olá pessoal eu sou professora larissa e essa é a continuação da nossa aula de agentes marcados nesta aula nós vamos ver e mundo ensaios enzimáticos elisa elisa é o ensaio mais comumente empregado nos laboratórios e baseia-se na imobilização de um dos componentes antígeno como na imagem ou anticorpos em fase sólida e na utilização de um conjugado e também pode ser um antígeno ou uma imunoglobulina ligado a uma enzima com a preservação da atividade enzimática e imunológica como substratos forma por um produto colorido a alteração da cor é monitorada visivelmente ou por meio de espectrofotômetro que
determina a relação entre a intensidade da cor ea quantidade de que está sendo analisada na amostra então essa em cima ela reage com substrato formando a cor que será lida pelo o teste é empregado para detectar antígenos ou anticorpos em um grande número de sistemas sua eficiência depende da padronização adequada de cada uma das etapas e reagentes como concentração ideal de cada um dos componentes tempo de incubação concentração iônica proteica ou ph do meio a simples modificação de um lote de sal utilizado em algum dos diluentes pode requerer a revalidação de todas as etapas do
ensaio para garantir a reprodutibilidade do teste uma ensaio apresenta elevada sensibilidade especificidade possibilidade de adaptação a diferentes graus de automação rapidez e custo baixo e objetividade na leitura a fase sólida nos testes imunoenzimáticos pode ser constituídas por partículas de agarose poliacrilamida dextrana poliestireno e membrana de nitrocelulose que são comumente utilizadas em um lote além disso e pode ser microplacas partículas tiras micro partículas magnetizadas e pode-se utilizar soluções ligantes como íons ph alcalino componentes protegidos por propriedade industrial também estão envolvidos amostra preferencialmente soroplast uma deve ser processada na diluição em que uma pequena variação resulte em
grande aumento da densidade óptica amostra ideal ela deve ser límpida sem hemólise e não lhe térmica conservada por até sete dias entre 2 a 8 graus celsius ou congelada a menos 20 graus celsius desde que evitamos o processo de congelamento e descongelamento frequente o bloqueio é feito após a absorção das moléculas né antígeno a imunoglobulina faz história é necessário bloquear os sítios reativos remanescentes na fase sólida usando uma proteína bloqueadora que não tem relação com o sistema antígeno olá tudo são muito utilizadas soluções de leite desnatado caseina gelatina ou mina bovina em alguns ensaios utiliza-se
anticorpos monoclonais o diluente da amostra deve conter componentes que reduzam a absorção e inespecífica de componentes da amostra suporte sólido os componentes comumente empregados santo e 20 detergente não iônico e proteínas como leite desnatado gelatina albumina bovina e caseína ou seja proteínas que foram usadas no bloqueio mas em menor concentração a solução de laje lavagem utiliza-se soluções iônicas com ph entre 6,0 a 7,5 contendo pequena concentração de detergente não iônico solução salina tamponada em fosfato ph 7,2 né o famoso pbs também pode ser utilizado os sais de fosfato ficam insolúveis abaixo a temperatura e cristalizam
na solução mantidas sob refrigeração por isso o pré-aquecimento da solução de lavagem até 22 a 25 graus celsius é recomendado geralmente empregado a repetição do processo de lavagem os três a cinco vezes bem como um tempo de molho e cerca de 30 a 60 segundos entre as lavagens especialmente após a incubação conjugar os conjugados podem ser definidos como moléculas de antígeno-anticorpos ligados covalentemente a enzima de modo a conservar as duas funções das duas moléculas conjugadas tanto atividade enzimática da enzima quanto a antigenicidade do antígeno ou especificidade do anticorpo contudo é preciso considerar que a definição
de conjugado é mais amplo duas moléculas covalentemente ligados e que preservam suas funções originais como demonstrado na imagem que eu tenho um anticorpo em cima formando então conjugar proteínas as podem ser utilizadas conjugadas com peroxidase a proteína a ela é derivada de parede bacteriana staphylococcus aures e apresenta elevada afinidade por regiões fcc das imunoglobulinas do tipo e gg assim o conjugado irá se ligar aí gegê com a atividade de peroxidase para formar um produto colorimétrico a partir do substrato cromogênico escreve todd afitina peroxidases também é muito utilizada a ester trovit ainda tem afinidade por biotina
irá se ligar a outro conjugado por exemplo o hcg biotina ou seja dois conjugados diferentes são usados no sistema a antes de g conjugada a corante coloidal também é utilizada por antes coloidais eles são insolúveis em meio aquoso e formam manchas coloridas né formando as linhas na fase sólida onde são capturados te entendo o conjugado influenciado a conjugação de lente empregado e condições de armazenamento a quantidade ideal do conjugado no teste deve ser determinada para cada lote e cada sistema de ensaio sobre a ação enzimática o substrato cromogênico se originam produtos coloridos solúveis ou insolúveis
cuja classificação é feita pela medida da densidade óptica da solução em espectrofotômetro ou pela intensidade de cor visual ou comparado a algum padrão de referência o substrato utilizado para enzimas peroxidase é a água oxigenada que pode ser empregada com diversos cromógenos ou doadores de hidrogênio a concentração de água oxigenada é uma variado crítica no teste devido à estabilidade limitada por outro lado a peroxidase é inibida na presença de excesso de água oxigenada para a enzima fosfatase alcalina o substrato cromogênico solúvel é o p-nitrofenilfosfato npp e para obtenção de produto e é utilizado cinco bromo 4-cloro
três e do livro fosfato bcp e nitroblue tetrazólio nvt substrato fluorogênico são utilizados após a ação da enzima formar um composto que emite luz fluorescente o substrato que inocente é utilizado para ensaios imunoenzimáticos que necessitam de amplificação do sinal ea determinação de hormônios como os marcadores tumorais o elisa pode ser de quatro tipos direto e indireto captura o sanduíche e elisa de competição como funciona o elisa direto o antígeno ele adicionado a placa em seguida acrescentando o anticorpo primário marcado com uma enzima passaram processo de incubação é feita a lavagem para retirar o excesso de
anticorpo marcado com enzima e depois acrescentando um cromógeno né adição do substrato cromogênico que vai revelar a cor que vai ser feita a leitura do teste e interpretado e o eles indireto é feita a determinação de anticorpo usa-se para detecção de anticorpos de classes determinadas de acordo com atingindo que sensibilizou a placa o anticorpo marcado liga-se ao complexo antígeno-anticorpo então aqui eu tenho antígenos fixados em contato com o anticorpo né do paciente é feita a ligação antígeno-anticorpo depois acrescentando o anticorpo do kit marcado com enzima que vai capturar esse anticorpo do paciente que já está
ligado a essa placa e aí depois vá acrescentando o substrato e é feita a revelação da cor no elisa de captura o anticorpo ele vai estar fixado na placa é acrescentado então amostra do paciente que contém o antígeno esse antígeno do paciente e se liga nesse ano tipo esse nesse anticorpo fixado na placa é feito um processo de lavagem para remoção do excesso de antígenos de amostra depois é utilizado um anticorpo marcado com enzima para e essa ligação antígeno-anticorpo aqui depois de um período de incubação processo de lavagem para retirada do excesso de anticorpo é
acrescentado então substrato que vai consumir essa enzima e ao consumir usa cima gerado então a cor e é feita a leitura através do aparelho da leitora de elisa aqui é outro exemplo de elisa de captura só que nesse exemplo é capturado outro anticorpo então aqui ó eu tenho um método de captura por exemplo para gm em que eu tenho um anticorpo anti e gm fixado na placa é então apresentada a mostra que contém esse gm esse anticorpo antígeno e captura esse gm depois é acrescentado um antígeno do kit para se ligar a esse e gm
após ter feito sua ligação antígeno-anticorpo é acrescentado um anticorpo do kit que reconhece esse antígeno e esse anticorpo aqui do kit está marcado com um em cima depois de a o substrato cromogênico que vai consumir és enzima levar a mudança de cor que vai ser lida pelo aparelho então também é outro tipo de exemplo de elisa de captura e por fim tem a lista de o elisa de competição para antígeno né que também é utilizado sua determinação é de antígenos e utiliza-se antígenos marcados e amostra do paciente que pode ou não ter esses antígenos então
aqui eu tenho um anticorpo fixado na placa que reconhece o antígeno para essa reação por ser de competição o antígeno marcado do kit coenzima vai competir com o antígeno do paciente lembra muito aquelas aqueles procedimentos de radioimunoensaio para quem não viu dá uma olhadinha que é muito semelhante o estilo de competição que acontece também o rádio nem sabe o que que a diferença é que a gente tem uma enzima marcando o antígeno e não é um radioisótopo nesse exemplo utilizado tanto antígeno marcado com a em cima como antígeno do paciente o prefeito um processo de
incubação de lavagem o anticorpo fixado na placa vai se ligar esse antígeno então se houver o antígeno do paciente ele vai se ligar no antígeno do paciente caso não haja esse antígeno presente na amostra do paciente quando eu passar para fase de colocar o antígeno do kit né que primeiro a gente coloca o do paciente é feito incubação depois é feito uma lavagem para retirar o excesso depois é colocado o antígeno do ritmo marcado com a enzima esse antígeno do kit caso o antígeno da moça não tem esse ligado é ele que vai se ligar
nesse anticorpo fixado aqui por isso que é por competição que eles competem pelo sítio ativo do anticorpo depois acrescentando um substrato que vai consumir essa enzima revelando então a cor e aí sim a gente pode observar o resultado aqui outro exemplo nesse exemplo aqui não é a competição pelo antígeno a opção pela de corpo então pode ser feita a determinação de anticorpo a vantagem que utiliza o único conjugados para vários sistemas e também a pode ser feita a detecção de anticorpos de classes determinadas de acordo com o antígeno que sensibilizou a placa então você ao
invés eu sensibilizar a placa quante corpo eu vou sensibilizar com o antígeno vou acrescentar tanto uma de corpo presente na amostra do paciente quanto anticorpo marcado do kit com a enzima esses anticorpos eles vão competir pela ligação com o antígeno depois é feito a adicionado um cromógeno é que vai ser feita a revelação da cor quanto maior for a intensidade da cor menor a concentração de anticorpos presentes do paciente por que significa que o que se ligou ao antígeno da placa era o anticorpo do kit que é o que tá marcado com o cronológico quanto
menor a intensidade de cor maior é a concentração do anticorpo do paciente porque se anticorpo do paciente ele o mercado com em cima então quando eu acrescentar o substrato que vai consumir em cima não vai ter enzima para ser consumida que tem muita amostra do paciente então tem essa relação também aqui é um vídeo mostrando um pouquinho de como que é o elisa direto e o elisa de sanduíche então nesse exemplo nós temos anticorpos fixados em fase sólida é acrescentada amostra do paciente que tem antígeno esse antígeno então ele é reconhecido por esse anticorpo de
fase sólida e depois eu acrescento o anticorpo do kit marcado com uma enzima vai reconhecer esse antígeno também depois eu acrescento um substrato que vai consumir essa enzima ó e vai então levar a diferença de cor mudança de cor uma outra maneira de isso acontecer eu acrescentar tanto a lost do paciente quanto o anticorpo marcado uma enzima isso também pode ser feito ao mesmo tempo e aí depois eu acrescento então substrato que vai consumir essa em cima e aí gerar por fazer a revelação da cruz o resultado então ele é virtual qualitativo também por densidade
óptica onde é feita a quantificação é utilizado uma leitora de elisa para avaliar o resultado é preciso levar em consideração ponto de corte né o linear de reatividade então toda vez que for utilizar um kit novo é feito essa padronização toda vez que for por ser feito um procedimento essa toffee e também é a questão da titulação em que as amostras elas também sofrem uma diminuição em série para poder avaliar o resultado essa parte de interpretação da elisa vai a próxima ao em que eu vou explicar exatamente como é feito com a top o cálculo
do católico cada kit ele tem o seu ponto de corte mas eu vou fazer um exemplo para vocês inclusive também um exemplo utilizando a diluição em série para poder liberar esse resultado hoje em dia os aparelhos são todos automatizados então isso é feito de uma maneira muito prática e rápida mas alguns aparelhos ainda precisam desse cálculo manual então eu vou ver se eu trago à ou para vocês para explicar como é feita essas então né a gente tem aí um exemplo de lavadora de microplacas porque durante o procedimento é feita a lavagem várias vezes também
tem a leitora de microplaca acoplada ao computador ou não e a leitura de eliza e a gente pode ainda disposto que prestadores automáticas para microplacas né mas geralmente o que a gente tem no laboratório essa leitora de elisa mesmo e você tem que lavar manualmente você tem que peta e assim então são as nossas referências ficamos
