Olá, pessoal. Eu sou a Lívia e tô aqui para falar um pouquinho sobre expressão e purificação de proteínas recombinantes. Mas primeiro a gente precisa entender o que são essas proteínas recombinantes.
E para entender o que são essas proteínas recombinantes, a gente precisa entender um pouco das bases da tecnologia do DNA recombinante. Na tecnologia do DNA recombinante, o oculagem molecular, ela consiste em unir um fragmento de DNA de interesse, que é um inserto, a um vetor, que é uma molécula transportadora. Então, vamos lá.
O nosso fragmento de DNA de interesse é um um fragmento de DNA que não pertence à aquele vetor ou não pertence ao organismo em que a gente vai inserir ele. Então a gente vai fazer uma recombinação disso em um vetor. Esse vetor também é uma molécula de DNA que vai ter a capacidade de transportar esse DNA.
Esse DNA recombinante é então introduzido em uma célula hospedeira, onde o vetor se replica, produzindo inúmeras cópias idênticas do inserto. Então, vamos imaginar que a gente vai colocar esse vetor dentro de um microorganismo e conforme esse microorganismo se multiplica, esse vetor também vai se multiplicar, tá? Então, eu coloquei alguns eh exemplos aqui de vetores que podem ser plasmídeos, bacteriófagos, que são vírus que atacam bactérias e vírus.
Os plasmídeos são moléculas de DNA circulares, bem simples. Eh, os bacteriófagos, eh, são esses vírus que t a capacidade de de introduzirem as suas as suas informações genéticas em bactérias. E os vírus eles podem ser tanto vírus de DNA como de RNA.
H, as células hospedeiras, elas são bactérias, podem ser leveduras, células de mamíferos e outros tipos de células. Eh, aqui no caso da nossa aplicação, a gente vai usar bactérias que não causam doenças em humanos. A função prática é introduzir informação genética exógena em algum tanto eh com a com a necessidade de de introduzir essa informação em algum tipo de célula para entender essa introdução, como o que muda naquela célula.
Eh, como também para, por exemplo, expressar proteínas recombinantes, que é o nosso objetivo aqui. A função social é o desenvolvimento científico, produção de fármacos, produção de vacinas e por aí vai. Então, os vetores que a gente vai abordar aqui são os plasmídios, tá?
Os plasmídeos podem ocorrer naturalmente em alguns organismos, mas também podem ser sintetizados quimicamente. O exemplo que eu usei aqui é o exemplo que a gente vai ver durante esse curso, que é o plasmídio PET 28A. Eh, esse plasmídia ele vai ter diversas sequências com funções necessárias.
Tá? Então ele vai ter uma origem de replicação, ele vai ter um gene de resistência a canamicina. Esse can r significa que eh esse gene vai expressar uma enzima que consiste em dar resistência à célula hospedeira à canamicina, que é um antibiótico, tá?
Aqui a gente tem o sítio de clonagem múltipla, que é onde se insere o inserto de de DNA exógeno. A gente tem uma tag, pra frente vocês vão entender o que é uma tag, que no caso é uma uma seis seis vezes estidina, que é uma calda de estidina que é é expressa em uma das caudas da nossa proteína recombinante. Eh, a gente tem um promotor da sequência recombinado, o T7 promotor.
A gente vai ter um promotor do geni. A gente vai ter o gene lac. Vocês vão entender um pouco mais da necessidade.
E a gente também tem um terminador T7 e em contraposição ao promotor. Então vamos falar um pouco das tags, tá? As tags são sequências pequenas de DNA que codificam peptídios.
Peptíde são pequenas moléculas de aminoácidos incorporados nas extremidades do gene alvo que codifica a proteína, que no caso no nosso caso, de proteínas recombinantes. Assim, a proteína recombinante é expressa com o seu respectivo tag, tá? Coloquei alguns exemplos de tags aqui e as suas funções.
A gente tem o GFP, que é o Green Florescence Protein, que é uma proteína que vai que vai conferir e fluorescência verde a essas proteínas. Muitas vezes é importante para possibilitar a detecção se a proteína realmente entrou no meio celular, em muitas análises celulares, em diferentes experimentos, é muito usado esse tag. A gente tem o seis vezes estidina, que é o tag que a gente vai explorar nessa aula, que é uma cauda com seis estidinas, um pequeno peptíde de seis estidinas, que vai ter afinidade por resinas de níquel e cobalto, tá?
Então essas estidinas elas vão se ligar a esses metais, tá? Isso vai possibilitar uma purificação mais eficiente e mais específica. Eh, a gente também tem o MBP, que é uma tos binding protein, que é uma proteína que tem afinidade por resinas de amilose, que também tem uma uma função muito parecida com a caludda de estidina.
A nossa cauda deina, ela vai ser expressa na caluda n terminal da nossa proteína de interesse aqui. E aqui entram as enzimas de restrição, também chamadas de endonucleases de restrição, são enzimas capazes de catalisar reações de clivagem de ligações fosfodiéster. Então, o que são ligações fosfodiéster?
Essas ligações fosfodiéster são as ligações que ligam uma base nitrogenada com a outra aqui. Não, não pareadas, porque esse pareamento entre G e C é feito é acontece por ligações de hidrogênio. Mas entre esses pares, a gente vai ter ligações fósfodiestra que vão é formar cada fita de DNA, tá?
Essas enzimas e elas são capazes de clivar essas ligações, tá? Eh, elas são retiradas de determinadas espécies e tem sítios de clivagem com reconhecimento específico, tá? Como é possível ver na imagem, assim, elas auxiliam a abertura de vetores para a inserção das sequências desejadas.
Então, esses sítios de clonagem múltipla, eles vão ter diversas sequências que são reconhecidas por essas enzimas de restrição. Então, a gente tem aqui a Ban Hi, a ECORI, enfim, todas essas daqui que tem origem em bactérias, outros microrganismos. Eh, e elas vão eh reconhecer essas sequências de nucleotídios específicas e vão clivar onde tá a setinha, tá?
Clivou aqui e clivou aqui. Elas vão clivar cada fita. Às vezes elas vão clivar no mesmo lugar, mas às vezes elas vão clivar em lugares diferentes, tá?
E aqui o nosso sítio de clonagem múltipla. Eu coloquei um exemplo aqui mostrando mais das sequências reconhecidas. Então você pode perceber aqui que a gente vai ter diversas diversas diversas vão ser reconhecidas por todas essas enzimas aqui.
Então é possível escolher uma enzima que seja adequada para clivar esse vetor. Então abre-se esse vetor que é circular, esse plasmídio que é circular fechado. E abre-se um espaço para se inserir um fragmento de DNA exógenos, tá?
E aqui entram as DNA gases, que serão as enzimas que vão catalisar a ligação entre os trechos de DNA com o nosso vetor. Então, eh, a as serão as enzimas que vão possibilitar ligarmos aqueles insertos no nosso vetor, tá? A DNAl gás, ela vai catalisar a liga a formação da ligação fosfodié novamente, tá?
Eu quero que vocês eh percebam aqui que a gente vai ter as extremidades cinco linha e três linhas, tanto nos fragmentos isógenos no nosso próprio vetor aqui. E eu queria falar um pouco sobre o mecanismo de como a DNA ligase vai ligar os os trechos isógenos no vetor. Então essa enzima vai adenilar, né, com a ligaz MP, vai adenilar um grupo fosfato de uma extremidade cinco linha, tá?
E a gente vai ter uma extremidade três linha com grupo hidroxila livre. Então a gente esse esse grupo hidroxila livre vai poder eh fazer um ataque nucleofílico nesse grupo fosfato. a gente vai ter a liberação do MP e a gente vai ter a formação da ligação entre essa extremidade três linha e a cinco linha, formando a ligação fosforo de estero novamente.
Что?
