in biologia molecolare clonare significa generare una copia identica di un intero organismo come fu il caso della pecora dolly oppure una copia identica di un piccolo frammento di dna come un gene nel primo caso si parla di clonazione mentre nel secondo di clonaggio molecolare questa tecnica è utile quando bisogna produrre molte copie dello stesso gene che siano in grado di innescare la sintesi proteica prendiamo per esempio il gene dell'insulina l'insulina è un ormone molto importante per il metabolismo degli zuccheri e alcuni pazienti diabetici hanno bisogno che gli venga somministrata dall'esterno se in passato per ottenere
l'insulina si ricorreva quella di suini e bovini oggi il clonaggio molecolare permette di produrre insulina umana in grandi quantità innanzitutto bisognerà isolare il gene dell'insulina dal resto del genoma e farne molte copie per farlo sono utili i batteri geneticamente modificati che duplicando se torneranno il genere l'insulina in essi inserito questi batteri si dicono geneticamente modificati o trasformati perché al loro interno è stato inserito del dna estraneo in questo caso un plasmide cioè un piccolo genoma circolare che contiene il gene dell'insulina un plasmide ricombinante è formato da dna extra cromosomico batterico nel quale è stata inserita
una sequenza di dna di un altro organismo in questo caso inseriamo il gene dell'insulina umana il plasmide utilizzato in genere formato da dna circolare a doppio filamento a tre caratteristiche importanti la prima è che contiene una sequenza ori che è un origine di replicazione e consente quindi al plasmide di replicarsi in maniera autonoma la seconda è che presenta un gene marcatore che di solito conferisce resistenza agli antibiotici il marcatore è utile per riconoscere i batteri che hanno incorporato il plasmide ricombinante cioè i batteri trasformati in questo caso il gene marcatore conferisce resistenza all'anpi ciellina la
terza caratteristica del plasmide è la presenza di una regione di dna chiamata poli l'inter che contiene sequenze riconosciute solo da specifici enzimi chiamati enzimi di restrizione che tagliano il dna doppio filamento alcuni tipi di enzimi di restrizione producono un taglio sfalsato nel doppio filamento si creano così dell'estremità dette appiccicose ospiti end che sono tra loro complementari lo stesso enzima di restrizione vengono tagliati il plasmide e igiene dell'insulina in generale qualunque frammento di dna estraneo da inserire in questo modo il plasmide il gene dell'insulina anno allo stesso tipo di estremità appiccicose e possono quindi appaiarsi tra
loro dopo l'appagamento l'enzima dna liga si creerà i legami mancanti si è ottenuto così il plasmide ricombinante alla fine si ottengono diversi tipi di plasmidi alcuni saranno ricombinanti cioè comprenderanno il gene dell'insulina mentre altri si richiuderanno senza includere il gene dell'insulina i plasmidi ricombinanti sono quelle che ci servono per la trasformazione dei batteri per dare inizio alla trasformazione batterica prendiamo 200 microlitri di una sospensione di escherichia coli conservati a meno 80 gradi centigradi e trattati per rendere le loro pareti e membrane permeabili ai plasmidi cari sospendiamo quindi le cellule con qualche colpetto sulla provetta e
aggiungiamo 10 microlitri della riesch e la d league azione cioè il prodotto della reazione che ha permesso di salvare il gene dell'insulina all'interno del plasmide rimettiamo la in ghiaccio per 10 minuti e subito dopo trasferiamo la in un bagno a 37 gradi centigradi per 5 minuti per la fase di shock termico necessaria a far penetrare il dna all'interno dei batteri riportiamo le cellule in ghiaccio e dopo un minuto aggiungiamo 800 microlitri di terreno sterile senza antibiotico riponiamo ora la provetta in un termostato a 37 gradi centigradi per 15 minuti questa breve incubazione da ai batteri
trasformati il tempo di esprimere i geni per la resistenza l'umpc lina contenuto nel plasmide nel frattempo prendiamo una piastra petri con un terreno di coltura contenente ampicillina aggiungiamo 60 microlitri di una miscela di sostanze che permetteranno alle colonie di colorarsi in modo diverso a seconda che contengano o meno il plasmide ricombinante nel terreno appena preparato potranno crescere soli batteri che hanno incorporato il plasmide proprio perché il plasmide a un gene marcatore per la resistenza all'antibiotico però con il solo controllo dell'antibiotico non avremo la certezza che i batteri si sono trasformati nel modo giusto infatti in
questo terreno potrebbero crescere anche i batteri che hanno incorporato il plasmide vuoto cioè privo del gene dell'insulina per distinguere i batteri trasformati correttamente cioè quelli che hanno incorporato il plasmide con il gene dell'insulina ci serve un altro tipo di controllo abbiamo infatti aggiunto alle colonie una miscela che renderà blu quelle con il plasmide vuoto e bianche quelle con il plasmide ricombinante la colorazione dipende dalla presenza o meno di un enzima plasmi dico che non viene sintetizzato quando il plasmide incorpora il gene dell'insulina trascorsi i 15 minuti di incubazione recuperiamo la provetta dal termostato e piastre
amo i batteri aiutandoci con la spatola sterile distribuiamo i batteri in modo uniforme mettiamola in incubatore a 37 gradi centigradi penseranno indisturbati per tutta la notte in condizioni ottimali un batterio come con gli usati si duplica una volta ogni 20 minuti quindi dopo 16 ore circa ogni batterio avrà generato milioni di altri batteri dall origine a una colonia visibile a occhio nudo nella piastra sono visibili due tipi di colonie colonie bianche contenenti il plasmide ricombinante e colonie blu non ricombinanti cioè contenente il plasmide privo del gene dell'insulina ora che si distinguono i batteri ricombinanti da
quelli non ricombinanti si preleveranno solo le colonne bianche da cui verrà estratto il plasmide che ha incorporato il gene di interesse possiamo produrre molte copie e quindi clonare anche altri geni o frammenti di dna per farlo dobbiamo compiere gli stessi passaggi di questo esperimento innanzitutto abbiamo inserito il gene di interesse in un plasmide dando origine così a un plasmide ricombinante poi abbiamo effettuato la trasformazione dei batteri inserendo al loro interno il plasmide ricombinante e alla fine dopo le necessarie verifiche abbiamo fatto crescere in modo intensivo i batteri trasformati che possono produrre molte copie del gene
clonato se questo viene attivato o produrre grandi quantità di insulina
