nella scorsa lezione abbiamo visto come è possibile inserire un frammento di DNA di interesse all'interno di una cellula batterica attraverso l'utilizzo di plasmidi ricombinanti abbiamo detto poi che il batterio così ingegnerizzato avrebbe replicato il frammento di DNA di interesse e lo avrebbe dato in eredità alle sue cellule figlie quanto descritto allora è un metodo di amplificazione di una specifica sequenza di DNA che utilizza la trasformazione in cellule batteriche di un plasmide ricombinante contenente la specifica sequenza di DNA Vediamo adesso un metodo per amplificare una specifica sequenza di DNA senza l'utilizzo di cellule parliamo di Reazione
a catena della polimerasi o PCR l'area rezione a catena della polimerasi o PCR dall'inglese polymerase Chain Reaction è una tecnica comunemente usata in laboratorio per amplificare una specifica regione di Dna di interesse solo per non dare per scontato il significato del verbo amplificare chiariamo che amplificare un frammento di DNA significa crearne molte o moltissime copie a partire da campioni di partenza che possono essere anche molto esigui la PCR ci permette di produrre in laboratorio milioni o miliardi di copie di DNA a partire anche da piccole tracce solo per farvi un esempio di applicabilità di questa
tecnica la PCR può essere molto utile in ambito Forense perché permette di ottenere una buona quantità di Dna da analizzare a partire dalle a volte piccolissime tracce di DNA raccolte sulle scene dei crimini prima di andare avanti Però ritengo importante sottolineare il limite di questa tecnica dalle 1le applicazioni la PCR è estremamente sensibile e questo comporta che anche una minima quantità di Dna contaminante presente nel campione del Dna di interesse può potenzialmente essere amplificata a sua volta e portare ad una errata conclusione questo solo per dire che repertare una scena del crimine è tutt'altro che
semplice i ricercatori però consapevoli di questo limite della PCR migliorano costantemente i metodi per eliminare questo e altri problemi tecnici ma veniamo agli ingredienti principali necessari allo svolgimento della PCR Prima di tutto mi sembra anche scontato serve un campione della sequenza di DNA ad amplificare è necessaria poi una speciale DNA polimerasi chiamata TAC polimerasi che insieme ai vari Cattori necessari alla sua attività enzimatica svolga la reazione di amplificazione servono anche De Sossi ribonucleotidi che la DNA polimerasi possa usare come mattoncini di costruzione dei nuovi filamenti di DNA e c'è bisogno infine di primer disegnati ad
hoc perché fiancheggianti proprio il frammento di Dna di interesse e che facciano Quindi da punti di partenza della reazione di amplificazione della Tac polimerasi preparata la miscela di reazione La provetta viene inserita in un termociclatore uno strumento di laboratorio che rende possibile gestire la temperatura e le tempistiche degli step della PCR il termociclatore Infatti è in grado di riscaldare e raffreddare automaticamente senza input esterni cessivi all'avviamento iniziale della reazione gli step della PCR ripetuti in serie per molti cicli di solito dai 25 a 35 cicli sono tre denaturazione appagamento ed estensione nello step di denaturazione
La provetta con la miscela di reazione viene portata dal termociclatore ad una temperatura intorno ai 95° C tale da separare i due filamenti del Dna di interesse si ottiene così DNA singolo filamento che fa da stampo per l'amplificazione nello step di appaiamento la temperatura nel termociclatore scende intorno ai 50-60 temperatura che viene di volta in volta calcolata in base ai primer utilizati nella specifica reazione di PCR in corso Lo scopo di questo Step è far appaiare i primer con il DNA a singolo filamento ottenuto nello step precedente nello step di estensione infine la temperatura risale
intorno ai 72° allo scopo di permettere alla TAC polimerasi di estendere i primer aggiungendo nucleotidi complementari al DNA stampo e sintetizzare così nuovi filamenti di DNA proprio come avviene nella replicazione del DNA nelle cellule all'ora al termine del ciclo si ottengono molecole di DNA A doppio filamento composte da un filamento originario e da un filamento complementare ad esso appena sintetizzato se non ricordate il concetto di replicazione semiconservativa fate un salto alla lezione 51 ora Considerando che negli step successivi al primo l'estensione avviene anche utilizzando come stampo i filamenti sintetizzati Denovo la ripetizione di tutto il
processo per 25-35 cicli permette di ottenere miliardi di copie della molecola di DNA originale in poche ore sembra tutto semplice e concettualmente lo è praticamente un po' meno prima di tutto la DNA polimerasi usata nella PCR è come detto una DNA polimerasi speciale questo perché deve resistere a tutti i cambiamenti di temperatura appena descritti senza Den naturari la DNA polimerasi utilizzata è proprio la TAC polimerasi perché questa è una DNA polimerasi termostabile che deriva il suo nome dal batterio da cui è stata isolata termus aquaticus termus aquaticus è un batterio che si è adattato a
vivere nelle sorgenti termali calde e questo comporta che la sua DNA polimerasi deve essere molto stabile al calore la DNA polimerasi di termus aquaticus o TAC polimerasi ha la sua massima attività a temperature intorno ai 70° che non a caso sono proprio quelle scelte per lo step di estensione della PCR notare che temperature così elevate renderebbero non funzionali sia la DNA polimerasi umana sia quella di aschieri agoli ad esempio chiudiamo puntualizzando che anche la scelta dei primer ad hoc per una specifica reazione PCR è complessa questi brevi frammenti di DNA a filamento singolo lunghi solitamente
intorno ai 20 nucleotidi devono essere disegnati a puntino Per far sì che si appaiano correttamente per complementarietà Di Basi proprio al DNA fiancheggiate la regione che deve essere copiata e la complessità di questo punto è facilmente immaginabile per questa lezione è tutto restate connessi con me con la biologia per la prossima e per tutte quelle che verranno in futuro se vi sono state di aiuto nel frattempo vi chiedo di sostenere il mio lavoro mettendo mi piace a questo video di commentare lasciando un feedback ma soprattutto se non lo avete ancora fatto di iscrivervi gratuitamente al
canale vi ringrazio per l'attenzione Ciao e buono studio a tutti l
