é quanto de ptg a gente vai ter que utilizar para expressar a proteína porque lembre vamos inscrição essa proteína no sistema heterólogo no sistema é da qual aquele organismo é normalmente não esquece né é só essa proteína então a gente precisa utilizar uma substância dita como proteger é a gente como proteger para induzir a se expressar a proteína qual você quer estudar é bom então primeiramente você precisa fazer um trem inóculo contém dos clones a 37 graus por levitação por

16 horas esse trem inóculo é geralmente você pega a colônia não daquela colônia que você já tem certeza que contém seu interesse e cresce ela 16 horas da noite ou seja deixa de 100 tem um número expressivo não de cópias naquele ano e até você fazer de para depois você fazer a indução dessa proteína você precisa ter bastante bactéria com bastante clone para depois você colocar né adicionar o indutor que vai expressar a sua proteína para você tem um número grande de copos então você vai ter uma quantidade de gordura e proteína teoricamente então você

dormente outra inóculo você faz o cultivo das bactérias em 37 graus sob agitação até atingir o desses ao de 600 né essa pode ela é ela é verificada através da de uma técnica né de absorbância de luz então quanto maior a limpa dizer que você tem o número de bactérias certo esse e proteínas expressas bom então a quantidade ideal que você estabeleceu para uma boa expressão proteica é o de 06 bom e oi e aí depois você começa a fazer os seus testes né de expressão aí você começa a ver o quanto de proteger você

precisa adicionar na mostra qual é o concentração ideal de proteger você pode analisar em qual temperatura essa essa bactéria pode pode ficar sendo cultivada durante a expressão a temperatura influencia na na expressão dessa proteína então você pode expressar ela a 12 graus pode expressar ela 25 a 30 a 37 mais 37 não é não é interessante e temperatura também não tão interessante assim existem alguns tipos são algumas móveis que são específicas para temperaturas baixas aí sim seria interessante utilizar essas linhares mas enfim você pode ir e é entre aspas brincando né até você achar uma

condição ideal a temperatura boa uma quantidade de tempo de expressão você pode analisar também o tempo de expressão então depois que eu adicionei o detergente é eu vou avisando de hora em hora para saber qual qual é o momento que tem uma uma quantidade boa ele proteína expressa até você estabelecer mas que tempo de temperatura as mensagens que você tem disponíveis no laboratório você também pode ver qual linhagem expressa melhor a sua proteína e a gente falou bastante aqui do iptg é um doutor para que esse estresse né proteína então o que é esse proteger

e como que ele funciona então para entender a função dele e a gente tem que que saber que os principais plasmídeos inscrição utilizam os promotores lagu tak et7 para que ocorra né a transcrição dos genes e posteriormente a tradução desse genes promovendo a a expressão das proteínas de interesse então existem algumas proteínas e professoras né que se ligam a esses promotores e acaba impedindo a expressão da proteína de interesse então é por isso que você utiliza o btg bom então a no próprio sistema bacteriano né que é o operon existem esses esses promotores então é

associados com algumas com alguns algumas proteínas impressoras e por si só não daria conta de expressar a proteína de interesse então um indutor de beta galactosidase usado para promover a expressão de proteínas ensaios controlados pelo sistema operam lá que ele é capaz de induzir essa essa essa expressão né essa essa proteína tá botando quando se utiliza não é proteger ela se presta essa reflexão ela é dissociada do promotor e aí tem a promove a expressão é a sua inscrição desse gênero e consequentemente a expressão dessa proteína e aí tá bom então depois que você faz

a indução da proteína você precisa confirmar por meio de um gel de um gel denominado sds-page que é um gel de poliacrilamida próprio para análise de proteínas no fracionamento dessas proteínas no gel que você precisa depois que você fez o cultivo né cultivo dessas essas bactérias ou seja depois da expressão você precisa adotar alguns passos para que a proteína seja visível o gel para que para que você consiga visualizar essa proteína no gel então para isso para esse primeiro você precisa fazer a lise bacteriana daquele extrato bacteriano que você observe depois do cultivo essa lisa

e ela pode ser uma lise química uma análise mecânica uma das vezes mecânicas mais utilizadas através do sono equador ou seja através de você faz a a quebra dessas membranas para ver se libera proteína para o meio outra através de som tão sonicador é um espinho bom o volante também para fazer essa lisa e mecânica lc química através de alguns regentes atrás de alguns sais através de algumas enzimas que podem fazer também essa lisa depois você tem a separação das frações protéicas por centrifugação e aí você tem a geração de um sobrenadante e o perry

ti então é a partir dessa mostra que você vai ver só proteína solúvel ou insolúvel é proteínas solúveis elas ficam na fração do sobrenadante que a fração solúvel do extrato proteico a fração do pênalti geralmente vai conter proteínas insolúveis então quando você vai visualizar fazer o fracionamento dessas proteínas no gel sds-page a ele através da eletroforese você coloca você coloca no gel né nos próximos dos reis e aí o tanto a porção do sobrenadante tanta força do teste e aí você vai ver onde é só proteína esse pessoa e por essa nave e você vai

conseguir observar se era uma proteína se a proteína na qual você tá trabalhando a proteína solúvel que é solúvel você vai verificar qual que foi a condição ideal de proteger você fizer um gradiente de proteger você coloca no gel todas as amostras desse gradiente você ver qual concentração foi a que melhor expressou sua proteína que funcionou para expressar sua proteína ea questão do tempo então coloca no geral também amostras uma duas três quatro horas depois e assim você faz essa caracterização que a gente falou através da excreção por meio de um ensaio de mini indução

essa proteína bom então depois que você já fez caracterização da expressão da sua proteína esta moça induzir em larga escala com o objetivo de purificar esta proteína então depois da verificação da solubilidade da sua proteína dos testes para encontrar condições ideais de expressão foram aqueles teste feito pela mini indução deve executar a emoção mais tal então qual que é metodologia metodologia muito muito parecida com a metodologia da menina do sol então você faz o treino para o contém dos colonos a 37 graus sob agitação por 16 horas em grand do que o pé inóculo é

parece que tem um número significativo de bactérias e também clones ali depois você coloca esse trem inóculo no volume maior né daquele comparado com a indução pode ser um volume de um litro e meio litro e meio litro para cima o cultivo as bactérias a 37 graus até atingir o de ideal ideal pro tá induzindo faz abdução do ptg tão indução da expressão da proteína nas condições adequadas né você tem você já estabelecer as condições adequadas então vamos como colocar aqui as condições adequadas para proteína no colo trabalho no laboratório da professora maria isabel é

temperatura de 25 graus indução de 4 horas com um millimolar iptg então antes eu estabeleci todas as condições depois que eu já tem essas coisas estabelecidas eu posso fazer essa lição na escala então eu coloco adiciona proteger já então eu cresci as bactérias a 37 graus depois é um mudo para 25 graus quer saber a expressão da proteína na cor do trabalho oi e depois né e que já eu já tenho realizado todas essas condições ideais de expressão eu faço tem que ser conversão para para obter né o extrato o extrato bacteriano aí depois que

obtêm o extrato bacteriano eu posso eu posso começar na purificação da minha proteína bom então pensando nos métodos de purificação de proteínas eu trouxe aqui alguns metros utilizando colunas cromatográficas e depois eu vou falar um pouquinho sobre uma técnica denominada isolamento de corpúsculos de inclusão que é pra proteínas insolúveis não não dê para purificar a proteínas solúveis com colunas cromatográficas é sim é possível mas também em alternativa a colunas em alternativas que matou gráficas e por serem proteínas insolúveis e requererem agentes de solubilização e geralmente esses agentes sobre a localização serem caros e também é

acaba prejudicando a proteína então é o isolamento de curso de corpúsculos de inclusão ele acaba se tornando preferível essas colunas cromatográficas tá bom então de modo geral as proteínas elas podem ser purificados utilizando diferentes colunas e tem nenhum seu tamanho molecular na sua carga e você tem que ficar muito atento a uti dessa proteína o ponto isoelétrico né também o volume a coluna ela é composta por uma fase móvel e também por uma fase estacionária a fase móvel ea fase que recebe a mostra proteica a faz estacionária é a matriz sólida porosa então é a

resina da coluna e essa resina que permite que tem as interações assim as possíveis interações né que no final vai resultar em amostras de proteínas puras um exemplo que eu trouxe aqui sobre por educação coluna cromatográfica é o exemplo da cromatografia por afinidade pra gente entender a cromatografia por afinidade gente precisa voltar lá na no dna recombinante então existem alguns vetores de expressão que possui uma página que possui afinidade único então existem algumas colunas com a resina composta por michael então quanto a sua proteína é expressa ela carrega juntos de inox de 6 estilos então

além dos próprios aminoácidos que compõem a sua sua proteína ela carrega a mais uma calda disciplina conselhos aminoácidos menina então essa histidina esse vídeo então quando você coloca sua mostra nessa nessa coluna a sua mostra ela vai ficar com você e as e as proteínas daqueles eu sei como é que você não tem extrato proteico mistureba de proteína junto com a sua proteína de empresa então quando você coloca na coluna as proteínas que não possuem esse essa causa histidina que artificialmente elaborada é durante a clonagem elas passam direto elas não vão ter interação com a

sua proteína que tem essa causa decidida vai interagir direto com a coluna e ela vai ficar presa na coluna e aí é a nessas pretas existem alguns buffers de ligação são importantes para que tenha que tenha o momento de interação da coluna e o momento da eleição porque além de ter interação com a coluna que é tem que ter também né porque como que você vai recuperar essa proteína tá ligada essa resina então existem alguns alguns algumas soluções né que confere essas esses processos são os passageiros e m1 a ligação né os pais ambos e

o alisson bom então a outra coluna que eu trouxe aqui como exemplo é a coluna de troca iônica então fazer a purificação utilizando uma coluna e cromatografia de troca iônica ela pode ser tanto na coluna catiônica única ele vai depender muito do ph esse tá utilizando né para soluções e também pegar onde a proteína a relatar organizada e o princípio dessa coluna é separar as proteínas pros proteínas elas movem-se através da coluna em velocidade determinadas por suas cargas finais no ph utilizado bom então tenho com mais não negativa elas movem-se mais rápido e lume mais

cedo então conforme consegue você tem essa informação você sabe mais ou menos pela carga da sua proteína em qual fração de eluição ela vai sair então essa essa técnica é muito importante que se conheça o pedido só proteína para estabelecer um ph ótimo para se trabalhar com essa técnica de purificação lembrando que o período a proteína quando você tem ph na mesma faixa do ppi a carga ficar neutro então você não teria você ter uma boa uma boa purificação com ph muito próximo igual tão importantes da proteína para utilizar essa técnica de purificação então uma

outra técnica de purificação de proteína e no caso essa que eu vou falar agora é uma técnica voltada para poder fazer um proteínas insolúveis é nada como isolamento de corpúsculos de inclusão então que seria esses corpúsculos de inclusão né para a gente entender até que a gente tem que entender o que é esses corpúsculos de inclusão então obtenção de proteínas recombinantes é um resultado da expressão rápida de proteínas pode induzir né a formação desses corpúsculos de inclusão então quando você tem um sistema heterólogo é uma proteína é um perdão uma um organismo produzindo uma proteína

da qual ele não produz normalmente a formação desses desses corpúsculos de inclusão que geralmente eles estão localizados no citosol né dessa dessa bactéria no caso como é que está expressando a proteína então esses corpos cruzeiro aumente contém proteínas heterólogas 19 veladas com propensão a tá ligado só que muitos estudos foram feitos e foi isso que essas corpúsculos de inclusão geralmente possui proteínas como atividade biológica e podem ser utilizados então existe uma técnica alguns protocolos que tenta isolar esses corpúsculos de inclusão através de aspectos né que lembra que eu disse qo tuperti geralmente na fração do

pele de tom é tão compridas essas proteínas insolúveis então esses participação por diferentes tratamentos com diferentes soluções para ir tentando se livrando das proteínas que não não não estão expressas na forma na forma de corpo os inclusão deixando apenas os corpúsculos de inclusão que no caso seria sua proteína de interesse caso ela seja uma proteína insolúvel então e os agregados proteicos né os corpúsculos de inclusão através de inúmeras etapas de me safar lavagem do extrato proteico centrifugação em alta velocidade então são alguns passos aqui eu coloquei um protocolo que é um protocolo que utilizo para

purificar a a proteína que eu trabalho né proteína de interesse do meu projeto de iniciação científica então como vocês podem notar esse protocolo é composto por diversas lavagens com diferentes soluções e com diferentes etapas de centrífuga ções que tenta isolar esses corpúsculo aqui nesse slide pessoal eu trouxe alguns resultados djess obtidos por eletroforese né então são proteínas fracionadas nesses dias obtidos pela técnica de eletroforese dessas situações tanto o isolamento de corpo a fusão que é esse primeiro gel a à esquerda é fotográfica que hoje é o direito então vocês podem observar a fração 1 2

3 4 5 6 que são etapas de lavagem só você pode observar cada bandinha cada risquinho é uma são três proteínas contidas no extrato proteico então você começa a observar que a parte da da coluna 7 no geral usam você tem você tem uma limpeza nesse saco para você só tem a proteína de interesse mesmo vale para colocar fotografia só você ver um extrato proteico sem muito sujo ou seja é com inúmeras proteínas e depois você tem a purificação feita por essas colunas você consegue isolar essas proteínas né e consegue telas e modo purificada então

depois que a gente conclui o processo de purificação da proteína é importante a gente fazer a o processo de detecção essa proteína por meio do acervo antes então para avaliar se o produto purificado corresponde de fato a sua proteína você deve realizar a técnica de um asteroide é uma técnica que reconhece a proteína por meio de anticorpos específicos então você utiliza anticorpos específicos produzidos para conhecer a sua proteína eu vou dar um exemplo no caso da proteína qual trabalho ela tem aquela calda decidindo que eu comentei para que eu comentei com vocês então existe um

anticorpo específico chamado antes que ele detecta essa calda disciplina então quando eu faço quando eu faço um a ser bote para ver se de fato purifiquei a minha proteína se no meio daquele e sabe que eu tenho todo esse inúmeras proteínas eu consegui no final at-st uma delas purificada que eu imagino que seja minha então para ter essa certeza da utilizam anticorpo específico e vai reconhecer essa causa desse dina e por um por um meio de um ano anticorpo record e um anticorpo secundário reconhece-se o anticorpo primário que seria o ante risco e assim eu

tenho certeza de que é a minha proteína é a proteína de interesse a proteína estou estudando que está purificado e assim eu posso seguir com os outros ensaios dependem do objetivo do projeto então aqui essa foto eu trouxe então é e com o nome de m as linhas um dois e três que seriam eletroforese em vela e as linhas 1 linha e-2 vinhos em uma semblante tão a cara de umas irmã tia é exatamente esse o bom e depois pessoal que você realiza né processo de purificação depois que você tem certeza que o produto purificado

realmente é a proteína de interesse no qual você tá trabalhando é importante fazer análise do enovelamento da proteína análise da estrutura para decidir a proteína está purificado então a produção da proteína se utiliza técnicas de o físicas uma das técnicas mais utilizadas flores e vai ter dizer ali a estrutura secundária e terciária da proteína através da emissão de fluorescência então existem algumas proteínas que tem em sua composição que você profanos eles são excitáveis a determinados comprimentos de onda e quando esses triptofanos estão é internamente localizados quer dizer que a proteína ela obteve uma estrutura a

estrutura enovelada e isso é visto por meio da emissão de fluorescência implodir dicroísmo circular que seria o cd é basicamente o mesmo princípio então você cita algumas regiões da proteína essa proteína diferença do turismo para a presidência você vai ter uma noção mas da estrutura quaternária da proteína você já tem uma noção a mais de deve ser foi aberta por conta do sinal que foi retido durante a realização de sabo essa técnica chamada de pro smu circular é importante e é importante saber se a proteína tá indo pelada porque você pode utilizar para alguns outros

fins como uma interação entre proteína proteína que eu tenho na nucleico eu tô tendo caso então proteína dna-protein novinha uma proteína da novela nada a gente sabe que não comprei função então você tem que ter certeza que essa proteína para ir não velada ela tá cumprindo papel biológico para você dar prosseguimento aos objetivos do seu estudo olá pessoal então se encerra aqui eu agradeço a atenção de todos mesmo estando longe de vocês né por conta da pandemia estamos de forma virtual e eu não tô vendo o rosto de vocês mas então isso eu agradeço a

oportunidade também a professora me concedido essa aula né para eu poder dar essa aula para vocês então esse é o nosso grupo do laboratório de quilômetros associado pela professora marisa nogueira cama e outra semana também para vocês saberem de quem é essa voz mas é isso gente muito obrigado e bons estudos