e olha só eu tenho aqui um fragmento da biblioteca e eu vou repetir isso que eu vou falar para vocês agora várias vezes porque isso tem que ficar muito claro eu não vou trabalhar com fragmente-se é o certo e o fragmento é o dna genômico por exemplo então eu tenho nenhum pões de fragmentos gerados ao longo do meu processo de construção de biblioteca eu tô mostrando uma aqui para ficar faz entender de uma maneira didática tá mas imagine que o que eu vou mostrar a partir de agora tá acontecendo com todos os fragmentos todos o
mesmo então tem um fragmento aqui que eu não sei assim conhecido meu que eu quero nos colocaram descobrir mas você as extremidades porque eu coloquei adaptador eu preciso amplificar esse produto por que que eu preciso amplificar eu disse lá para vocês que assiste fosse colocar esse aqui esse fragmento sozinho lá no processo de sequenciamento ele ia gerar um sinal independente da tecnologia no caso da ilumina é um sinal fluorescente e a gerar um sinal fluorescentes algum sinal foram senti muito fraquinho eu não ia conseguir detectar essa variação de fluorescência essa geração de fluorescência e não
ia ter seu conhecimento então que eu tenho que fazer tirar várias cópias de si mesmo fragmento para no final das contas gerar um sinal fluorescente forte em a máquina detectar então que eu vou fazer aqui gente nada mais é do que pcf é isso que eu tô fazendo aqui não é purificação para ser necessário para amplificar eu tô fazendo uma amplificação é fácil para ele ficar isso daqui por quê que é fácil porque eu conheço as extremidades tão grande são iguais para todo mundo só que vocês estão vendo que meu pc está cortado aqui né
porque que tá cortada porque não é uma pessoa reconvencional no caso da ilumina na verdade um caso das duas tecnologias que a gente vai fazer o seguinte é fazer a pcr desse fragmento eu tô mostrando de um fragmento mas eu não quero que esse fragmento fica em solução eu não quero que as cópias esse fragmento ao longo do ciclo da pessoa que eles vão ficando em solução dispersa eu quero que todos eles fiquem juntos eu preciso que todos eles fiquem juntos para quando lá se for gerar um sinal fluorescente eu consigo gerar um sinal bem
forte então eu vou manter eles todos juntos aí sim eu vou gerar um sinal florescente lembrando de novo eu tô mostrando para um fragmento mas a gente vai fazer essa pessoa é diferente olha aqui e manter todos os fragmentos juntos e todos os fragmentos a minha biblioteca todos os fragmentos por direito lá no meu ao longo da minha criação de biblioteca eu vou fazer esse processo então cada fragment vai ser amplificado e o produto essa amplificação vai ficar tudo juntinho no caso da inúmeras como é feita essa pcr então como é feita essa amplificação a
gente vai pegar o produto lá da minha construção de biblioteca e jogar nessa superfície aqui ó eu tô mostrando dessa superfície assim funciona nessa superfície nós temos oligonucleotídeos associados ao longo de toda ela ao longo de todos os perfis que óleo no teste de esse daqui gente primer isso aqui é primer plus e para quem aos adaptadores tão a gente vai fazer pcr utilizando esses primers que estão presos nessa superfície um desses planos é complementar a uns adaptador esse o outro primo é complementar ao outro adaptador então vou jogar um fragmento aqui para gente ver
a deixar mais claro que essas superfícies para ficar bem evidente o que acontece lá na reação a gente pegou aquele produto da nossa construção de biblioteca que ainda não tão amplificada de só tá fragmentado e com adaptador até agora e vai colocar para hibridizar esse fragmento aqui nessa superfície hora que ele encontra a complementaridade com primer tá lotado de primeiro ali pra ele vai se ligar que ele vai se ligar ali e como isso daqui é um primer tem que colocar uma dna polimerase nucleotídeo livro e fazer os ciclos da pcr ou proporcionar as condições
para que a dna polimerase faço a extenção exatamente isso que vai acontecer a gente vai gerar um fragmento com e aí ele fez uma cópia fiz uma cópia só que que tem diferente aqui vocês repararam que esse primer tá preso né esses prêmios quem tá utilizando aqui eles estão presos nessa superfícies então o produto dessa pcr o produto dessa pcr está preso na minha lâmina que tá preso nessa superfície e essa essa primeira mulher que a gente usou veio lá da construção da biblioteca tá solta e solução eu tiro ele ele ali da minha reação
é e o produto desse primeiro ciclo de pensar em ficou preso aqui se eu fizer mais um ciclo de pcr agora utilizando esse produto aqui como tem peixe e vai acontecer tem primer para essa extremidade aqui tem e o primer está aqui está aqui do seu repetir agora fazer mais um ciclo dessa pessoa é de frentona esse fragmento ele se dobra né que se dobra não estão dobrado aqui dentro não fica para cima como eu tô mostrando né mas ele tá aqui ele se liga no outro primer próximo a ele que também está preso na
superfície e também está preso a superfícies e aí eu faço mais um ciclo de extensão formando um novo fragmento se eu de naturais e os dois fragmentos aqui essa dupla fita que acontece só que tem agora dois fragmentos presos na minha lâmina e na minha superfície se eu fizer mais um ciclo de pcr tem prima para esse cara aqui tem tá aqui do lado e tem primer para esse tem tá aqui do lado vamos fazer mais um ciclo de pcr e como é que ela vai se encurva vai sociale com os primers das que estão
presos na superfície a gente faz a extensão e que aconteceu agora a gente tem quatro cópias do meu alvo nas quartas estão presas e a gente repete-se o processo algumas vezes e tal maneira que a gente forma isso daqui que que esse daqui ser chamado de cluster é um que você lembrou de pc aqui tá tudo preso ali nessa nessa superfície e agora esse clã será que a gente tem cópias suficientes e o mesmo alvo aqui de tal maneira que quando a gente for gerar fluorescência a fluorescência seja forte o suficiente para o equipamento detectar
e mais uma vez não se esqueçam eu mostrei um fragmento mas essa superfície é gigantesca e tem esse processo acontecendo com vários fragmentos o meu teka que eu gerei lá nos passos anteriores então é assim que funciona as nós iremos um cluster aqui de um fragmento são várias cópias de um mesmo fragmento aqui várias cópias de um outro alimento aqui várias cópias de outros fragmentos aqui de um outro e aí esse processo aqui vai gerar fluorescência lá na frente e a gente consegue detectar no longo do processo de sequenciamento e e aí e aí
