e a cinco linha, formando a ligação fósforo de estero novamente. Aí a gente tem aqui a nossa inserção da sequência do vetor. Então temos aqui uma imagem que vai que vai mostrar, a gente vai encontrar o nosso gene.
De diversas formas é possível obter esse gene exógeno e a gente vai colocar nesse plasmo. Perceba que essas extremidades do plasmídio, elas não são retas porque depende muito da enzima de restrição que é usada. Então a gente usa uma enzima de restrição específica para que se encaixe ao nosso nosso gene.
Então, então a gente usando tais técnicas é possível inserir essa sequência de interesse, tá? H aqui, como a gente vai abordar a expressão da insulina humana no nossa atividade H5P, eh, eu trouxe o exemplo dela, tá? O gene correspondente a ela, ele é amplamente conhecido, tá?
e a sua sequência de domínio público. Então você pode acessar essa sequência de nucleotídios em em bancos de dados de genes, tá? e encomendar para que uma empresa que sintetize quimicamente essas eh esses plasmídios possa fazer esse plasmídio já com o próprio gene, tá?
Ainda assim é possível você extrair essa sequência de uma amostra humana, por exemplo, de eh células pancreáticas humanas. Eh, o problema é como temos um as células pancreáticas como células de de um de um organismo eucariótico, eh os genes eles ter eles eles vão ter introns e exons. E isso não, a gente não deveria colocar esses introns e exons no nosso plasmídeo, porque vamos usar microorganismos que não são eucarióticos muitas vezes para expressar essa essa proteína recombinante.
Então, o que a gente usa é a nossa técnica de RTPCR, tá? Então, o que que seria RTPCR? RTPCR em inglês seria Reverse Transcription polymer reaction, que em português é a reação em cadeia da polimerase, a PCR, com a transcriptase reversa, tá?
Como os genes de eucariotos têm introns e exons, a gente vai usar o RNA mensageiro já maduro, que não tem os introns. Então, para isso, a gente vai precisar fazer a transcripta, transcrição reversa, que seria o reverso de fazer a transcrição. Então, a gente vai fazer com que o RNA se torne DNA novamente, usando a enzima transcriptase reversa, tá?
A partir disso, a gente vai obter uma amostra de CNA, que é o DNA complementar. Ou seja, esse vai ser um DNA que, por mais que veio de eucariotos, só vai ter introns, ou seja, não vai gerar nenhum problema na hora da expressão da proteína em um organismo que não é eucarioto, tá? E pra gente obter uma quantidade significante desse significativa desse desse gene, desse DNA, a gente vai usar a amplificação por PCR, tá?
Então, a gente vai falar um pouquinho agora da PCR, quais são as etapas da PCR e o que a PCR faz de fato, tá? Então essa é a reação em cadeia da polimerase. Seria DNA polimerase, tá?
Então aqui a gente tem uma replicação de um fragmento de DNA em milhares de muitas cópias, né? O que acontece? A gente faz essa PCR através da desnaturação dessa fita de DNA dupla, tá?
A 95º aqui tá 96. mais ou menos faixa de de temperatura, tá? Essa desnaturação basicamente uma quebra das ligações de hidrogênio entre as bases de nitrogênio.
A partir disso, a gente vai ter duas fitas simples e aí a gente vai ter a fase de anelamento de primer, que é a 55º já. Por que a gente precisa de um primer, tá? O prime ele vai ser uma pequena sequência de nucleotídios que vai inserir um grupo no três linha, na na extremidade três linha, um grupo eh hidroxila livre, tá?
Que é para que a DNA polimerase que a gente vai usar tenha acesso a esse esse fragmento de DNA. Sem esse grupo três três linha OH livre, não é possível a DNA polimerase ser inserida. E como a gente tem um uma fita de DNA que não está quebrada, não tem não tem ligações fosf de ester eh quebradas, a gente não vai ter eh grupos três linha livres, a não ser que a gente coloque primers, tá?
Então a gente vai anelar os primers a 55ºC e a 72º C acontece a extensão, que é basicamente onde a no momento em que a DNA polimerase vai conseguir se ligar ao primer e vai conseguir colocar nucleotídio por nucleotídio ali e fazer com que a gente multiplique por dois o nosso nosso fragmento inicial de CDNA. Aqui, como a gente vai fazer isso a 72º, a gente precisa de uma polimerase que seja resistente a essa temperatura, porque além de ser resistente a essa temperatura, a gente faz a PCR em ciclos. Então, a partir do momento em que essa DNA polimerase foi inserida, ela vai passar por todos os ciclos.
Então, ela também vai passar pelo ciclo de desnaturação, que é a 95, 96º. Então, a gente usa ataque polimerase, que é uma enzima que vem de bactérias eh tromresistentes e tramofílicas. E essa essa proteína, essa DNA polimerase vai aguentar altas temperaturas.
Aí, perceba aqui que a gente vai ter uma repetição. Essas máquinas de UPCR, elas vão fazer eh repetições até 35 vezes. Então, a gente vai ter uma grande quantidade de insertos daquele CDNA que a gente extraiu de uma amostra humana, por exemplo.
E aí entra de fato o momento em que a gente vai produzir essas proteínas recombinantes, tá? Primeiro agora que temos um vetor que tem o inserto com o gene que vai, e a gente tem certeza de que vai expressar a proteína que a gente deseja, a gente pode fazer a transformação, tá? A transformação é introdução do vetor em um microorganismo, geralmente um que não seja capaz de causar doenças em humanos, porque nesse processo de produção de proteínas recombinantes não há necessidade de usar eh bactérias que causam doenças em humanos, até porque vai aumentar muito a biossegurança eh do cientista, da pessoa que vai manipular aquilo.
Eh, a gente vai usar a maquinaria deste organismo para expressar a nossa sequência desejada, tá? Que é no caso a nossa proteína recombinante. Então aqui a gente geralmente vai usar bactérias competentes, tá?
Alíquotas de bactérias competentes. Para isso se faz um tratamento, tá? com eh cloreto de cálcio, que vai neutralizar as cargas da membrana e vai permitir a penetração do DNA plasmidial, que é negativo, tá?
DNA é negativo, então tá? Então, a gente pode ter diversos métodos de transformação. A gente pode ter métodos de transformação por choque térmico, que é o mais clássico, mais usado, que a gente dá um choque térmico numa alíquota que vai ter tanto o nosso plasmídio quanto a nossa bactéria, nossa alíquota de bactéria competente.
E esse calor e esse choque térmico entre calor e frio vai criar poros na membrana por causa da da mudança na organização da membrana. A gente também tem a eletroporação, que também vai formar poros na membrana, mas através de pulsos elétricos que também vão mudar a organização da membrana, tá? E aí a gente vai ter a transformação química, que é alteração química da membrana.
A gente também pode ter conjugação bacteriana, que já não é tão eficiente e depende muito do caso, tá? Que seria a transferência natural de DNA entre bactérias. A partir do momento em que a gente faz essa transformação e a gente coloca o nosso plasmídio dentro dessa alíquota de bactérias competentes, a gente pode fazer com que elas cresçam num meio de cultura.
Esse meio de cultura aqui que eu tô mostrando nessa imagem que é de autoria própria. Esse meio de cultura ele tem eh LB que seria o Lure Brof, um caldo cheio de nutrientes para que as bactérias cresçam. E também tem a GAR, que é um agente gilificante.
Então isso é quase um gel, tá? E essa alíquota de bactérias transformadas cresce de um dia para outro numa incubadora. E nesse momento há uma seleção de células transformadas.
Por que uma seleção de de células transformadas? Porque nesse meio, quando fabricamos esse meio, colocamos canomicina. Então, quando se coloca canamicina, a gente vai fazer uma uma seleção de células que apenas foram transformadas com plasmídio.
Porque lembre no começo do vídeo quando eu mostro a construção do plasmio PET 28A, que é o que eu usei aqui para transformar as minhas bactérias, ele tem um gene de resistência que vai expressar uma enzima que vai conferir a essas bactérias uma resistência canamicina. Então, todas as bactérias que sobreviveram, ou seja, que formaram essas colônias que a gente consegue ver aqui, elas obrigatoriamente têm o plasmídio, senão elas morreriam por conta da ação do antibiótico, da canamicina, tá?
